抑制运甲状腺素蛋白表达的组合物和方法

抑制运甲状腺素蛋白表达的组合物和方法
【专利摘要】本发明涉及靶向运甲状腺素蛋白(TTR)基因的双链核糖核酸(dsRNA)，以及用所述dsRNA抑制TTR表达的方法。
【专利说明】抑制运甲状腺素蛋白表达的组合物和方法
[0001]本申请是申请日为2009年10月20日和发明名称为“抑制运甲状腺素蛋白表达的组合物和方法”的200980141740.4号发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及靶向运甲状腺素蛋白(TTR)基因的双链核糖核酸(dsRNA)，以及使用dsRNA抑制TTR表达的方法。
[0003]相关申请的交叉引用
[0004]本申请要求2008年10月20日提交的序号为61 / 106，956的美国临时申请、2008年11月18日提交的序号为61 / 115，738的美国临时申请、2009年3月2日提交的序号为61 / 156,670的美国临 时申请、2009年6月9日提交的序号为61 / 185，545的美国临时申请、2009年9月15日提交的序号为61 / 242，783的美国临时申请和2009年9月22日提交的序号为61 / 244，794的美国临时申请的权益，为所有目的，所有这些申请以引用方式全部合并于此。
[0005]序列表参考
[0006]本申请包括以名为16126PCT_Sequence_Listing、在2009年创建、大小为346，516字节的文本文件电子提交的序列表，该序列表以引用方式合并于此。
【背景技术】
[0007]运甲状腺素蛋白(TTR)是一种分泌的甲状腺激素-结合蛋白。TTR结合并转运视黄醇结合蛋白(RBP) /维生素A及血浆和脑脊液中的血清甲状腺素(T4)。
[0008]正常序列TTR和变异序列TTR均引起淀粉样变性。正常序列TTR在老年人中引起心脏性淀粉样变性，称为老年性系统性淀粉样变性(SSA)(也称为老年性心脏性淀粉样变性(SCA))。SSA通常伴有许多其他器官中的微小沉淀。TTR突变加速TTR淀粉体形成过程，并且是发展临床上重要的TTR淀粉样变性(也称为ATTR(淀粉样变性-运甲状腺素蛋白型))的最重要的危险因素。已知超过85种淀粉样蛋白形成TTR变体引起系统性家族性淀粉样变性。肝脏是TTR表达的主要位置。其他重要的表达位置包括脉络丛、视网膜和胰腺。
[0009]TTR淀粉样变性表现为多种形式。当更多地影响周围神经系统时，该疾病称为家族性的淀粉样变性多神经病(FAP)。当主要涉及心脏而不是神经系统时，该疾病称为家族性淀粉样变性心肌病(FAC)。第三种主要类型的TTR淀粉样变性称为软脑膜/ CNS (中枢神经系统)淀粉样变性。
[0010]已显示双链RNA分子(dsRNA)以称为RNA干扰(RNAi)的高度保守调节机制阻断基因表达。W099 / 32619 (Fire等)公开了利用长度为至少25个核苷酸的dsRNA抑制秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的基因表达。也显示dsRNA降解其他有机体中的靶标RNA，所述其他有机体包括植物(例如参见W099 / 53050，Waterhouse等；以及W099 / 61631, Heifetz等)、果蝇(例如参见Yang，D.，等Curr.Biol.(2000) 10 =1191-1200)和哺乳动物(参见WOOO / 44895, Limmer ;和 DEIOIOO586.5, Kreutzer 等)。
[0011]U.S.20070207974 公开了功能性和超功能性 siRNA。U.S.20090082300 公开了针对TTR的反义分子。U.S.专利N0.7，250, 496公开了针对TTR的微RNA。
[0012]发明简述
[0013]在一个实施方式中，本发明提供用于抑制运甲状腺素蛋白(TTR)表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有义链和反义链，所述反义链含有与编码运甲状腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互补的区域，其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸，所述反义链含有 SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:450、SEQ ID NO:730 或 SEQ ID NO:1010 的 15 或更多个连续核苷酸。在一个相关实施方式中，所述有义链含有SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:449,SEQ ID NO:729或SEQ ID NO: 1009的15或更多个连续核苷酸。在另一个相关实施方式中，所述有义链由SEQ ID NO:449组成，所述反义链由SEQ ID NO:450组成。在又一个相关实施方式中，所述有义链由SEQ ID NO:729组成，所述反义链由SEQ ID NO:730组成。在另一个相关实施方式中，所述有义链由SEQ ID NO:1009组成，所述反义链由SEQ ID NO:1010组成。在又一个相关实施方式中，所述dsRNA含有选自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有义链和选自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反义链。
[0014]在某些实施方式中，dsRNA的反义链与编码运甲状腺素蛋白的mRNA之间的互补区域的长度是19个核苷酸。在另一个实施方式中，互补区域由SEQ ID NO:169组成。在其他实施方式中，dsRNA的各链的长度是19、20、21、22、23或24个核苷酸。在又一个实施方式中，各链的长度是21个核苷酸。
[0015]在某些实施方式中，用于抑制运甲状腺素蛋白表达的dsRNA不在SEQ ID NO:1331的位置637上的腺嘌呤 核苷酸与SEQ ID NO:1331的位置638上的鸟嘌呤核苷酸之间切割TTR mRNA。在其他实施方式中，dsRNA在SEQ ID NO:1331的位置636上的鸟嘌呤核苷酸与SEQ ID NO:1331的位置637上的腺嘌呤核苷酸之间切割TTR mRNA。在某些实施方式中，dsRNA与SEQ ID NO:1331的位置628上的鸟嘌呤核苷酸和SEQ ID NO:1331的位置646上的尿嘧啶核苷酸之间的TTR mRNA退火。
[0016]在其它相关实施方式中，本发明提供用于抑制运甲状腺素蛋白表达的上述dsRNA，其中所述dsRNA含有一个或多个修饰核苷酸。在相关实施方式中，至少一个修饰核苷酸(或多个核苷酸)选自下组:2' -O-甲基修饰核苷酸、含有5'-硫代磷酸基团的核苷酸、以及与胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸基酰胺基相连的末端核苷酸。在另一相关实施方式中，所述修饰核苷酸选自下组:2'-脱氧-2'-氟代修饰核苷酸、2'-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基-修饰核苷酸、2'-烷基-修饰核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、和含有非天然碱基的核苷酸。在某些实施方式中，所述dsRNA含有至少一个W -O-甲基修饰核苷酸。
[0017]在其他实施方式中，用于抑制运甲状腺素蛋白表达的上述dsRNA与配体偶联，或配制在脂质制剂中。在某些实施方式中，所述脂质制剂可以是LNP制剂、LNPOl制剂、XTC-SNALP制剂或SNALP制剂。在相关实施方式中，XTC-SNALP制剂如下:以比例为57.1 /7.1 / 34.4 / 1.4 的 XTC / DPPC / 胆固醇 / PEG-cDMA 使用 2，2- 二亚油基 _4_ 二甲基氨基乙基-[I，3]- 二氧戍环(2, 2-Dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[l, 3]-dioxolane)(XTC)以及比例约为7的脂质:siRNA。在另一个相关实施方式中，所述dsRNA的有义链由SEQ ID NO:1009组成且反义链由SEQ ID NO: 1010组成，所述dsRNA配制成如下XTC-SNALP制剂:以比例为 57.1 / 7.1 / 34.4 / 1.4 的 XTC / DPPC / 胆固醇 / PEG-cDMA 使用 2，
2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[I，3]-二氧戊环(XTC)以及比例约为7的脂质:siRNA。或者，上述dsRNA可配制成如下LNP09制剂:使用比例为50 / 10 / 38.5 / 1.5mol%的XTC / DSPC /胆固醇/ PEG2000-CH以及比例约为11: I的脂质:siRNA。在另一种变形中，所述dsRNA配制成如下LNPll制剂:使用比例为50 / 10 / 38.5 / 1.5mol%的MC3 /DSPC /胆固醇/ PEG2000-CH以及比例约为11: I的脂质:siRNA。在又一个实施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制剂或LNPll制剂，并且相对于PBS对照组，在0.3mg / kg的剂量时降低TTR mRNA水平约85到90%。在又一个实施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制剂或LNPll制剂，并且相对于PBS对照组，在0.1mg / kg的剂量时降低TTR mRNA水平约50%。在又一个实施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制剂或LNPll制剂，并且通过蛋白质印迹测定，相对于PBS对照组以剂量依赖性方式降低TTR蛋白水平。在又一个实施方式中，所述dsRNA配制成如下SNALP制剂:以比例为57.1 / 7.1 / 34.4 / 1.4的DLinDMA /DPPC /胆固醇/ PEG2000-CDMA使用DLinDMA以及比例约为7的脂质:siRNA。[0018]在某些实施方式中，本发明提供用于抑制运甲状腺素蛋白表达的上述dsRNA，其中施用dsRNA至细胞导致通过实时PCR试验测得的约95%的TTR mRNA表达的抑制，其中所述细胞是HepG2细胞或Hep3B细胞，且其中dsRNA的浓度是ΙΟηΜ。在相关实施方式中，施用dsRNA至细胞导致通过分支DNA试验测得的约74%的TTR mRNA表达的抑制，其中所述细胞是H印G2细胞或H印3B细胞，且其中dsRNA的浓度是ΙΟηΜ。在其他相关实施方式中，dsRNA在H印G2细胞中的IC50小于ΙΟρΜ，其中dsRNA的浓度是ΙΟηΜ。在其他相关实施方式中，dsRNA的ED50约为Img / kg。在其他相关实施方式中，施用dsRNA能降低食蟹猴肝脏中的TTR mRNA约80%，其中dsRNA的浓度是3mg / kg。在其他相关实施方式中，通过IFN-α和TNF-a ELISA试验测定，施用dsRNA不导致人外周血单核细胞(PBMC)的免疫刺激活性。在其他相关实施方式中，施用dsRNA降低肝脏TTR mRNA水平约97%或血清TTR蛋白水平约90%，其中dsRNA的浓度是6mg / kg。在其他相关实施方式中，施用dsRNA降低肝脏TTRmRNA水平或血清TTR蛋白水平直到22天,其中dsRNA的浓度是6mg / kg或3mg / kg。在其他相关实施方式中，当以Img / kg或3mg / kg施用于需要治疗的受试者时,dsRNA抑制血清TTR蛋白水平直到治疗后第14天。在其他相关实施方式中，通过实时PCR测定，浓度为0.1nM的dsRNA使Hep3B细胞中的TTR表达降低98.9%。在其他相关实施方式中，通过实时PCR测定，浓度为IOnM的dsRNA使!fep3B细胞中的TTR表达降低99.4%。
[0019]在其他实施方式中，本发明提供用于抑制运甲状腺素蛋白(TTR)表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有义链和反义链，所述反义链含有与编码运甲状腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互补的区域，其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸，且其中所述dsRNA含有选自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有义链和选自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反义链。
[0020]在另一个实施方式中，本发明提供用于抑制运甲状腺素蛋白(TTR)表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有反义链，所述反义链含有与SEQ ID NO:1331的核苷酸618-648的15-30个核苷酸互补的区域，且其中所述反义链与SEQ ID NO:1331的位置628上的鸟嘌呤碱基配对。[0021]在某些实施方式中，本发明提供含有以上简述中所述任何dsRNA的细胞。在某些其他实施方式中，本发明提供含有编码以上简述中所述任何dsRNA的至少一条链的核苷酸序列的载体。在某些实施方式中，该载体处于细胞中。
[0022]在其他实施方式中，本发明提供用于抑制TTR基因表达的药物组合物，其含有以上简述中描述的任何dsRNA和药学可接受的载体。在相关实施方式中，本发明提供用于抑制TTR基因表达的药物组合物，其含有dsRNA和SNALP制剂，其中所述dsRNA包含长度小于30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:450、SEQ ID NO:730或SEQ ID NO:1010的15或更多个连续核苷酸，且其中所述SNALP制剂包含各自比例为 57.1 / 7.1 / 34.4 / 1.4 的 DlinDMA、DPPC、胆固醇和 PEG2000_cDMA。
[0023]在又一个实施方式中，本发明提供抑制细胞中TTR表达的方法，所述方法包括:
(a)使细胞与以上简述中描述的任何dsRNA接触；和(b)将步骤(a)得到的细胞保持足以获得TTR基因的mRNA转录物降解的时间，从而抑制细胞中TTR基因的表达。
[0024]在又一个实施方式中，本发明提供由TTR表达介导的疾病的治疗方法，包括将治疗有效量的上述简述中描述的任何dsRNA施用于需要这种治疗的人。在相关实施方式中，所述dsRNA以约0.01、0.1、0.5、1.0、2.5或5.0mg / kg施用于人。在又一个相关实施方式中，所述dsRNA以约1.0mg / kg施用于人。在又一个相关实施方式中，所治疗的人患有运甲状腺素蛋白淀粉样变性和/或肝脏疾病。在相关实施方式中，给该人进一步提供肝脏移植。在又一个实施方式中，施用dsRNA能降低人类肝脏的TTR mRNA约80%，其中dsRNA的浓度是3mg / kg。在其他相关实施方式中，通过IFN-α和TNF-a ELISA试验测定，施用dsRNA不会导致人类的免疫刺激活性。在又一个相关实施方式中，施用dsRNA降低肝脏TTR mRNA水平约97%或血清TTR蛋白水平约90%，其中dsRNA的浓度是6mg / kg。在又一个相关实施方式中，施用dsRNA降低肝脏TTR mRNA水平和/或血清TTR蛋白水平直到22天，其中dsRNA的浓度是6mg / kg或3mg / kg。在又一个相关实施方式中，所述dsRNA配制成如下LNP09 制剂:使用比例为 50 / 10 / 38.5 / 1.5mol% 的 XTC / DSPC / 胆固醇 / PEG2000-CH以及比例约为11: I的脂质:siRNA。在又一个相关实施方式中，所述dsRNA配制成如下LNPll 制剂:使用比例为 50 / 10 / 38.5 / 1.5mol%的MC3 / DSPC / 胆固醇 / PEG2000-CH以及比例约为11: I的脂质:siRNA。在又一个实施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制剂或LNPll制剂，并且相对于PBC对照组，在0.3mg / kg的剂量时降低TTR mRNA水平约85到90%。在又一个实施方式中，所述dsRNA配制成在LNP09制剂或LNPll制剂，并且相对于PBC对照组，在0.1mg / kg的剂量时降低TTR mRNA水平约50%。在又一个实施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制剂或LNPll制剂，并且通过蛋白质印迹测定，相对于PBC对照组以剂量依赖性方式降低TTR蛋白水平。在另一个相关实施方式中，当以Img / kg或3mg /kg施用于人类时，dsRNA抑制血清TTR蛋白水平直到治疗后第14天。在又一个实施方式中，所述dsRNA配制成如下SNALP制剂:以比例为57.1 / 7.1 / 34.4 / 1.4的DLinDMA /DPPC /胆固醇/ PEG2000-CDM A使用DlinDMA以及比例约为7的脂质:siRNA。
