一种在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，属于可再生能源和生物质能源以及化工原料生产领域。该方法是将丙二酰辅酶A还原酶、丙二酸半醛还原酶、3-羟基丙酰辅酶A合成酶、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶和丙烯酰辅酶A还原酶基因中的一种或多种在生物中表达，通过固定二氧化碳以生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸。本发明实现了改造微生物直接利用二氧化碳合成3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸，不需利用石油资源来进行化学合成，减少了对石油的消耗和环境的污染，是一种可再生的、低消耗、环保的技术，可缓解当前的温室效应。通过微生物固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸可直接应用于工业生产。
【专利说明】一种在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于可再生能源和生物质能源以及化工原料生产领域，具体涉及一种在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法。
【背景技术】
[0003]生物界中几乎所有的自养生物都是通过固碳过程得到所需的碳源，大气中的二氧化碳的固定至关重要，被认为是地球上最重要的生命过程之一。目前已经发现的固定二氧化碳的途径有:卡尔文循环，还原柠檬酸循环，还原乙酰辅酶A循环和3-羟基丙酸循环，2007年，Georg Fuchs课题组在古生菌sedula中发现了第五种二氧化碳固定方式:3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环(Berg I A, Kockelkorn D, Buckel ff, et al.A3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate autotrophic carbon dioxide assimilationpathway in Archaea.Science, 2007, 318(5857): 1782-1786.)，其特点是经过一个循环固定二分子二氧化碳形成一份子乙酰辅酶A，循环中存在3-羟基丙酸和4-羟基丁酸中间代谢物，故称为3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环。
[0004]3-羟基丙酸具有羟基和羧基两个官能团，是很多光学活性物质的前体，是一种重要的化工平台产品。2004年美国能源部将其列为当今世界12种最具潜力的化工产品之一。丙烯酸是重要的有机合成原料及合成树脂单体，是聚合速度非常快的乙烯类单体，其聚合物用于合成树脂 、胶黏剂、合成橡胶、合成纤维、高吸水性树脂、制药、建材、石油开采、涂料等工业部门。同时，丙烯酸是水溶性聚合物的重要原料之一，与淀粉共聚可制得超强性吸水剂。丙酸主要用途为:用作酯化剂、硝酸纤维素的溶剂、增塑剂、化学试剂盒配制食品原料等。丙酸的防真菌和霉菌效果在PH值6以下时优于苯甲酸，价格低于山梨酸，是理想的食品防腐剂之一，因而作为食品防腐剂在我国具有巨大的潜在市场。丙酸可以用于生产丙酰胺，进而生产部分除草剂品种。在医药行业，丙酸的主要衍生物有维生素B6、萘普生、脑脉宁等。丙酸还可以制作成香料，用于食品、化妆品、肥皂的香料。另外，还在可以用丙酸来制取可生物降解塑料等。目前，3-羟基丙酸，丙烯酸和丙酸主要是通过化学法合成，但是，目前的化学合成法不但成本高，还会造成环境污染，消耗珍贵的石油资源。
[0005]目前工业上已经有许多利用微生物生产发酵获得产品的成功实例。通过微生物固定二氧化碳来生产3-羟基丙酸，丙烯酸和丙酸具有重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法。
[0007]本发明的目的还在于提供一种生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的的微生物。[0008]本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，包括如下步骤:将编码如下功能蛋白的基因中的至少一种转入微生物体内:丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体、丙二酸半醛还原酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体以及丙烯酰辅酶A还原酶或其功能等同体，使微生物能够表达相应的功能蛋白。所述的丙二酰辅酶A还原酶可将丙二酰辅酶A转变为丙二酸半醛，丙二酸半醛还原酶可将丙二酸半醛转变为3-羟基丙酸，3-羟基丙酰辅酶A合成酶可将3-羟基丙酸转变为3-羟基丙酰辅酶A，3-羟基丙酰辅酶A脱水酶可将3-羟基丙酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A，丙烯酰辅酶A还原酶可将丙烯酰辅酶A转化为丙酰辅酶A。
[0009]优选的，将编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体和丙二酸半醛还原酶或其功能等同体的基因中的至少一种转入微生物体内可生产3-羟基丙酸；