[0025]在另一个实施方式中，本发明提供dsRNA在治疗由TTR表达介导的疾病中的用途，包括将治疗有效量的上述简述中描述的任何dsRNA施用于需要这种治疗的人。在相关实施方式中，所述dsRNA以约0.01、0.1、0.5、1.0、2.5或5.0mg / kg施用于人。在特别相关的实施方式中，所述dsRNA以约1.0mg / kg施用于人。在又一个相关实施方式中，所治疗的人患有运甲状腺素蛋白淀粉样变性和/或肝脏疾病。在本发明用途的又一个实施方式中，给所治疗的人进一步提供肝脏移植。
[0026]在又一个实施方式中，本发明提供dsRNA在抑制细胞中TTR表达的方法中的用途，所述方法包括:(a)使细胞与以上简述中描述的dsRNA接触；和(b)将步骤(a)得到的细胞保持足以获得TTR基因的mRNA转录物降解的时间，从而抑制细胞中TTR基因的表达。
[0027]具体地，本发明涉及以下各项:
[0028]1、用于抑制运甲状腺素蛋白(TTR)表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有义链和反义链，所述反义链含有与编码运甲状腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互补的区域，其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸，所述反义链含有SEQ ID NO:170、SEQID NO:450, SEQ ID NO:730 或 SEQ ID NO:1010 的 15 或更多个连续核苷酸。
[0029]2、第 I 项的 dsRNA，其中所述有义链含有 SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO:449、SEQ IDNO:729或SEQ ID NO:1009的15或更多个连续核苷酸。
[0030]3、第I项 的dsRNA，其中所述有义链由SEQ ID NO:449组成，所述反义链由SEQ IDNO:450 组成。
[0031]4、第I项的dsRNA，其中所述有义链由SEQ ID NO:729组成，所述反义链由SEQ IDNO:730 组成。
[0032]5、第I项的dsRNA，其中所述有义链由SEQ ID NO:1009组成，所述反义链由SEQID NO:1010 组成。
[0033]6、第I项的dsRNA，其中所述dsRNA含有选自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有义链和选自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反义链。
[0034]7、第I或2或6项的dsRNA，其中所述互补区域的长度是19个核苷酸。
[0035]8、第I或2或6项的dsRNA，其中所述互补区域由SEQ ID NO:169组成。
[0036]9、第I或2或6项的dsRNA，其中所述dsRNA的各链长度是19、20、21、22、23或24个核苷酸。
[0037]10、第I或2或6项的dsRNA，其中各链长度是21个核苷酸。
[0038]11、第 1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中所述dsRNA不在SEQ ID NO:1331 的位置637上的腺嘌呤核苷酸与SEQ ID NO:1331的位置638上的鸟嘌呤核苷酸之间切割TTR mRNA。
[0039]12、第 1、2、3、4、5 或 6 项的 dsRNA,其中所述 dsRNA 在 SEQ ID NO: 1331 的位置 636上的鸟嘌呤核苷酸与SEQ ID NO:1331的位置637上的腺嘌呤核苷酸之间切割TTR mRNA。
[0040]13、第 1、2、3、4、5 或 6 项的 dsRNA，其中所述 dsRNA 与 SEQ ID NO: 1331 的位置 628上的鸟嘌呤核苷酸和SEQ ID NO:1331的位置646上的尿嘧啶核苷酸之间的TTR mRNA退火。
[0041]14、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中所述dsRNA含有至少一个修饰核苷酸。
[0042]15、第14项的dsRNA，其中至少一个所述修饰核苷酸选自下组:2' -O-甲基修饰的核苷酸、含有5'-硫代磷酸基团的核苷酸、以及与胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸基酰胺基相连的末端核苷酸。
[0043]16、第14项的dsRNA，其中所述修饰核苷酸选自下组:2'-脱氧-2'-氟代修饰核苷酸、2'-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基-修饰核苷酸、2'-烷基-修饰核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、和含有非天然碱基的核苷酸。[0044]17、第14项的dsRNA，含有至少一个W -O-甲基修饰核苷酸。
[0045]18、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中所述dsRNA与配体偶联。
[0046]19、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中所述dsRNA配制在脂质制剂中。
[0047]20、第19项的dsRNA，其中所述dsRNA配制成LNP制剂、LNPOl制剂、XTC-SNALP制剂或SNALP制剂。
[0048]21、第19项的dsRNA，其中所述dsRNA配制成如下XTC-SNALP制剂:以比例为57.1 / 7.1 / 34.4 / 1.4 的 XTC / DPPC / 胆固醇 / PEG-cDMA 使用 2，2- 二亚油基 _4_ 二甲基氨基乙基_[1，3]_ 二氧戊环(XTC)以及比例约为7的脂质:siRNA。
[0049]22、第19项的dsRNA，其中所述有义链由SEQ ID NO:1009组成且所述反义链由SEQ ID NO:1010组成，所述dsRNA配制成如下XTC-SNALP制剂:以比例为57.1 / 7.1 /34.4 / 1.4的XTC / DPPC /胆固醇/ PEG-cDMA使用2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[I，3]-二氧戊环(XTC)以及比例约为7的脂质:siRNA。
[0050]23、第19项的dsRNA，其中所述dsRNA配制成如下LNP09制剂:使用比例为50 /10 / 38.5 / L5mol% 的 XTC / DSPC / 胆固醇 / PEG2000-CH 以及比例约为 11: I 的脂质:siRNA。
[0051]24、第19项的dsRNA，其中所述dsRNA配制成如下LNPll制剂:使用比例为50 /10 / 38.5 / 1.5mol% 的 MC3 / DSPC / 胆固醇 / PEG2000-CH 以及比例约为 11: I 的脂质:siRNA。 [0052]25、第19项的dsRNA，其中所述dsRNA配制成LNP09制剂或LNPll制剂，并且相对于PBS对照组，在0.3mg / kg的剂量时降低TTR mRNA水平约85到90%。
[0053]26、第19项的dsRNA，其中所述dsRNA配制成LNP09制剂或LNPll制剂，并且相对于PBS对照组，在0.1mg / kg的剂量时降低TTR mRNA水平约50%。
[0054]27、第19项的dsRNA，其中所述dsRNA配制成LNP09制剂或LNPll制剂，并且通过蛋白质印迹测定，相对于PBS对照组以剂量依赖性方式降低TTR蛋白水平。
[0055]28、第19项的dsRNA，其中所述dsRNA配制成如下SNALP制剂:以比例为57.1 /7.1 / 34.4 / 1.4 的 DLinDMA / DPPC / 胆固醇 / PEG2000-cDMA 使用 DLinDMA 以及比例约为7的脂质:siRNA。
[0056]29、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中施用所述dsRNA至细胞导致通过实时PCR试验测得的约95%的TTR mRNA表达抑制，其中所述细胞是H印G2细胞或Hep3B细胞，且其中dsRNA的浓度是ΙΟηΜ。
[0057]30、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中施用dsRNA至细胞导致通过分支DNA试验测得的约74%的TTR mRNA表达抑制，其中所述细胞是H印G2细胞或Hep3B细胞，且其中dsRNA的浓度是ΙΟηΜ。
[0058]31、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中所述dsRNA在！fepG2细胞中的IC50小于ΙΟρΜ，且其中dsRNA的浓度是ΙΟηΜ。
[0059]32、第 1、2、3、4、5 或 6 项的 dsRNA，其中所述 dsRNA 的 ED50 约为 Img / kg。
[0060]33、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中施用dsRNA降低食蟹猴肝脏中的TTR mRNA约80%,其中dsRNA的浓度是3mg / kg。
[0061]34、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中通过IFN-α和TNF-a ELISA试验测定，施用dsRNA不导致人外周血单核细胞(PBMC)中的免疫刺激活性。
[0062]35、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中施用dsRNA降低肝脏TTR mRNA水平约97%或血清TTR蛋白水平约90%，其中dsRNA的浓度是6mg / kg。
[0063]36、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中施用dsRNA降低肝脏TTR mRNA水平和/或血清TTR蛋白水平直到22天,其中dsRNA的浓度是6mg / kg或3mg / kg。
[0064]37、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA,其中当以Img / kg或3mg / kg施用于需要治疗的受试者时，dsRNA抑制血清TTR蛋白水平直到治疗后第14天。
[0065]38、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中通过实时PCR测定，浓度为0.1nM的dsRNA使!fep3B细胞中的TTR表达降低98.9%。
[0066]39、第1、2、3、4、5或6项的dsRNA，其中通过实时PCR测定，浓度为IOnM的dsRNA使!fep3B细胞中的TTR表达降低99.4%。
[0067]40、用于抑制运甲状腺素蛋白(TTR)表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有义链和反义链，所述反义链含有与编码运甲状腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互补的区域，其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸，且其中所述dsRNA含有选自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有义链和选自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反义链。
[0068]41、用于抑制运甲状腺素蛋白(TTR)表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有反义链，所述反义链含有与SEQ ID NO:1331的核苷酸618-648的15-30个核苷酸互补的区域，且其中所 述反义链与SEQ ID NO:1331的位置628上的鸟嘌呤碱基配对。
[0069]42、含有第1-41项的dsRNA的细胞。
[0070]43、含有编码第1-41项的dsRNA的至少一条链的核苷酸序列的载体。
[0071]44、含有第43项的载体的细胞。
[0072]45、用于抑制TTR基因表达的药物组合物，其含有第1_41项的dsRNA和药学可接受的载体。
[0073]46、用于抑制TTR基因表达的药物组合物，其含有dsRNA和SNALP制剂，其中所述dsRNA包含长度小于30个核苷酸的反义链，该反义链包含SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:450、SEQ ID NO:730或SEQ ID NO: 1010的15或更多个连续核苷酸，且其中所述SNALP制剂包含各自比例为 57.1 / 7.1 / 34.4 / 1.4 的 DlinDMA、DPPC、胆固醇和 PEG2000_cDMA。
[0074]47、抑制细胞中TTR表达的方法，所述方法包括:
[0075](a)使细胞与第1-41项的dsRNA接触；和
[0076](b)将步骤(a)得到的细胞保持足以获得TTR基因的mRNA转录物降解的时间，从而抑制细胞中TTR基因的表达。
[0077]48、治疗由TTR表达介导的疾病的方法，包括将治疗有效量的第1_41项的dsRNA施用于需要这种治疗的人。
[0078]49、第 48 项所述的方法，其中所述 dsRNA 以约 0.01、0.1、0.5、1.0、2.5 或 5.0mg /
kg施用于人。
[0079]50、第48-49项的方法，其中所述dsRNA以约1.0mg / kg施用于人。
[0080]51、第48-50项的方法，其中所述的人患有运甲状腺素蛋白淀粉样变性。
[0081]52、第48-51项的方法，其中所述的人患有肝脏疾病。
[0082]53、第48-52项的方法，其中所述的人还进行肝脏移植。[0083]54、第48-53项的方法，其中施用dsRNA降低人肝脏的TTR mRNA约80 %，其中dsRNA的浓度是3mg / kg。
[0084]55、第48-54项的方法，其中通过IFN- α和TNF- a ELISA试验测定，施用dsRNA不会导致人的免疫刺激活性。
[0085]56、第48-55项的方法，其中施用dsRNA降低肝脏TTR mRNA水平约97%或血清TTR蛋白水平约90%，其中dsRNA的浓度是6mg / kg。
[0086]57、第48-56项的方法，其中施用dsRNA降低肝脏TTR mRNA水平和/或血清TTR蛋白水平直到22天,其中dsRNA的浓度是6mg / kg或3mg / kg。
[0087]58、第48-57项的方法，其中所述dsRNA配制成如下LNP09制剂:使用比例为50 /10 / 38.5 / L5mol% 的 XTC / DSPC / 胆固醇 / PEG2000-CH 以及比例约为 11: I 的脂质:siRNA。
[0088]59、第48-58项的方法，其中所述dsRNA配制成如下LNPll制剂:使用比例为50 /10 / 38.5 / 1.5mol% 的 MC3 / DSPC / 胆固醇 / PEG2000-CH 以及比例约为 11: I 的脂质:siRNA。
[0089]60、第48-59项的方法，其中所述dsRNA配制成LNP09制剂或LNPll制剂，并且相对于PBC对照组，在 0.3mg / kg的剂量时降低TTR mRNA水平约85%到90%。
[0090]61、第48-60项的方法，其中所述dsRNA配制成LNP09制剂或LNPll制剂，并且相对于PBC对照组，在0.1mg / kg的剂量时降低TTRmRNA水平约50%。
[0091]62、第48-61项的方法，其中所述dsRNA配制成LNP09制剂或LNPll制剂，并且通过蛋白质印迹测定，相对于PBC对照组，其以剂量依赖性方式降低TTR蛋白水平。
[0092]63、第48-62项的方法,其中当以Img / kg或3mg / kg施用于人时，dsRNA抑制血清TTR蛋白水平直到治疗后第14天。
[0093]64、第48-63项的方法，其中所述dsRNA配制成如下SNALP制剂:以比例为57.1 /
7.1 / 34.4 / 1.4 的 DLinDMA / DPPC / 胆固醇 / PEG2000_cDMA 使用 DLinDMA 以及比例约为7的脂质:siRNA。
[0094]65、dsRNA在治疗由TTR表达介导的疾病中的应用，包括将治疗有效量的第1_41项的dsRNA施用于需要这种治疗的人。
[0095]66、第 65 项的应用，其中所述 dsRNA 以约 0.01、0.1、0.5、1.0、2.5 或 5.0mg / kg
施用于人。
[0096]67、第65-66项的应用，其中所述dsRNA以约1.0mg / kg施用于人。
[0097]68、第65-67项的应用，其中所述的人患有运甲状腺素蛋白淀粉样变性。
[0098]69、第65-68项的应用，其中所述的人患有肝脏疾病。
[0099]70、第65-69项的应用，其中所述人还进行肝脏移植。
[0100]71、dsRNA在抑制细胞中TTR表达中的应用，所述应用包括:
[0101](a)使细胞与第1-41项的dsRNA接触；和
[0102](b)将步骤(a)得到的细胞保持足以获得TTR基因的mRNA转录物降解的时间，从而抑制细胞中TTR基因的表达。
[0103]本发明的一个或更多个实施方式的细节在以下详述中阐明。本发明的其他特征、目标和优点将从说明书、附图和权利要求书中变得明显。【专利附图】

【附图说明】
[0104]图1是转染TTR siRNA后，培养的人类PBMC中TNFa和IFNa的水平图。
[0105]图2A和2B分别是H印G2细胞中AD-18324和AD-18328的剂量响应曲线。
[0106]图3是H印G2细胞中AD-18246的剂量响应曲线。
[0107]图4A和图4B分别显示静脉浓注施用以LNPOI配制的TTR-dsRNA (AD-18324、AD-18328 和 AD-18246)的转基因 H129_mTTR-K0 / iN0S-K0 / hTTR 小鼠中肝脏 mRNA 和血浆蛋白质水平的抑制。[0108]图5是静脉输注以SNALP配制的TTR-dsRNA (AD-18324和AD-18328) 15分钟后，非人灵长类动物肝脏中的TTR mRNA水平的测定值的汇总图。
[0109]图6A和图6B分别显示静脉浓注施用SNALP-18328的转基因小鼠中的人V30M TTR肝脏mRNA和血清蛋白水平的抑制。测定组平均值，对PBS对照组标准化，然后绘图。误差棒代表标准偏差。显示SNALP-1955和SNALP-18328组相对于PBS的组平均值的降低百分比。(***ρ〈ο.001,单向方差分析,具有Dunn事后检验)。
[0110]图7Α和图7Β分别显示单次静脉浓注施用SNALP-18328后22天内，转基因小鼠中的人V30M TTR肝脏mRNA和血清蛋白水平的降低持久性。测定组平均值，TTR/GAPDHmRNA水平对第O天的水平标准化并绘图。计算并显示SNALP-18328组在各时间点相对于SNALP-1955的标准化TTR mRNA水平的降低百分比。(#*p〈0.001，单向方差分析，具有Dunn事后检验)。
[0111]图8显示单次15分钟静脉输注SNALP-18328后的14天内，非人灵长类动物中TTR血清蛋白水平的时间进程。
[0112]图9显示静脉浓注施用SNALP-18328后，人V30M TTR / HSF-1敲除小鼠的多种组织中的TTR-免疫反应性的降低。E，食道；S，胃；11，肠/十二指肠；14，肠/结肠；N，神经；D，背根神经节。
[0113]图10显示15分钟静脉输注XTC-SNALP-18328后，非人灵长类动物肝脏中TTRmRNA水平的测定值。
[0114]图1lA和IlB分别显示15分钟静脉输注LNP09-18328或LNPl 1-18328后，非人灵长类动物肝脏中TTR mRNA和血清蛋白水平的测定值。图1IC显示15分钟静脉输注0.3mg /kg LNP09-18328后的28天内TTR血清蛋白水平较之PBS对照组的时间进程。
[0115]图12 显示人 TTR mRNA (参考 Seq.ΝΜ_000371.3，SEQ ID NO:1331)的序列。
[0116]图13A和13B分别是人类和大鼠TTR mRNA的序列。图13A是人类TTR mRNA (参考 Seq.ΝΜ_000371.2，SEQ ID NO:1329)的序列。图 13B 是大鼠 TTR mRNA(参考 Seq.NM_012681.1，SEQ ID NO:1330)的序列。
[0117]图14显示匪_000371.3、匪_000371.2和六0-18328的核苷酸比对。
[0118]图15说明与家族性淀粉样变性神经病、家族性淀粉样变性心肌病和CNS淀粉样变性有关的TTR症状和突变。
[0119]图16显示用SNALP-18534进行不同输注时间的肝脏中TTR mRNA水平的降低。各组动物(η = 4 /组)经过15分钟或1、2、或3小时输注，施用Img / kg的SNALP-18534。48小时后，处死大鼠并获得肝脏。使用Quantigene bDNA试验从肝脏溶解产物中测定TTR和GAPDH mRNA水平。计算各动物的TTR比GAPDH mRNA水平的比例。测定组平均值并对PBS对照组标准化，然后绘图。误差棒代表标准偏差。(***p〈0.001，单向方差分析，具有Bonferroni事后检验,相对于PBS)。
[0120]图17显示15分钟静脉输注LNP07-18534或LNP08-18534后大鼠肝脏中TTR mRNA水平的测定值。
[0121]图18 显示 15 分钟静脉输注 LNP09-18534 或 LNPl 1-18534 后，Sprague-Dawley 大鼠肝脏中内源TTR mRNA水平的体内抑制。各组动物(n=4 /组)经过15分钟输注静脉施用0.01、0.03、0.I 或 0.3mg / kg 的 LNP09-18534、LNP-11-18534 ;或 PBS。48 小时后，处死动物并获得肝脏。使用Quantigene bDNA试验从肝脏活检组织溶解产物中测定TTR和GAPDHmRNA水平。计算各动物的TTR比GAPDH mRNA水平的比例。测定组平均值并对PBS对照组标准化，然后绘图。误差棒代表标准偏差。
[0122]发明详述
[0123]本发明提供dsRNA和利用dsRNA抑制细胞或哺乳动物中TTR基因表达的方法，其中dsRNA靶向TTR基因。本发明也提供用于治疗哺乳动物中由TTR基因表达所引起的病理学病症和疾病例 如TTR淀粉样变性的组合物和方法。dsRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程引导mRNA的序列特异性降解。
[0124]本发明组合物的dsRNA包括RNA链(反义链)，其具有长度小于30个核苷酸、通常长度为19-24个核苷酸的区域，且该区域和TTR基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补。使用这些dsRNA使得涉及与哺乳动物中TTR表达有关的病理学的基因的mRNA的靶向降解成为可能。极低剂量的TTR dsRNA特别可以特异且有效地介导RNAi，导致TTR基因表达的显著抑制。使用基于细胞的试验，本发明人证明靶向TTR的dsRNA可以特异且有效地介导RNAi，导致TTR基因表达的显著抑制。因此，含有这些dsRNA的方法和组合物可用于治疗可由下调TTR介导的病理过程，例如治疗肝脏疾病或TTR淀粉样变性，例如FAP。
[0125]含有TTR dsRNA的方法和组合物可用于治疗由TTR表达介导的病理过程，例如TTR淀粉样变性。在一个实施方式中，治疗由TTR表达介导的疾病的方法包括将治疗有效量的靶向TTR的dsRNA施用于需要这种治疗的人。在一个实施方式中，dsRNA以约0.01、0.1,0.5、1.0、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg / kg施用于人。
[0126]以下详细说明公开了如何制备并使用包含dsRNA的组合物抑制TTR基因表达，以及用于治疗由该基因表达所引起的疾病和病症的组合物和方法。本发明的药物组合物包含具有反义链的dsRNA和药学可接受的载体，所述反义链含有长度小于30个核苷酸、通常长度为19-24个核苷酸的互补区域，且该区域和TTR基因的RNA转录物的至少一部分基本上互补。本发明的组合物也包含具有反义链的dsRNA，所述反义链含有长度小于30个核苷酸、通常长度为19-24个核苷酸的互补区域，且该区域和TTR基因的RNA转录物的至少一部分基本上互补。
[0127]dsRNA 的有义链可以包括 SEQ ID NO: 169,SEQ ID NO:449、SEQ ID NO:729 或 SEQID NO:1009的15、16、17、18、19、20、21或更多个连续核苷酸。dsRNA的反义链可以包括SEQID NO:170,SEQ ID NO:450、SEQ ID NO:730 或 SEQ ID NO:1010 的 15、16、17、18、19、20、21或更多个连续核苷酸。在一个实施方式中，dsRNA的有义链可由SEQ ID NO:449或其片段组成，反义链可以由SEQ ID NO:450或其片段组成。在一个实施方式中，dsRNA的有义链可由SEQ ID NO:729或其片段组成，反义链可以由SEQ ID NO:730或其片段组成。在一个实施方式中，dsRNA的有义链可由SEQ ID NO:1009或其片段组成，反义链可以由SEQ ID NO:1010或其片段组成。
[0128]在一个实施方式中，dsRNA可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个修饰核
苷酸。在一个实施方式中，修饰核苷酸可包括2' -O-甲基修饰核苷酸、含有5'-硫代磷酸基团的核苷酸、和/或与胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸基酰胺基相连的末端核苷酸。在一个实施方式中，修饰核苷酸可包括W -脱氧-2'-氟代修饰核苷酸、2'-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基-修饰核苷酸、2'-烷基-修饰核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、和/或含有非天然碱基的核苷酸。
[0129]在一个实施方式中，dsRNA的互补区域的长度至少为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或更多个核苷酸。在一个实施方式中，互补区域包括SEQ ID NO:169的10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或更多个连续核苷酸。
[0130]在一个实施方式中，dsRNA的各链长度为 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸。在一个实施方式中，dsRNA包含选自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有义链，或其10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个核苷酸片段，和选自表3A、3B、4、6A、6B、7 和 16 的反义链，或其 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 21 个核苷
酸片段。
[0131]在一个实施方式 中，由实时PCR试验测定，dsRNA施用于细胞导致约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上的 TTR mRNA 表达的抑制。在一个实施方式中，由实时PCR试验测定，dsRNA施用于细胞导致约40 %到45 %、45 %到50 %、50% 到 55%、55% 到 60%、60% 到 65%、65% 到 70%、70% 到 75%、75% 到 80%、80% 到85%、85%到90%、90%到95%或以上的111? mRNA表达的抑制。在一个实施方式中，由分支 DNA 试验测定，dsRNA 施用于细胞导致约 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上的TTR mRNA表达的抑制。在一个实施方式中，由分支DNA试验测定，dsRNA施用于细胞导致约40%到45%、45%到50%、50%到55%、55%到60%、60%到65%,65%IlJ 70%、70%到 75%、75%到 80%、80%到 85%、85%到 90%、90%到 95%或以上的TTR mRNA表达的抑制。
[0132]在一个实施方式中，dsRNA的 IC50 小于 0.01ρΜ、0.ΙρΜ、1ρΜ、5ρΜ、ΙΟρΜ、IOOpM 或ΙΟΟΟρΜ。在一个实施方式中，dsRNA 的 ED50 约为 0.01、0.1、1、5 或 IOmg / kg。
[0133]在一个实施方式中，施用dsRNA可以降低食蟹猴中的TTR mRNA约40 %、45 %、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上。在一个实施方式中，施用 dsRNA可以降低肝脏 TTR mRNA 水平约 40% ,45% ,50% ,55% ,60% ,65% ,70% ,75% ,80% ,90%,95% 或以上，或血清 TTR 蛋白水平约 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上。在一个实施方式中，施用dsRNA降低肝脏TTR mRNA水平和/或血清TTR蛋白水平直到 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多天。
[0134]在一个实施方式中，dsRNA配制成 LNP 制剂并在 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7、
0.8、0.9或Img / kg剂量下相对于PBC对照组降低TTR mRNA水平约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上。在一个实施方式中，dsRNA配制成LNP制剂并通过蛋白质印迹测得相对于PBC对照组降低TTR蛋白水平约40 %、45 %、50 %、55 %、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上。在一个实施方式中，当施用于需要治疗的受试者时，dsRNA 在 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg / kg的剂量下抑制血清TTR蛋白水平直到治疗后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 天。
[0135]因此，在一些方面，含有TTR dsRNA和药学可接受载体的药物组合物、使用该组合物抑制TTR基因表达的方法和使用该药物组合物治疗由TTR基因表达引起的疾病的方法是本发明的特征。
[0136]1.定义
[0137]为方便起见，下文 提供用于说明书、实施例和权利要求书中的某些术语和短语的意思。如果本说明书其他部分中术语的用法和本节提供的定义有着明显的差异，采用本节的定义。
[0138]通常"G"、" C"、" A"和"U"各自代表分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。“T”和“dT”在本文中可互换使用，指的是核碱基是胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸，例如脱氧核糖胸腺嘧啶。然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”或“脱氧核糖核苷酸”也可指下文进一步详述的修饰核苷酸，或取代替换部分。本领域技术人员知道鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可被其他部分取代，而基本上不改变含有携带这种替换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如但不限于，含有次黄嘌呤核苷作为其碱基的核苷酸可以和含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，本发明核苷酸序列中含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如次黄嘌呤核苷的核苷酸替换。含有这种替换部分的序列是本发明的实施方式。