将编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体、丙二酸半醛还原酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体以及3-羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体的基因中的至少一种转入微生物体内可生产丙烯酸；
将编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体、丙二酸半醛还原酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体以及丙烯酰辅酶A还原酶或其功能等同体的基因的至少一种转入微生物体内可生产丙酸。
[0010]优选的，所述的丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体为:1)SEQ ID N0.1所示氨基酸序列组成的蛋白；或，2) SEQ ID N0.1所示氨基酸插入、取代和/或增加一个或几个氨基酸组成的与其具有同 等功能的蛋白；丙二酸半醛还原酶或其功能等同体为:1)SEQ ID N0.2所示氨基酸序列组成的蛋白；或，2) SEQ ID N0.2所示氨基酸插入、取代和/或增加一个或几个氨基酸组成的与其具有同等功能的蛋白；3_羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体为:1)SEQ ID N0.3所示氨基酸序列组成的蛋白；或，2)SEQ ID N0.3所示氨基酸插入、取代和/或增加一个或几个氨基酸组成的与其具有同等功能的蛋白；3_羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体为:1)SEQ ID N0.4所示氨基酸序列组成的蛋白；*,2)SEQ ID N0.4所示氨基酸插入、取代和/或增加一个或几个氨基酸组成的与其具有同等功能的蛋白；丙烯酰辅酶A还原酶或其功能等同体为:1)SEQ ID N0.5所示氨基酸序列组成的蛋白；或，2) SEQID N0.5所示氨基酸插入、取代和/或增加一个或几个氨基酸组成的与其具有同等功能的蛋白。
[0011]更优选的，所述的丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体、丙二酸半醛还原酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体以及丙烯酰辅酶A还原酶或其功能等同体的编码基因为Metallosphaera sedulaMsed_0709、Msed_1993、Msed_1456、Msed_2001 以及 Msed_1426 基因。
[0012]所述的微生物包括为原核微生物或真核微生物中的至少一种(可以是自养微生物也可以是异养微生物)；优选的，所述的微生物为选自细菌、真菌、藻类、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种；更优选的，所述的微生物为酵母或大肠杆菌。
[0013]所述的基因的表达方式为通过诱导或自主表达。
[0014]所述的二氧化碳包括环境中的或者微生物代谢产生的。[0015]此外，所述的方法还包括通过:根据微生物密码子的偏爱性对编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体、丙二酸半醛还原酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体以及丙烯酰辅酶A还原酶或其功能等同体的基因中至少一种进行优化以提高3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的的产量；或改造微生物的代谢途径使以提高乙酰辅酶A和/或丙二酰辅酶A的量以提高3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的产量，如:敲除消耗乙酰辅酶A的其他途径以提高乙酰辅酶A的量，过量表达乙酰辅酶A羧化酶以提高丙二酰辅酶A的量。
[0016]一种生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的微生物，包含有编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体、丙二酸半醛还原酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体以及丙烯酰辅酶A还原酶或其功能等同体的基因中的至少一种。
[0017]所述的基因通过克隆于载体上，再转化到微生物内表达。
[0018]所述的微生物可过量表达乙酰辅酶A和/或丙二酰辅酶A。
[0019]本发明的优点是在微生物中引入外源基因以实现固定二氧化碳来生产3-羟基丙酸，丙烯酸和丙酸的目的，不需利用石油资源来进行化学合成，减少了对珍贵石油资源的消耗，减少了对环境的污染，更重要的是利用二氧化碳来生产化学品，真正实现了可持续发展，另一方面可以大大缓解温室效益，对人类生活质量具有重要的意义。同时，由于绝大数微生物生长速度快，易于改造，不受天气季节等影响，可以实现连续生产。本发明表面改造微生物固定二氧化碳来进行工业生产是切实可行的。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为质粒pYWl的示意图，Msed_0709基因通过其两端的和&oRI限制性内切酶位点克隆于pER28a质`粒上。