[0139]如本文所使用，“运甲状腺素蛋白”(“TTR”)指的是细胞中的基因。TTR又名ATTR、HsT2651、PALB、前清蛋白、TBPA和运甲状腺素蛋白(前清蛋白，淀粉样变性类型I)。人TTRmRNA转录物的序列可在NM_000371中发现。小鼠TTR mRNA序列可在NM_013697.2中发现，大鼠TTR mRNA的序列可在NM_012681.1中发现。
[0140]如本文所使用，“目标序列”指的是在TTR基因的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。
[0141]如本文所使用，术语“含有序列的链”指的是含有由相当于使用标准核苷酸命名法描述的序列的核苷酸链的寡核苷酸。
[0142]如本文所使用，除非另有陈述，术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时，指的是含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下和含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链结构的能力，如本领域技术人员所理解。这种条件例如可以是严格条件，其中严格条件可以包括:400mM NaCl,40mM PIPESpH6.4，ImM EDTA，50°C或70°C放置12-16小时，然后清洗。可以应用其他条件，例如有机体内可能遇到的生理学相关条件。本领域技术人员将能根据杂交核苷酸的最终应用决定最适合于两个序列的互补性测试的这套条件。
[0143]这包括在第一和第二核苷酸序列的整个长度上使含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸和含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸碱基配对。这样的序列在此可以称为相对于彼此“完全互补”。然而，当第一序列在此称为相对于第二序列“基本上互补”时，两个序列可以完全互补，或它们在杂交时可以形成一个或多个，但通常不超过4、3或2个错配碱基对，而保持在与它们的最终应用最相关的条件下杂交的能力。然而，当两个寡核苷酸设计成在杂交时形成一个或多个单链突出端时，这样的突出端时将不会被认为是关于互补性测定的错配。例如，一种dsRNA含有一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸，其中较长的寡核苷酸包含与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸序列，则基于本文描述的目的，该dsRNA仍然可以称为“完全互补”。
[0144]本文使用的“互补”序列也可以包括，或完全由以下碱基对形成:非-Watson-Crick碱基对和/或由非天然和修饰核苷酸形成的碱基对,只要满足上述关于其杂交能力的要求。这种非-Watson-Crick碱基对包括但不限于:G:U摆动(Wobble)或Hoogstein喊基配对。
[0145]本文的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可相对于dsRNA的有义链和反义链之间，或dsRNA的反义链和目标序列之间的碱基配对使用，如将从其使用的上下文理解。
[0146]如本文所使用，与信使RNA(mRNA) “的至少一部分基本上互补”的多核苷酸指的是与包括5，UTR、开放阅读框(ORF)或3' UTR的目标mRNA (例如，编码TTR的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果该序列与编码TTR的mRNA的非中断部分基本上互补，则多核苷酸和TTR mRNA的至少一部分互补。
[0147]本文使用的术语“双链RNA”或“dsRNA”指的是核糖核酸分子复合物，其具有含有两个反平行的并如上定义基 本上互补的核酸链的双链结构。通常，各链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但如本文详细描述，每一条链或者两条链也可以包括至少一个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或修饰核苷酸。另外，如说明书中所使用，“dsRNA”可以包括对核苷酸的化学修饰，包括多个核苷酸的实质性修饰并包括本文公开或现有技术已知的所有类型的修饰。为本说明书和权利要求书的目的，“dsRNA”包括任何这样的修饰，如siRNA型分子中使用的。
[0148]形成双链结构的两条链可以是一条较大的RNA分子的不同部分，或它们可以是分离的RNA分子。当这两条链是一条较大分子的一部分，且因此通过形成双链结构的一条链的3'端和相应另一条链的5’端之间的核苷酸的连续链相连时，连接的RNA链称为“发夹环”。当这两条链通过不同于形成双链结构的一条链的3'端和相应另一链的5’端之间的核苷酸的连续链的手段共价相连时，该连接结构称为“连接子”。该RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是dsRNA的最短链的核苷酸数减去存在于双链体中的任何突出端。除双链结构之外，dsRNA还可以包含一个或多个核苷酸突出端。术语“siRNA”在本文中也用于指上述的dsRNA。
[0149]如本文所使用，当dsRNA的一条链的:V端延伸超过另一条链的Y端时，或反之亦然，“核苷酸突出端”指的是未配对的核苷酸或从dsRNA的双链结构中突出的核苷酸。“平的”或“平端”指的是dsRNA的这一端没有未配对的核苷酸，即，没有核苷酸突出端。“平端” dsRNA是在其全长上为双链的dsRNA，即，在分子的任一端没有核苷酸突出端。
[0150]术语“反义链”指的是包括与目标序列基本上互补的区域的dsRNA链。如本文所使用，术语“互补区域”指的是与一个序列，例如本文定义的目标序列，基本上互补的反义链上的区域。当互补区域不与目标序列完全互补时，末端区域最能容忍错配，如果存在，错配通常在末端区域或，例如在Y和/或:V端的6、5、4、3或2个核苷酸内。
[0151]本文所使用的术语“有义链”指的是含有与反义链区域基本上互补的区域的dsRNA链。
[0152]如本文所使用，术语“SNALP”指的是稳定的核酸-脂质颗粒。SNALP代表包有减少的含水内部的脂质囊泡，所述含水内部含有核酸例如dsRNA或dsRNA由此转录的质粒。SNALP例如描述在美国专利申请公布说明书Nos.20060240093、20070135372和2008年4月15日提交的USSN61 / 045,228。这些申请以引用方式合并于此。
[0153]当指dsRNA时，“引入细胞内”意思是促进摄入或者吸收到细胞内，如本领域技术人员所理解的。dsRNA的吸收或摄入可通过未受帮助的扩散或主动细胞代谢过程发生，或通过助剂或装置发生。该术语的意思不限于体外细胞，也可以将dsRNA“引入细胞内”，其中该细胞是活的有机体的部分。在这种情况下，引入细胞内将包括递送到有机体。例如，对于体内递送，可将dsRNA注入组织部位或全身施用。体外引入细胞内包括本领域已知方法,例如电穿孔法和脂质转染法。其他方法在本文描述或是本领域已知的。
[0154]当涉及TTR基因时，本文的术语“沉默”、“抑制表达”、“下调表达”、“抑制表达”等指的是TTR基因表达的至少部分抑制，表现为可以从第一细胞或细胞群中分离的mRNA的量相对于第二细胞或细胞群的减少，所述第一细胞或细胞群中TTR基因被转录，并且已经经过处理，以致TTR基因的表达被抑制，所述第二细胞或细胞群与第一细胞或细胞群基本上相同，但其没有经过如此处理(对照细胞)。抑制程度通常用以下公式表示:
[0155]
(对照细胞中的m—)-(处理细胞中的.100%
(对照细胞中的°
[0156]或者，抑制程度可以根据与TTR基因表达功能相关的参数的降低给出，例如，所述参数是由细胞分泌的TT R基因编码的蛋白质的量，或显示某种表型例如细胞凋亡的细胞的数目。原则上，TTR基因沉默可在组成型地或通过基因工程表达靶标的任何细胞中通过任何适当的试验来确定。然而，当需要参考以确定给定的dsRNA是否以某种程度抑制TTR基因的表达，且因此包括在本发明中时，以下实施例提供的试验将作为这样的参考。
[0157]例如，在某些情况下，通过施用本发明的双链寡核苷酸抑制TTR基因的表达至少约 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或 50%。在一些实施方式中，通过施用本发明的双链寡核苷酸抑制TTR基因至少约60%、70%或80%。在一些实施方式中，通过施用本发明的双链寡核苷酸抑制TTR基因至少约85 %、90%或95 %。
[0158]如TTR表达的上下文所使用，术语“治疗”等指的是缓解或减轻由TTR表达介导的病理过程。在本发明上下文范围内，它涉及下文记载的任何其他病症(除了由TTR表达介导的病理过程)，术语“治疗”等指的是缓解或减轻与这种病症有关的至少一种症状，或延缓或逆转这种病症的进展，例如延缓TTR淀粉样变性例如FAP的进展。TTR淀粉样变性的症状包括感官神经病(例如远肢感觉异常、感觉减退)、自主神经病(例如，胃肠功能失调，如胃溃疡，或体位性低血压)、运动神经病、癫痫发作、痴呆、脊髓病、多神经病、腕管综合征、自主缺陷、心肌病、玻璃体混池、肾功能不全、肾病、mBMI实质降低(体重指数改变)、脑神经机能障碍和格子状角膜营养不良。
[0159]如本文所使用，短语“治疗有效量”和“预防有效量”指的是在治疗、预防或控制由TTR表达介导的病理过程或由TTR表达介导的病理过程的明显症状中提供治疗学效益的量。治疗有效的具体量可由普通开业医生容易地确定，并可以根据本领域已知的因素而改变，所述因素例如由TTR表达介导的病理过程的种类、病人的病史和年龄、由TTR表达介导的病理过程的阶段，以及由TTR表达试剂介导的其他抗病理过程的施用。
[0160]如本文所使用，“药物组合物”包含药理学有效量的dsRNA和药学可接受的载体。如本文所使用，“药理学有效量”、“治疗有效量”或仅“有效量”指的是有效产生预定药理学、治疗学或预防结果的RNA的量。例如，如果与疾病或病症有关的可测定参数有至少25%的降低，给定的临床治疗被认为是有效的，那么治疗该疾病或病症的药物治疗有效量是导致那些参数减少至少25%所需的量。例如，靶向TTR的dsRNA的治疗有效量可以降低TTR血清水平至少25%。在另一个例子中，靶向TTR的dsRNA的治疗有效量可以改善肝功能或肾功能至少25%。
[0161]术语“药学可接受的载体”指的是用于施用治疗剂的载体。这种载体包括但不限于:盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。该术语特别排除细胞培养基。对于口服施用，药学可接受的载体包括但不限于:药学可接受的赋形剂例如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。适当的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙、和乳糖，而玉米淀粉和藻酸是适当的崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和凝胶，而润滑剂，如果存在，通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，药片可以包衣有一种材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，以延缓胃肠道中的吸收。
[0162]如本文所使 用，“转化的细胞”是已引入可表达dsRNA分子的载体的细胞。
[0163]I1.双链核糖核酸(dsRNA)
[0164]如本文更详细的描述，本发明提供用于抑制细胞中或哺乳动物例如患有TTR淀粉样变性的人的TTR基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含反义链，该反义链具有与TTR基因表达中形成的mRNA的至少一部分互补的互补区域，且其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸，通常长度为19-24个核苷酸，且其中当与表达所述TTR基因的细胞接触时，通过例如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法测定，或通过基于蛋白质的方法例如蛋白质印迹法测定，所述dsRNA抑制所述TTR基因的表达至少30%。当通过以下实施例描述的试验测定时，TTR基因的表达可以降低至少30%。例如，细胞培养物(例如H印3B细胞)中TTR基因的表达可以通过测定TTRmRNA水平(例如通过bDNA或TaqMan试验)或通过测定蛋白水平(例如通过ELISA试验)来测定。本发明dsRNA还可以包括一个或多个单链核苷酸突出端。
[0165]所述dsRNA可以通过本领域已知以及下文进一步讨论的标准方法来合成，例如，通过利用例如可从例如Biosearch、Applied Biosystems公司买到的自动化DNA合成仪合成。所述dsRNA包含充分互补从而能够杂交形成双链结构的两条RNA链。所述dsRNA的一条链(反义链)包含与由TTR基因表达期间形成的mRNA序列得到的目标序列基本上互补、通常完全互补的互补区域，另一条链(有义链)包含与反义链互补的区域，这样当在适宜条件下结合时，两条链杂交并形成双链结构。通常，双链结构的长度为15到30或25到30、或18到25、或19到24、或19到21、或19、20、或21个碱基对。在一个实施方式中，该双链体的长度是19个碱基对。在另一个实施方式中，该双链体的长度是21个碱基对。当两个不同的siRNA结合使用时，双链体的长度可以相同或可以不同。[0166]本发明的dsRNA的各链长度通常为15到30、或18到25、或18、19、20、21、22、23、
24或25个核苷酸。在其他实施方式中，各链长度为25-30个核苷酸。所述双链体的各链长度可以相同或不同。当两个不同的siRNA结合使用时，各siRNA的各链长度可以相同或可以不同。
[0167]本发明dsRNA可以包括一个或多个核苷酸的一个或多个单链突出端。在一个实施方式中，dsRNA的至少一端具有I到4个、通常I或2个核苷酸的单链核苷酸突出端。在另一个实施方式中，dsRNA的反义链在3’端和5’端各具有超出有义链的1-10个核苷酸的突出端。在另一个实施方式中，dsRNA的有义链在3’端和5’端各具有超出反义链的1-10个核苷酸的突出端。
[0168]具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA比平端对应物具有意外的更好的抑制性质。在一些实施方式中，仅一个核苷酸突出端的存在加强dsRNA的干扰活性，而不影响它的总稳定性。已经证实只具有一个突出端的dsRNA在体内以及各种细胞、细胞培养基、血和血清中特别稳定和有效。通常，单链突出端位于反义链的3,端，或者，在有义链的3,端。所述dsRNA也可以具有平端，通常位于反义链的5’端。这种dsRNA可具有提高的稳定性和抑制活性，因此允许以低剂量施用，即，小于每天5mg / kg接受者体重。通常，dsRNA的反义链在3’端具有核苷酸突出端，且5’端为平端。在另一个实施方式中，突出端中的一个或多个核苷酸用核苷硫代磷酸替换。[0169]在一个实施方式中，TTR基因是人TTR基因。在具体的实施方式中，dsRNA的有义链是选自表3A、3B、4、6A、6B或7的有义序列之一，以及反义链是选自表3A、3B、4、6A、6B或7的反义序列之一。靶向表3A、3B、4、6A、6B或7提供的目标序列中的其它地方的替代反义试剂可以通过使用目标序列和侧翼TTR序列容易地确定。
[0170]技术人员很了解具有20到23个、特别是21个碱基对的双链结构的dsRNA在诱导RNA干扰中特别有效(Elbashir等，EMB02001，20:6877-6888)。然而，其他人发现较短或较长的dsRNA也是有效的。在上述实施方式中，依靠表3A、3B、4、6A、6B或7提供的寡核苷酸序列的性质，本发明的dsRNA可以包含至少一条具有本文描述的长度的链。可以合理预期，具有表3A、3B、4、6A、6B或7的一个序列、仅在一端或两端减去几个核苷酸的较短dsRNA较之上述的dsRNA可能有着相似的效果。因此，本发明可以预期这样的dsRNA:它含有表3、4、6或7的一个序列的至少15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的部分序列，并且在以下所述试验中抑制TTR基因表达的能力较之含有完整序列的dsRNA相差不超过5、10、15、20、25或30%抑制。另外，在所需TTR目标序列中切割的dsRNA可以通过使用相应的TTR反义序列和互补的有义序列容易地制备。
[0171 ] 另外，表3A、3B、4、6A、6B或7提供的dsRNA识别TTR中对RNAi基切割敏感的位点。同样地，本发明的特征还在于靶向由本发明的一种试剂靶向的序列内的dsRNA。如本文所使用，如果第二 dsRNA切割与第一 dsRNA的反义链互补的mRNA内无论何处的信使，则称该第二 dsRNA靶向第一 dsRNA序列内。这种第二 dsRNA通常由表3A、3B、4、6A、6B或7中提供的一个序列的至少15个连续核苷酸组成，所述序列与取自与TTR基因中选定序列相邻的区域的其他核苷酸序列偶联。
[0172] 本发明的dsRNA可以包含与目标序列的一个或多个错配。在一个实施方式中，本发明的dsRNA包含不超过3个错配。如果dsRNA的反义链包含与目标序列的错配，优选错配区域不位于互补区域的中心。如果dsRNA的反义链包含与目标序列的错配，优选错配限于距任一末端的5个核苷酸,例如距互补区域的5’或3’端的5、4、3、2或I个核苷酸。例如，对于与TTR基因区域互补的23个核苷酸的dsRNA链，通常dsRNA在中心的13个核苷酸中不包含任何错配。本发明描述的方法可用于确定包含与目标序列的错配的dsRNA在抑制TTR基因的表达中是否有效。考虑具有错配的dsRNA在抑制TTR基因表达中的效果是重要的，特别是如果已知TTR基因的特定互补区域在种群内具有多态性序列变异。
[0173]修饰
[0174]另一个实施方式中，化学修饰dsRNA以提高稳定性。本发明核酸可以通过本领域良好建立的方法合成和/或修饰，例如“Current protocols in nucleic acidchemistry, ^Beaucage, S.L.等(Eds.), John ffiley&Sons, Inc.,New York, NY, USA 中所描述的那些，其以引用方式合并于此。用于本发明的dsRNA化合物的具体例子包括含有修饰骨架或不含天然核苷间键的dsRNA。如本说明书所定义，具有修饰骨架的dsRNA包括在骨架中保持有磷原子的dsRNA以及在骨架中不含有磷原子的dsRNA。为本说明书目的，以及如现有技术中有时提到的，其核苷间骨架中不含有磷原子的修饰dsRNA也被认为是寡核苷酸。
[0175]修饰的dsRNA骨架例如包括硫代磷酸、手性硫代磷酸、二硫代磷酸、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基磷酸酯，包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯，包括3 '-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3' -5'键、2' -5'连接类似物的硼磷酸酯，以及具有反极性的那些，其中相邻的核苷单元对是3' -5'到5' -3'或2' -5'到5' -2'连接。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
[0176]教导制备上述含磷键的制备的典型美国专利包括但不限于美国专利Nos.3，687，808 ;4，469，8 63 ;4，476，301 ;5，023，243 ;5，177，195 ;5，188，897 ;5，264，423 ；5，276，019 ;5，278，302 ;5，286，717 ;5，321，131 ;5，399，676 ;5，405，939 ;5，453，496 ；5，455，233 ;5，466，677 ;5，476，925 ;5，519，126 ;5，536，821 ;5，541，316 ;5，550，111 ；5，563，253 ;5，571，799 ;5，587，361 ;和 5，625，050，各专利以引用方式合并于此。
[0177]其中不含有磷原子的修饰dsRNA骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包含具有吗啉代键的骨架(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；含链烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；及其他具有N、O、S和CH2组成部分的骨架。
[0178]教导制备上述寡核苷酸的典型美国专利包括但不限于美国专利Nos.5，034，506 ；5，166，315 ;5，185，444 ;5，214，134 ;5，216，141 ;5，235，033 ;5，64，562 ;5，264，564 ；5，405，938 ;5，434，257 ;5，466，677 ;5，470，967 ;5，489，677 ;5，541，307 ;5，561，225 ；5，596，086 ;5，602，240 ;5，608，046 ;5，610，289 ;5，618，704 ;5，623，070 ;5，663，312 ；5，633，360 ;5，677，437 ;和5，677，439，各专利以引用方式合并于此。
[0179]在其他适当的dsRNA模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间键两者，即，骨架，用新基团替换。保持碱基单元用于与适当的核酸目标化合物杂交。已经显示具有优异杂交性质的一种这样的寡聚化合物，dsRNA模拟物，称为肽核酸(PM)。在PNA化合物中，dsRNA的糖骨架被含酰胺骨架替换，特别是被氨基乙基甘氨酸骨架替换。核碱基被保持并直接或间接结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。教导制备上述PNA化合物的典型美国专利包括但不限于美国专利5，539，082 ;5，714，331 ;和5，719，262，各专利以引用方式合并于此。PNA化合物的其他教导可在Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500中发现。
[0180]本发明其他实施方式是具有硫代磷酸骨架和具有杂原子骨架的寡核苷酸的dsRNA,以及特别是以上引用的美国专利N0.5，489，677的一CH2—NH—CH2—、-CH2-N (CH3) -O-CH2-[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]、—CH2—O—N (CH3) -CH2-,—CH2—N(CH3) —N(CH3) —CH2—和一N(CH3) —CH2—CH2—[其中天然磷酸二脂骨架表不为--O--P--O--CH2--],以及以上引用的美国专利N0.5，602，240的酰胺骨架。以上引用的美国专利N0.5，034, 506中的具有吗啉代骨架结构的dsRNA也是优选的。
[0181]修饰dsRNA也可以包含一个或多个取代的糖部分。优选的dsRNA在W位置包含以下基团的一种:0H ；F ;0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1到Cltl烷基或C2到Cltl烯基和炔基。特别优选的是 O [ (CH2) n0] mCH3、O (CH2) n0CH3、O (CH2) nNH2、0 (CH2) nCH3、0 (CH2) n0NH2和0(CH2)nON[(CH2)nCH3]]2，其中n和m是I到约10。其他优选的dsRNA在2'位置包含以下基团中的一种=C1到Cltl低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3> 0CN、Cl、Br、CN、CF3> OCF3> SOCH3> S02CH3> ONO2, NO2, N3> NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善dsRNA的药代动力学性质的基团、或用于改善dsRNA的药效性质的基团、及其他具有类似性质的取代基。 优选的修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2' -O--CH2CH2OCH3，也称为2' -0-(2-甲氧基乙基)或 2' -Μ0Ε) (Martin 等 Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)，SP，烷氧基-烷氧基。其他优选的修饰包括2' -二甲基氨基氧基乙氧基，即O (CH2)2ON(CH3)2基团，又名2' -DMA0E，如以下实施例所描述，和2' -二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域中又名 2’ _0_二甲基氣基乙氧基乙基或 2 ' _DMAE0E)，即 2' _0一CH2一O一CH2一N(CH2)2，也在以下实施例中描述。
[0182]其他优选的修饰包括2 '-甲氧基(2 ' -OCH3)、2 '-氨基丙氧基(.2' -OCH2CH2CH2NH2)和V -氟代(2' -F)。类似的修饰也可在dsRNA的其他位置上进行，特别是3'端核苷酸上的糖的3'位置或2' -5'连接的dsRNA中和5'端核苷酸的5'位置。DsRNA也可以含有糖模拟物例如环丁基部分代替戊呋喃基糖。教导制备这种修饰糖结构的典型美国专利包括但不限于美国专利Nos.4，981，957 ;5，118，800 ;5，319，080 ；5，359，044 ;5，393，878 ;5，446，137 ;5，466，786 ;5，514，785 ;5，519，134 ;5，567，811 ；5，576，427 ;5，591，722 ;5，597，909 ;5，610，300 ;5，627，053 ;5，639，873 ;5，646，265 ；5，658，873 ;5，670，633 ;和5，700，920，它们中的一些由本 申请人:拥有，各专利以引用方式全部合并于此。
[0183]dsRNA也可以包含核碱基(通常在本领域中简称为“碱基”)修饰或取代。如本发明所使用，“未修饰的”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰核碱基包括其他合成的和天然的核碱基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5_羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-炔丙基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代，特别是5-溴代、5-三氟甲基及其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他核碱基包括公开在美国专利N0.3，687，808中的那些，公开在The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages858-859, Kroschwitz,J.L, ed.John ffiley&Sons, 1990 中的那些，公开在 Englisch 等，Angewandte Chemie,International Edition, 1991, 30,613 中的那些，以及公开在 Sanghvi, Y S., Chapter 15,DsRNA Research and Applications, pages289_302, Crooke, S.T 和 Lebleu, B., Ed., CRCPress, 1993中的那些。这些核碱基中的某些对增加本发明寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙腺嘌呤、5-炔丙基尿嘧啶和5-炔丙基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代显示使核酸双链体稳定性增加 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T.and Lebleu, B., Eds., DsRNA Research andApplications,CRC Press,Boca Raton, 1993,pp.276-278)并且是不范性的喊基取代，更特别是当与2' -O-甲氧基乙基糖修饰结合时。
[0184]教导制备某些上述修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的典型的美国专利包括但不限于上述提到的美国专利N0.3，687,808,以及美国专利Nos.4，845，205 ;5，130，30 ；5，134，066 ;5，175，273 ;5，367，066 ;5，432，272 ;5，457，187 ;5，459，255 ;5，484，908 ；5，502，177 ;5，525，711 ;5，552，540 ;5，587，469 ;5，594，121，5，596，091 ;5，614，617 ；和 5，681，941，各专利以引用方式合并于此，且美国专利N0.5，750，692也以引用方式合并于此。
[0185]偶联物
[0186]本发明dsRNA的另一个修饰包括将dsRNA化学连接到提高dsRNA的活性、细胞分布或细胞摄入的一个或多个部分或偶联物上。这种部分包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分(Letsinger 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1989,86:6553)、胆酸(Manoharan 等，Bioorg.Med.Chem.Lett., 1994,4:1053)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(beryl-S-tritylthiol) (Manoharan 等，Ann.N.Y.Acad.Sc1., 1992,660:306 ；Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let., 1993,3:2765)、疏基胆固醇(Oberhauser 等，Nucl.AcidsRes., 1992, 20:533-538)、脂肪链，例如十二烧二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J,1991，10:1111-1118 ；Kabanov 等，FEBS Lett.，1990，259:327-330 ；Svinarchuk等，Biochimie, 1993，75:49-54)、磷脂，例如二-十六烷基_rac_甘油或三乙基-铵1，2_ 二 -O-十六烷基-rac-甘油-3-氢亚憐酸盐(Manoharan 等，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654 ;Shea 等，Nucl.Acids Res.，1990，18:3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan 等，Nucleosides&Nucleotides, 1995,14:969-973)、或金刚烧乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654)、掠榈基部分(Mishra 等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264:229-237)、或十八烷基胺或己氨基-羰氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996, 277:923-937)。