[0021]图2为质粒pYW2的示意图，Msed_1456基因通过其两端的和&oRI限制性内切酶位点克隆于pER28a质粒上。
[0022]图3为质粒pYW3的示意图，Msed_2001基因通过其两端的和&oRI限制性内切酶位点克隆于pER28a质粒上。
[0023]图4为质粒pYW4的示意图，Msed_1993基因通过其两端的和历限制性内切酶位点克隆于pER28a质粒上。
[0024]图5为质粒pYW5的示意图，Msed_1426基因通过其两端的和&oRI限制性内切酶位点克隆于pER28a质粒上。
[0025]图6为质粒pYW6的示意图，将质粒pYW2上的Msed_1456基因片段酶切下来后连接在pYWl上Msed_0709基因后端，同时表达Msed_1456和Msed_0709基因。
[0026]图7为质粒pYW7的示意图，将质粒pYW3上的Msed_2001基因片段酶切下来后连接在 pYW2 上 Msed_1456 基因后端，同时表达 Msed_1456、Msed_0709 和 Msed_2001 基因。
[0027]图8为质粒pZL31的示意图，将质粒pYW4上的Msed_1993基因片段酶切下来后连接在pYWl上Msed_0709基因后端，同时表达Msed_1993和Msed_0709基因。
[0028]图9为质粒pZL32的示意图，将质粒pYW4上的Msed_1993基因片段酶切下来后连接在 PYW7 上 Msed_2001 基因后端，同时表达 Msed_1993、Msed_1456、Msed_0709 和Msed_2001 基因。
[0029]图10为质粒pZL33的示意图，将质粒pYW5上的Msed_1426基因片段酶切下来后连接在 PYW7 上 Msed_2001 基因后端，同时表达 Msed_1426、Msed_1456、Msed_0709 和Msed_2001 基因。
[0030]图11为质粒pZL34的示意图，将质粒pYW4上的Msed_1993基因片段酶切下来后连接在PZL33 上Msed_1426 基因后端，同时表达Msed_1993、Msed_1426、Msed_1456、Msed_0709和 Msed_2001 基因。
[0031]图12为质粒pDGOOl的示意图，将酿酒酵母双基因共表达载体pESC_URA上的诱导型启动子GALl和GALlO分别替换成组成型启动子TEFl和HXT7。
[0032]图13为质粒pZL35的示意图，将Msed_1993基因克隆于pDGOOl质粒上。
[0033]图14为质粒pZL36的示意图，将Msed_0709基因克隆在pZL35质粒上，同时表达Msed_1993 和 Msed_0709 基因。
[0034]图15为在大肠杆菌中共表达PZL31和pMSD8质粒，发酵提取产物后用气相色谱质谱联用仪鉴定有3-羟基丙酸产生的图。
[0035]图16为在大肠杆菌中共表达PZL32和pMSD8质粒，发酵提取产物后用气相色谱质谱联用仪鉴定有丙烯酸产生的图。
[0036]图17为在大肠杆菌中共表达PZL34和pMSD8质粒，发酵提取产物后用气相色谱质谱联用仪鉴定有丙酸产生的图。
[0037]图18为在酿酒酵母中表达PZL36质粒，发酵提取产物后用气相色谱质谱联用仪鉴定有3-羟基丙酸产生的图。
【具体实施方式】
[0038]本发明的目的通过以下措施来达到:
在微生物体内引入外源基因一丙二酰辅酶A还原酶基因和丙二酸半醛还原酶基因，从而催化自身的丙二酰辅酶A得到3-羟基丙酸。
[0039]在微生物体内引入外源基因一丙二酰辅酶A还原酶基因，丙二酸半醛还原酶基因，3-羟基丙酰辅酶A合成酶基因和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因，从而催化自身的丙二酰辅酶A得到丙烯酸。
[0040]在微生物体内引入外源基因一丙二酰辅酶A还原酶基因，丙二酸半醛还原酶基因，3-羟基丙酰辅酶A合成酶基因，3-羟基丙酰辅酶A脱水酶基因和丙烯酰辅酶A还原酶基因，从而催化自身的丙二酰辅酶A得到丙酸。
[0041]以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。
[0042]实施例中选用一种大肠杆菌BL21 (DE3)作为生产菌株，选取其表达载体pET28a。同时，选用一种尿嘧啶缺陷型酿酒酵母CEN.PK2-1C，同时选取其表达双基因共表达载体pESC-URA,并将其两个启动子均改造成组成型。
[0043]将编码M?ta』JospAaera seWa丙二酰辅酶A还原酶、3_羟基丙酰辅酶A合成酶、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶、丙二酸半醛还原酶和丙烯酰辅酶A还原酶的基因Msed_0709、Msed_1456、Msed_2001、Msed_1993 和 Msed_1426 (GenBank: CP000682.1)分别构建到表达载体pET28a上得到质粒pYWl、pYW2、pYW3、pYW4和pYW5，质粒示意图见附图1_5。[0044]认Metallosphaera的基因组为模板,通过使用如下引物PCR扩增各基因片段，加下划线的是酶切位点:
【权利要求】
1.一种在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于包括如下步骤:将编码如下功能蛋白的基因中的至少一种转入微生物体内:丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体、丙二酸半醛还原酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体以及丙烯酰辅酶A还原酶或其功能等同体，使微生物能够表达相应的功能蛋白。
2.根据权利要求1所述的在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于: 将编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体和丙二酸半醛还原酶或其功能等同体的基因中的至少一种转入微生物体内可生产3-羟基丙酸； 或将编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体、丙二酸半醛还原酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体以及3-羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体的基因中的至少一种转入微生物体内可生产丙烯酸； 或将编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体、丙二酸半醛还原酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体以及丙烯酰辅酶A还原酶或其功能等同体的基因的至少一种转入微生物体内可生产丙酸。
3.根据权利要求1所述的在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于:所述的编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体、丙二酸半醛还原酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体以及丙烯酰辅酶A还原酶或其功能等同体的基因为sedulaMsed_0709、Msed_1993、Msed_1456、Msed_2001 以及 Msed_1426 基因。
4.根据权利要求1所述的在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于:所述的 微生物为原核微生物或真核微生物中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于:所述的基因的表达方式为通过诱导或自主表达。
6.根据权利要求1所述的在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于:所述的二氧化碳包括环境中的或者微生物代谢产生的。
7.根据权利要求1所述的在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于: 通过提高微生物体内乙酰辅酶A和/丙二酰辅酶A的量以提高3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的产量； 或根据微生物密码子的偏爱性对编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体、丙二酸半醛还原酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体以及丙烯酰辅酶A还原酶或其功能等同体的基因中至少一种进行优化以提高3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的的产量。
8.—种生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的微生物，其特征在于:包含有编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等同体、丙二酸半醛还原酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A合成酶或其功能等同体、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶或其功能等同体以及丙烯酰辅酶A还原酶或其功能等同体的基因中的至少一种。
9.根据权利要求8所述 的生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的微生物，其特征在于:所述的基因通过克隆于载体上，再转化到微生物内表达。
10.根据权利要求8所述的生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的微生物，其特征在于:所述的微生物可过量表达乙酰辅酶A和/或丙二酰辅酶A。
【文档编号】C12N1/19GK103805641SQ201410035584
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】刘天罡, 柳志杰, 王艺璇, 邓子新 申请人:武汉大学