[0187]教导制备这种dsRNA偶联物的典型美国专利包括但不限于:美国专利 Nos.4，828，979 ；4, 948，882 ；5, 218，105 ；5, 525，465 ；5, 541，313 ；5, 545，730 ；5，552，538 ；5, 578，717,5, 580, 731 ；5, 591，584 ；5, 109, 124 ；5, 118，802 ；5, 138，045 ；5，414，077 ；5, 486，603 ；5, 512，439 ；5, 578，718 ；5, 608，046 ；4, 587，044 ；4, 605，735 ；4，667，025 ；4, 762，779 ；4, 789，737 ；4, 824，941 ；4, 835，263 ；4, 876，335 ；4, 904，582 ；4，958，013 ；5, 082，830 ；5, 112，963 ；5, 214，136 ；5, 082，830 ；5, 112，963 ；5, 214，136 ；5，245，022 ；5, 254，469 ；5, 258，506 ；5, 262，536 ；5, 272，250 ；5, 292，873 ；5, 317，098 ；5，371，241，5，391，723 ；5, 416，203，5，451，463 ；5, 510，475 ；5, 512，667 ；5, 514，785 ；5，565，552 ；5, 567，810 ；5, 574，142 ；5, 585，481 ；5, 587，371 ；5, 595，726 ；5, 597，696 ；5，599，923 ；5, 599，928和5，688，941，各专利以引用方式合并于此。
[0188]不需要在给定化合物的所有位置进行相同的修饰，且事实上可以在单个化合物或甚至在dsRNA的单个核苷内结合一种以上上述修饰。本发明还包括为嵌合化合物的dsRNA化合物。本发明上下文中的“嵌合的”dsRNA化合物或“嵌合体”是这样一种dsRNA化合物，特别是dsRNA，其含有两个或更多个化学上不同的区域，每个由至少一个单体单元组成，SP，在dsRNA化合物的情况下由核苷酸组成。这些dsRNA通常含有至少一个dsRNA修饰的区域，从而赋予该dsRNA增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄入和/或增加的对于目标核酸的结合亲和力。dsRNA的其他区域可以作为能切割RNA =DNA或RNA =RNA杂交体的酶的底物。例如，RNase H是细胞核酸内切酶，其切割RNA =DNA双链体的RNA链。因此RNase H的活化导致RNA靶标的切割，因此极大地增强了 dsRNA抑制基因表达的效果。因此，当使用嵌合的dsRNA时,与杂交至相同目标区域的硫代磷酯脱氧dsRNA相比,使用较短的dsRNA通常能得到可比的结果。
[0189]RNA靶标的切割可以通过本领域已知的凝胶电泳以及如有必要结合核酸杂交技术按常规检测。dsRNA的靶标mRNA上的切割位点可以使用通常为本领域技术人员已知的方法测定，例如，Soutschek 等，Nature ;2004，Vol.432，pp.173-178 描述的 5，-RACE 法(为所有目的其以引用方式合并 于此)。在一个实施方式中，使用Soutschek等的5’-RACE法，确定 ALN-18328 在 SEQ ID NO: 1331 (NM_000371.3)的位置 636 的鸟苷酸核苷酸和 SEQ ID NO:1331的位置637的腺嘌呤核苷酸之间切割TTR mRNA。在一个实施方式中，确定ALN-18328不在SEQ ID NO:1331的位置637的腺嘌呤核苷酸和SEQ ID NO: 1331的位置638的鸟苷酸核苷酸之间切割TTR mRNA。
[0190]在某些情况下，dsRNA可以通过非配体基团修饰。将许多非配体分子偶联到dsRNAs上以提高dsRNA的活性、细胞分布或细胞摄入，且用于进行这种偶联的方法可在科学文献中得到。这种非配体部分包括脂质部分，例如胆固醇(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1989,86:6553)、胆酸(Manoharan 等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994,4:1053)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan 等，Ann.N.Y.Acad.Sc1.，1992,660:306 ；Manoharan 等，Bioorg.Med.Chem.Let., 1993,3:2765)、疏基胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20:533-538)、脂肪链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras 等，EMBO J, 1991, 10:1111-1118 ;Kabanov 等，FEBS Lett.，1990，259:327-330 ；Svinarchuk 等,Biochimie, 1993, 75:49-54)、憐脂,例如二 -十六烷基-rac-甘油或三乙基-铵1，2_ 二 -O-十六烷基-rac-甘油-3-H-亚憐酸盐(Manoharan等,TetrahedronLett.，1995，36:3651-3654 ；Shea 等，Nucl.Acids Res.，1990，18:3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan 等，Nucleosides&Nucleotides, 1995,14:969-973)、或金刚烧乙酸(Manoharan 等，Tetrahedron Lett.，1995, 36:3651-3654)、掠榈基部分(Mishra 等，Biochim.Biophys.Acta, 1995，1264:229-237)、或十八烷基胺或己氨基-羰氧基胆固醇部分(Crooke 等,J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996,277:923-937)。教导制备这种 dsRNA 偶联物的典型的美国专利已经列在上文。典型的偶联方法包括合成在序列的一个或多个位置上携带氨基连接子的dsRNA。然后使该氨基与使用适当的偶联剂或活化剂偶联的分子反应。偶联反应也可以用仍然与固体支持体结合的dsRNA或在溶液相中切割后的dsRNA进行。通过HPLC纯化dsRNA偶联物通常得到纯的偶联物。
[0191]载体编码的dsRNA
[0192]在另一个方面，TTR dsRNA分子由插入DNA或RNA载体中的转录单元表达(例如参见 Couture, A,等，TIG.(1996)，12:5-10 ；Skinern, A.，等，国际 PCT 公布说明书N0.WOOO / 22113，Conrad，国际 PCT 公布说明书 N0.WOOO / 22114，和 Conrad，美国专利N0.6，054，299)。可以引入这些转基因作为线性构建体、环状质粒或病毒载体，其可作为转基因被结合和遗传整合入宿主基因组中。可以构建该转基因以使其作为染色体外质粒被遗传(Gassmann,等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1995) 92: 1292)。
[0193]dsRNA的各链可以通过两个分离的表达载体上的启动子转录并共转染入靶细胞中。或者dsRNA的各链可 以通过均位于相同表达质粒上的启动子转录。在一个实施方式中，dsRNA表示为通过连接多核苷酸序列连接的反向重复，以至dsRNA具有茎和环结构。
[0194]重组dsRNA表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。表达dsRNA的病毒载体可以基于以下非限制性的病毒构建:腺伴随病毒(综述见Muzyczka,等，Curr.Topics Micr0.Tmmunol.(1992) 158:97-129))、腺病毒(例如参见 Berkner,等，BioTechniques (1998) 6:616)， Rosenfeld 等(1991， Science252:431-434)和 Rosenfeld 等(1992)， Cell68:143-155))、或甲病毒以及本领域已知的其他病毒。在体外和/体内已经用逆转录病毒将各种基因引入许多不同的细胞类型包括上皮细胞中(例如参见Eglitis，等，Science(1985) 230:1395-1398 ；Danos 和 Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1998) 85:6460-6464 ;Wilson 等，1988，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:3014-3018 ;Armentano 等，1990，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:61416145 ；Huber 等，1991，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:8039-8043 ；Ferry 等，1991，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:8377-8381 ；Choffdhury 等，1991，Science254:1802-1805 ；van Beusechem.等，1992, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:7640-19 ；Kay 等，1992, Human Gene Therapy3:641-647 ；Dai 等，1992, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10892-10895 ;Hwu 等，1993，J.1mmunol.150:4104-4115 ;美国专利 N0.4,868，116 ;美国专利 N0.4，980，286 ；PCT 申请 W089 / 07136 ；PCT 申请 W089 / 02468 ；PCT 申请 W089 / 05345 ；和PCT申请W092 / 07573)。能够转导并表达插入细胞基因组中的基因的重组逆转录病毒载体可以通过将重组逆转录病毒基因组转染入适当的包装细胞系例如PA317和Ps1-CRIP来制备(Comette 等，1991, Human Gene Therapy2:5-10 ；Cone 等，1984, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6349)。重组腺病毒载体可用于感染易感宿主(例如大鼠、仓鼠、狗和黑猩猩)中的多种细胞和组织(Hsu等，1992，J.1nfectious Disease, 166:769)，并且也具有不需要有丝分裂活性细胞进行感染的优点。
[0195]可以使用能够接受要表达的dsRNA分子的编码序列的任何病毒载体，例如源自腺病毒(AV);腺伴随病毒(AAV);逆转录病毒(例如慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒)；疱疹病毒等的载体。病毒载体的向性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原假型包装载体，或视情况通过取代不同的病毒衣壳蛋白来改变。
[0196]例如，本发明的慢病毒载体可以用选自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、Mokola病毒等的表面蛋白来假型包装。可以通过工程化载体以表达不同的衣壳蛋白血清型来使本发明的AAV载体靶向不同细胞。例如，在血清型2基因组上表达血清型2衣壳的AAV载体称为AAV2 / 2。该AAV2 / 2载体中的血清型2衣壳基因可以由血清型5衣壳基因取代，从而生成AAV2 / 5载体。表达不同的衣壳蛋白血清型的AAV载体的构建技术在本领域技术人员范围之内；例如参见Rabinowitz J E等(2002)，J Virol76 =791-801,其全部公开内容以引用方式合并于此。
[0197]适用于本发明的重组病毒载体的选择、向载体中插入用于表达dsRNA的核酸序列的方法和递送病毒载体到目标细胞的方法在本领域技术人员的范围之内，例如参见 Dornburg R(1995), Gene Therap.2:301-310 ；Eglitis M A(1988), Biotechniques6:608-614 ；Miller A D(1990),Hum Gene Therap.1:5-14 ；Anderson W F(1998),Nature392:25-30 ;和Rubinson D A等，Nat.Genet.33:401_406，其全部公开内容以引用方式合并于此。
[0198]病毒载体可以源自于AV和AAV。在一个实施方式中，本发明的dsRNA以来源于重组AAV载体的两个分离、互补的单链RNA分子表示，所述载体例如具有U6或HlRNA启动子，或巨细胞病毒(CMV)启动子。
[0199]用于表达本发 明的dsRNA的适当的AV载体、构建重组AV载体的方法和将载体递送入靶细胞的方法描述在Xia H等(2002), Nat.Biotech.20:1006-1010中。
[0200]用于表达本发明的dsRNA的适当的AAV载体、构建重组AV载体的方法和将载体递送入靶细胞的方法描述在 Samulski R 等(1987)，J.Virol.61:3096-3101 ；Fisher K J 等(1996)，J.Virol, 70:520-532 ；Samulski R 等(1989)，J.Virol.63:3822-3826 ;美国专利N0.5，252，479 ;美国专利N0.5，139，941 ;国际专利申请N0.W094 / 13788 ;和国际专利申请N0.W093 / 24641中，其全部公开内容以引用方式合并于此。
[0201]驱动dsRNA在本发明的DNA质粒或病毒载体中表达的启动子可以是真核RNA聚合酶I (例如，核糖体RNA启动子),RNA聚合酶II (例如，CMV早期启动子或肌动蛋白启动子或UlsnRNA启动子)或通常是RNA聚合酶III启动子(例如U6snRNA或7SK RNA启动子)或原核启动子，例如T7启动子，条件是表达质粒也编码由T7启动子转录所需的T7RNA聚合酶。启动子也可将转基因表达引导至胰腺(例如参见，用于胰腺的胰岛素调节序列(Bucchini等，1986，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:2511-2515))。
[0202]另外，转基因表达可以例如通过使用诱导型调节序列和表达系统(例如对某些生理调节剂例如循环葡萄糖水平或激素敏感的调节序列)来精确调节(Docherty等，1994,FASEB J.8:20-24)。适于控制转基因在细胞或在哺乳动物中表达的这种诱导型表达系统包括通过蜕皮激素、通过雌激素、黄体酮、四环素、二聚化化学诱导物和异丙基-β-Dl-硫代半乳糖苷(EPTG)来调节。基于dsRNA转基因的预定用途，本领域技术人员将能选择适当的调节/启动子序列。
[0203]通常，能够表达dsRNA分子的重组载体如下文所述递送并存在于靶细胞中。或者，可以使用导致dsRNA分子的瞬时表达的病毒载体。根据需要，可以重复施用这些载体。一旦表达，dsRNA与目标RNA结合并调节其功能或表达。表达dsRNA的载体的递送可以是全身性的，例如通过静脉或肌内施用，通过施用至从病人移出的靶细胞，然后再引入病人，或者通过允许引入所需靶细胞的任何其他方法。
[0204]通常将sRNA表达DNA质粒作为与阳离子脂质载体(例如Oligofectamine)或非阳离子脂质基载体(例如Transit-ΤΚΟΤΜ)的复合物转染入靶细胞中。本发明也可预期在一周或更长时期内用于针对单个TTR基因或多个TTR基因不同区域的dsRNA介导的降低(knockdowns)的多次脂质转染。载体向宿主细胞中的成功引入可以通过使用多种已知方法来监控。例如，瞬时转染可用报道子例如荧光标记物、例如绿色荧光蛋白(GFP)来显示。细胞在体外的稳定转染可通过使用使转染细胞具有对特定环境因素(例如抗生素和药物)的抗性例如潮霉素B抗性的标记物来确保。
[0205]TTR特异性dsRNA分子也可插入载体并用作人类患者的基因治疗载体。基因治疗载体例如可通过静脉注射、局部施用(参见美国专利5，328，470)或通过立体定位注射(例如参见 Chen 等(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:3054-3057)递送给受试者。基因治疗载体的药物制剂可以包含可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或可以包含其中包埋有基因递送载体的缓释基质。或者，当完整的基因递送载体例如逆转录病毒载体可以由重组细胞完整地产生时，所述药物制剂可以包含产生基因递送系统的一种或多种细胞。[0206]II1.包含dsRNA的药物组合物
[0207]在一个实施方式中，本发明提供含有本文所述的dsRNA和药学可接受的载体的药物组合物。所述含有dsRNA的药物组合物用于治疗与TTR基因的表达或活性有关的疾病或病症，例如由TTR表达介导的病理过程。这样的药物组合物基于递送方式来配制。一个例子是为了经由非肠道递送例如通过静脉(IV)递送进行全身施用而配制的组合物。另一个例子是用于直接递送到脑实质，例如通过输注到脑，如通过连续泵输注而配制的组合物。
[0208]本发明的药物组合物以足以抑制TTR基因表达的剂量施用。
[0209]通常，dsRNA的适当剂量为每天每公斤接受者体重0.01到200.0mg,通常在每天每公斤体重I到50mg范围内。例如dsRNA可以每单剂量0.0059mg / kg、0.01mg / kg、0.0295mg / kg、0.05mg / kg、0.0590mg / kg、0.163mg / kg、0.2mg / kg、0.3mg / kg、
0.4mg / kg、0.5mg / kg、0.543mg / kg、0.5900mg / kg、0.6mg / kg、0.7mg / kg、0.8mg /kg、0.9mg / kg、Img / kg、1.1mg / kg、L2mg / kg、1.3mg / kg、L4mg / kg、1.5mg / kg、
1.628mg / kg、2mg / kg、3mg / kg、5.0mg / kg、10mg / kg、20mg / kg、30mg / kg、40mg /kg 或 50mg / kg 施用。
[0210]在一个实施方式中，剂量为0.01到0.2mg / kg。例如，dsRNA可以以下剂量施用:0.01mg / kg、0.02mg / kg、0.3mg / kg、0.04mg / kg、0.05mg / kg、0.06mg / kg、0.07mg / kg、0.08mg / kg、0.09mg / kg、0.1Omg / kg、0.1lmg / kg、0.12mg / kg、0.13mg /kg、0.14mg / kg、0.15mg / kg、0.16mg / kg、0.17mg / kg、0.18mg / kg、0.19mg / kg 或
0.20mg / kgo
[0211]在一个实施方式中，剂量为0.005mg / kg到1.628mg / kg。例如，dsRNA可以0.0059mg / kg、0.0295mg / kg、0.0590mg / kg、0.163mg / kg、0.543mg / kg、0.5900mg /kg或1.628mg / kg的剂量施用。[0212]在一个实施方式中，剂量为0.2mg / kg到1.5mg / kg。例如，dsRNA可以以下剂量施用:0.2mg / kg、0.3mg / kg、0.4mg / kg、0.5mg / kg、0.6mg / kg、0.7mg / kg、0.8mg /kg、0.9mg / kg、Img / kg、1.1mg / kg、L2mg / kg、1.3mg / kg、L4mg / kg 或 1.5mg /
kg o
[0213]所述药物组合物可以一天施用一次，或者dsRNA可以在全天以适当间隔分两个、三个或更多个亚剂量施用，或者甚至使用连续输注或通过控释制剂递送。在这种情况下，各亚剂量中含有的dsRNA必须相应变小，以达到每日总剂量。也可以混合剂量单元，以在几天内递送，例如，使用在几天时期内提供dsRNA的持续释放的传统持续释放制剂。持续释放制剂是本领域熟知的，且对在特定部位递送试剂特别有用，例如可以用于本发明的试剂。在该实施方式中，剂量单元包含相应的多个每日剂量。
[0214]单剂量对TTR水平的影响是长期的，这样以不超过3、4或5天的间隔，或以不超过
1、2、3或4周的间隔，或以不超过5、6、7、8、9或10周的间隔施用后续剂量。
[0215]本领域技术人员了解某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前的治疗、受试者的总体健康和/或年龄以及存在的其他疾病。而且，用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包含单次治疗或一系列治疗。本发明包括的各dsRNA的有效剂量和体内半衰期的估计可以通过使用传统方法或者根据如本文其他地方所述的使用适当动物模型的体内试验来进行。
[0216]小鼠遗传学的进展产生了许多用于研究各种人类疾病例如由TTR表达介导的病理过程的小鼠模型。这些模型用于dsRNA的体内试验，以及用于确定治疗有效剂量。适当的小鼠模型例如是，含有 表达人TTR的质粒的小鼠。另一种适当的小鼠模型是携带表达人TTR的转基因的转基因小鼠。
[0217]由细胞培养试验和动物研究获得的数据可被用于制定供人使用的剂量范围。本发明的组合物的剂量通常在包含ED50但几乎没有或没有毒性的循环浓度范围内。基于使用的剂型和使用的施用途径，剂量可以在该范围内改变。对于用于本发明方法的任何化合物，治疗有效剂量可以最初从细胞培养试验评估。可以在动物模型中制定剂量以达到该化合物的循环血浆浓度范围，或者，适当时，达到目标序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，达到降低的多肽浓度)，该范围包含在细胞培养中测定的IC50(即，达到症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。这种信息可用于更精确地确定人类的有用剂量。血浆水平例如可以通过高效液相色谱法测定。
[0218]本发明的dsRNA可以与能有效治疗由靶基因表达介导的病理过程的其他已知药剂联合使用。在任何情况下，开业医师可以根据使用本领域已知或本文描述的标准效果测定观察到的结果来调整dsRNA施用的剂量和时机。
[0219]MM
[0220]本发明也包括含有本发明的dsRNA化合物的药物组合物和制剂。基于是需要局部还是全身治疗以及基于治疗区域，本发明的药物组合物可以多种方式施用。施用可以是局部的，经肺的，例如，通过粉末或气雾剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器；经气管的，经鼻的，表皮和透皮的，经口或非肠道的。肠胃外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉注射或输注；或颅内，例如，实质内、鞘内或室内施用。
[0221]可以以靶向特定组织例如肝脏(例如，肝脏肝细胞)的方式递送dsRNA。[0222]本发明包括可以通过直接注射入脑而递送的药物组合物。所述注射可以是通过立体定位注射入脑的特定区域(例如，黑质、皮层、海马、纹状体或内侧苍白球)，或dsRNA可以递送到中枢神经系统的多个区域(例如，递送到脑的多个区域，和/或递送到脊髓)。也可以将dsRNA递送到脑的扩散区域(例如扩散递送至脑皮层)。
[0223]在一个实施方式中，靶向TTR的dsRNA可以通过一端已植入组织中的套管或其他递送装置递送，所述组织例如，脑，例如，脑的黑质、皮层、海马、纹状体、胼胝体或内侧苍白球。所述套管可以与dsRNA组合物的贮药库相连。可通过泵，例如渗透泵或小型真空泵，例如Alzet泵(Durect, Cupertino, CA),调节流动或递送。在一个实施方式中，泵和忙药库植入在远离组织的区域中，例如，植在腹部，通过从泵或贮药库引到释放位点的导管实现递送。dsRNA组合物向脑中的输注可以持续几小时或几天,例如,持续1、2、3、5或7天或更长。用于递送到脑的装置例如在美国专利Nos.6，093, 180和5，814，014中描述。
[0224]用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末剂。传统的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或需要的。涂层避孕套、手套等也是有用的。适当的局部制剂包括本发明dsRNA与局部递送剂混合的那些制剂，所述局部递送剂例如是脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂。适当的脂质和脂质体包括中性的(例如，二油酰基磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性的(例如二肉豆蘧酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如，二油酰基四甲基氨基丙基甘油DOTAP和二油酰基磷脂酰乙醇胺D0TMA)。本发明的DsRNA可以包封于脂质体内，或可以形成与脂质体、特别是与阳离子脂质体的复合物。或者，dsRNA可以和脂质特别是阳离子脂质复合。适当的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蘧酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油基1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1,烷基酯(例如，肉豆蘧酸异丙酯IPM)、甘油一酯、甘油二酯或其药学可接受盐。局部制剂详细描述在美国专利N0.6，747, 014中，其以引用方式合并于此。
[0225]脂质体制剂
[0226]除了已被研究并用于药物制剂中的微乳剂外，还存在许多组织化的表面活性剂结构。其中包括单层、胶束、双层和囊泡。囊泡例如脂质体因为其特异性和其在药物递送方面提供的持久作用，因而吸引了巨大兴趣。如本发明所使用，术语“脂质体”指的是由以一个或多个球状双层排列的两性脂质组成的囊泡。
[0227]脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂性的材料形成的膜和水性内部。水性部分包含要递送的组合物。阳离子脂质体具有能够融合至细胞壁的优点。尽管不能与细胞壁有效融合，但非阳离子脂质体在体内被巨噬细胞吞噬。
[0228]为了透过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适当的透皮梯度的影响下透过一连串细孔，每个孔的直径小于50nm。因此，需要使用高度可变形并能透过这种细孔的脂质体。
[0229]脂质体的其他优点 包括:由天然磷脂获得的脂质体是可生物相容且可生物降解的；脂质体可以结合大量水和脂质可溶解的药物；脂质体可以保护其内在小室中包封的药物免受代谢和降解(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger andBanker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumel, p.245) ? 制备脂质体制剂的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的含水量。
[0230]脂质体可用于转移和递送活性成分到作用部位。因为脂质体膜的结构类似于生物膜，当脂质体应用于组织时，脂质体开始与细胞膜融合，随着脂质体和细胞融合的进行，脂质体内容物注入细胞中，其中活化剂可以起作用。
[0231]脂质体制剂作为许多药物的递送方式已经成为广泛研究的焦点。越来越多的证据表明，对于局部施用，脂质体存在着优于其他制剂的优点。这些优点包括与施用药物的高度全身吸收有关的副作用减少、施用药物在所需靶标上的积聚增加、以及能够将多种药物包括亲水性和疏水性药物施用于皮肤。
[0232]若干报告详述了脂质体将包括高分子量DNA的试剂递送入皮肤的能力。包括止痛剂、抗体、激素和高分子量DNA的化合物已经施用于皮肤。大多数应用导致靶向上表层。
[0233]脂质体分成两个主要类别。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其和带负电荷的DNA分子相互作用以形成稳定络合物。带正电荷的DNA /脂质体络合物结合至带负电荷的细胞表面并内化于内体中。由于内体中的酸性pH，脂质体破裂，释放其内容物到细胞质中(Wang 等，Biochem.Bio phys.Res.Commun.，1987,147,980-985).[0234]对pH敏感的或带负电荷的脂质体诱捕DNA而不是含有其的络合物。因为DNA和脂质两者所带的电荷相似，因此发生排斥而不是络合物形成。然而，一些DNA在这些脂质体的含水内部被诱捕。PH敏感的脂质体用于递送编码胸苷激酶基因的DNA到培养中的细胞单层。在祀细胞中检测到外源基因的表达(Zhou等，Journal of Controlled Release, 1992,19,269-274)。
[0235]脂质体组合物的一种主要类型包括天然衍生的磷脂酰胆碱以外的磷脂。例如，中性脂质体组合物可以由二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)组成。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蘧酰磷脂酰甘油组成，而阴离子融合脂质体主要由二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)例如大豆PC和蛋PC组成。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
[0236]若干研究评价了脂质体药物制剂向皮肤的局部递送。将包含干扰素的脂质体应用到豚鼠皮肤，导致皮肤疱疹得分的减少，而经由其他手段(例如，作为溶液或作为乳剂)递送干扰素则无效(Weiner 等，Journal of Drug Targeting, 1992, 2,405-410)。此外，另一研究测试了作为脂质体制剂部分施用的干扰素和使用含水体系施用干扰素的效果，并断定脂质体制剂优于含水施用(du Plessis 等，Antiviral Research, 1992,18, 259-265)。
[0237]还检测了非离子脂质体系统(特别是含有非离子型表面活性剂和胆固醇的系统)以测定其在将药物递送至皮肤中的用途。含有Novasome?〗(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂酰醚)和NOVaSOmeTMII (二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子脂质体制剂用于递送环孢菌素-A到鼠皮肤的真皮。结果显示这种离子脂质体系统能有效促进环孢菌素-A沉淀到不同皮肤层中(Hu等S.T.P.Pharma.Sc1.，1994，4，6,466)ο
[0238]脂质体也包括“空间稳定的”脂质体，本文使用的该术语指的是当脂质结合入脂质体时，含有一种或多种特定脂质的脂质体相对于缺乏这种特定脂质的脂质体具有提闻的循环有效期。空间稳定脂质体的例子是这样的脂质体:其中脂质体的囊泡形成脂质部分的一部分(A)包含一种或多种糖脂，例如单唾液酰神经节苷脂Gmi，或(B)由一种或多种亲水性聚合物衍生化，例如聚乙二醇(PEG)部分。不愿被任何特定理论束缚，本领域认为，至少对于包含神经节苷脂、鞘磷脂、或PEG-衍生化脂质的空间稳定脂质体来说，这些空间稳定脂质体的提高的循环半衰期是由于向网状内皮系统(RES)细胞内的摄入减少(Allen等，FEBSLetters,1987,223,42 ；ffu 等，Cancer Research,1993,53,3765)。
[0239]含有一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。Papahadjopoulos等(Ann.N.Y.Acad.Sc1.，1987，507，64)报导了单唾液酰神经节苷脂Gm1、硫酸半乳糖脑苷脂和磷酯酰肌醇提高脂质体的血液半衰期的能力。这些发现也由Gabizon等详细说明(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，1988，85，6949)。美国专利 N0.4，837，028 和 W088 / 04924(均属于 Alien等)公开了含有⑴鞘磷脂和⑵神经节苷脂Gmi或硫酸半乳糖脑苷酯的脂质体。美国专利N0.5，543，152 (Webb等)公开了含有鞘磷脂的脂质体。W097 / 13499(Lim等)公开了含有1，2-sn- 二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱的脂质体。
[0240]含有由一种或多种亲水性聚合物衍生化的脂质的许多脂质体及其制备方法是本领域已知的。Sunamoto等(Bull.Chem.Soc.Jpn., 1980, 53, 2778)描述了含有非离子型去污剂2C1215e的脂质体，该去污剂含有PEG部分。Illum等(FEBS Lett.，1984，167，79)注意到聚苯乙烯颗粒和聚乙二醇的亲水性包衣导致血半衰期的显著提高。Sears描述了通过结合聚亚烷基二醇(例如PEG)的羧基而修饰的合成磷脂(美国专利Nos.4，426，330和4,534,899)。Klibanov 等(FEBS Lett.，1990，268，235)描述的实验证实了含有用 PEG 或PEG硬脂酸酯衍生的磷酯酰乙醇胺(PE)的脂质体具有显著提高的血循环半衰期。Blume等(Biochimica et Biophysica Acta, 1990,1029,91)将这一发现扩展到其他 PEG-衍生憐月旨，例如由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG形成 的DSPE-PEG。在其外表面具有共价结合的PEG部分的脂质体在欧洲专利N0.EP0445131B1和Fisher的W090 / 04384中描述。含有1-20摩尔百分比的用PEG衍生的PE的脂质体组合物及其使用方法由Woodle等(美国专利Nos.5，013，556和5，356，633)和Martin等(美国专利N0.5，213，804和欧洲专利N0.EP0496813B1)描述。含有若干其他脂质-聚合物偶联物的脂质体在W091 / 05545和美国专利N0.5，225，212 (两者均属于Martin等)以及W094 / 20073 (Zalipsky等)中描述。含有PEG-修饰的神经酰胺脂质的脂质体在W096 / 10391 (Choi等)中描述。美国专利 N0.5，540，935 (Miyazaki 等)和美国专利 N0.5，556，948 (Tagawa 等)描述了含有 PEG 的脂质体，其表面可进一步用官能部分衍生化。
[0241]含有核酸的若干脂质体是本领域已知的。Thierry等的W096 / 40062公开了用于在脂质体中包封高分子量核酸的方法。Tagawa等的美国专利N0.5，264，221公开了蛋白键合的脂质体，并声称这种脂质体的内容物可以包含dsRNA。Rahman等的美国专利N0.5，665，710描述了在脂质体中包封寡脱氧核糖核苷酸的某种方法。Love等的W097 /04787公开了含有靶向raf基因的dsRNA的脂质体。
[0242]传递体是另一种类型的脂质体，其是高度可变形的脂质集合体，是药物递送载体的重要候选者。传递体可以描述为脂质小滴，其是如此高度可变形因此它们能够容易地穿透小于所述小滴的小孔。传递体适合于使用它们的环境，例如，它们是自优化(适应皮肤小孔的形状)、自修复、不间断地频繁到达其靶标以及通常自装载。为制备传递体，可以将表面边缘活化剂，通常是表面活性剂添加到标准的脂质体组合物中。传递体用于递送血清清蛋白到皮肤。传递体介导的血清清蛋白的递送显示和含有血清清蛋白的溶液的皮下注射一样有效。
[0243] 表面活性剂在制剂例如乳剂(包括微乳剂)和脂质体中具有广泛应用。分类和排序许多不同种类的表面活性剂(天然和合成的)的性质的最常用的方法是使用亲水/亲油平衡(HLB)。亲水基(又名“头”)的性质提供用于分类制剂中使用的不同表面活性剂的最有用的方法(Rieger, in Pharmaceutical Dosage FormsiMarcel Dekker,Inc.,New York，N.Y.，1988，p.285)。
[0244]如果表面活性剂分子未离子化，它被归类为非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂在药物和化妆品产品中有着广泛应用，且可在很宽的PH值范围内使用。通常，取决于其结构，其HLB值为2到约18。非离子型表面活性剂包括非离子酯例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、失水山梨醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子的烷醇酰胺和醚例如乙氧基化脂肪醇、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段共聚物也包括在这种类型中。聚氧化乙烯表面活性剂是非离子型表面活性剂中最常用的成员。
[0245]如果表面活性剂分子溶解或分散在水中时，其携带负电荷，该表面活性剂归类为阴离子型。阴离子型表面活性剂包括羧酸酯，例如肥皂、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯例如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯、磺酸酯例如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯和磺基丁二酸酯，以及磷酸酯。阴离子型表面活性剂的最重要成员是烷基硫酸酯和肥皂。
[0246]如果表面活性剂分子溶解或分散在水中时，其携带正电荷，该表面活性剂被归类为阳离子型。阳离子型表面活性剂包括季铵盐和乙氧化胺。季铵盐是这种类型的最常用的成员。
[0247]如果表面活性剂分子能够携带正或负电荷，该表面活性剂被归类为两性的。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
[0248]药物、制剂以及乳剂中表面活性剂的使用已有综述(Rieger, in PharmaceuticalDosage Forms, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y.,1988, p.285)。
[0249]核酸脂质颗粒
[0250]在一个实施方式中，本发明的TTR dsRNA完全包封于脂质制剂中，例如，以形成SPLP, pSPLP、SNALP或其他的核酸-脂质颗粒。如本文所使用，“SNALP”指的是稳定的核酸-脂质颗粒，包括SPLP。如本文所使用，“SPLP”指的是含有包封于脂质囊泡内的质粒DNA的核酸-脂质颗粒。SNALP和SPLP通常包含阳离子脂质、非阳离子脂质和阻止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质偶联物)。SNALP和SPLP对于全身应用极其有用，因为它们在静脉(1.V.)注射后显示延长的循环有效期并聚集在远端部位(例如，在物理上与施用部位分离的部位)。SPLP包括“pSPLP”，其含有PCT公布说明书N0.W000 / 03683中所列的包封的缩合剂-核酸络合物。通常本发明颗粒的平均直径为约50nm到约150nm，更通常为约60nm到约130nm,更通常为约70nm到约IlOnm,最通常为约70nm到约90nm,且基本上无毒。另外，当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时，水溶液中的核酸抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒及其制备方法描述在例如美国专利Nos.5，976，567 ;5，981，501 ;6，534，484 ;6，586，410 ；6，815，432 ;和 PCT 公布说明书 N0.W096 / 40964 中。
[0251]在一个实施方式中，脂质与药物的比例(质量/质量比)(例如，脂质与dsRNA的比例)将为约1:1到约50: 1、约1:1到约25: 1、约3: I到约15: 1、约4: I到约10: 1、约5: I到约9: I或约6: I到约9: I。
[0252]阳离子脂质例如可以是，N, N-二油烯基-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2，3-二油氧基)丙基)_N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)_N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N，N-二甲基-2，3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)、1，2-二亚油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、I, 2-二亚麻基氧基-N, N-二甲基氨基丙烷(I, 2_DiIinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane) (DLenDMA)、1，2-二亚油基氨基甲酸氧基-3- 二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1，2-二亚油基氧基-3-( 二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1，2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1，2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1，
2-二亚油基硫代-3- 二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基_2_亚油基氧基_3_ 二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、l，2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TMA.Cl)、I，2- 二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TAP.Cl)、I，2- 二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N，N-二亚油基氨基)-1，2-丙二醇(DLinAP)、
3-(N，N- 二油基氨基)-1，2-丙二醇(DOAP) ,1,2- 二亚油基氧代_3_ (2-N, N- 二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1，2- 二亚麻基氧基-N，N- 二甲基氣基丙烷(DLinDMA)、2，2- 二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[I，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR，5s，6aS)-N，N- 二甲基-2, 2- _.((9Z, 12Z)_ 十八碳-9,12- 二稀)四氧-3aH-环戍[d] [1,3] 二氧戍环-5-胺(ALNlOO)、4-( 二甲基氨基)丁酸(6Z，9Z，28Z，31Z)_ 庚三十碳-6，9，28，31-四烯-19-基酯(MC3)、1，1' -(2-(4- (2- ((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基亚氨基)双十二烷-2-醇(Tech Gl)或其混合物。阳离子脂质可以占存在于颗粒中的总脂质的约20mol%到约50mol%或约40mol%。
[0253]在另一个实施方式中，化合物2，2- 二亚油基-4- 二甲基氨基乙基-[I，3] - 二氧戊环可用于制备脂质-siRNA纳米颗粒。2, 2- 二亚油基-4- 二甲基氨基乙基-[I，3]- 二氧戍环的合成描述在2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61 / 107,998中，其以引用方式合并于此。
[0254]在一个实施方式中，脂质-siRNA颗粒包含40%的2，2-二亚油基-4- 二甲基氨基乙基-[1，3]_ 二氧戊环:10%DSPC: 40%胆固醇:10% PEG-C-DOMG(摩尔百分比)，粒径为63.0±20nm，且siRNA /脂质比例为0.027。
[0255]非阳离子脂质可以是阴离子脂质或中性脂质，包括但不限于:二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰-磷酯酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷酯酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷酯酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蘧酰磷酯酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、16-0- 一甲基PE、16-0- 二甲基PE、18-1-反PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。非阳离子脂质可以占存在于颗粒中的总脂质的约5mol %到约90mol %、约lOmol1^、或约5811101% (如果包括胆固醇的话)。
[0256]抑制颗粒聚集的偶联脂质例如可以是聚乙二醇(PEG)脂质，包括但不限于:PEG- 二酰甘油(DAG)、PEG- 二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA偶联物例如可以是PEG-二月桂基氧基丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蘧基氧基丙基(Ci4)、PEG-二棕榈基氧基丙基(Ci6)或PEG-二硬脂基氧基丙基(Ci8)。抑制颗粒聚集的偶联脂质可以占存在于颗粒中的总脂质的Omol %到约2011101%或约
[0257]在一些实施方式中，核酸-脂质颗粒还包含胆固醇，例如是存在于颗粒中的总脂质的约 IOmol %到约 6011101%或约 4811101?^
[0258]LNPOl
[0259]在一个实施方式中，可用类脂质(lipidoid)ND98.4Ηα(Μ?1487)(通式I)、胆固醇(Sigma-Aldrich)和 PEG-神经酸胺 C16 (Avanti Polar Lipids)制备脂质-siRNA 纳米颗粒(即LNPOl颗粒)。各自在乙醇中的原液可以如下制备:ND98,133mg / ml ;胆固醇，25mg /ml，PEG-神经酰胺C16，IOOmg / ml。然后例如以42: 48: 10的摩尔比混合ND98、胆固醇和PEG-神经酰胺C16原液。混合的脂质溶液可以与水性siRNA(例如，在pH5的乙酸钠中)混合，这样乙醇的最终浓度约为35-45%且乙酸钠的最终浓度约为100-300mM。一旦混合，脂质-siRNA纳米颗粒通常自发形成。取决于所需的粒径分布，生成的纳米颗粒混合物可以使用例如热熔挤出机例如Lipex挤出机(Northern Lipids公司)挤压通过聚碳酸酯膜(例如，IOOnm截值)。在一些情况下，挤出步骤可以省略。除去乙醇和同时的缓冲液更换可以伴随着例如透析或切向流过滤。缓冲液可以例如用pH约7、例如pH约6.9、pH约
7.0、pH约7.1、pH约7.2、pH约7.3或pH约7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)更换。
[0260]
【权利要求】
1.用于抑制运甲状腺素蛋白(TTR)表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有义链和反义链，所述反义链含有与编码运甲状腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互补的区域，其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸，所述反义链含有SEQ ID NO:170,SEQ IDNO:450, SEQ ID NO:730或SEQ ID NO:1010的15或更多个连续核苷酸。
2.权利要求1的dsRNA，其中所述有义链含有SEQID NO:169、SEQ ID NO:449、SEQ IDNO:729或SEQ ID NO:1009的15或更多个连续核苷酸。
3.权利要求1的dsRNA，其中所述有义链由SEQID NO:449组成，所述反义链由SEQ IDNO:450 组成。
4.权利要求1的dsRNA，其中所述有义链由SEQID NO:729组成，所述反义链由SEQ IDNO:730 组成。
5.权利要求1的dsRNA，其中所述有义链由SEQID NO:1009组成，所述反义链由SEQID NO:1010 组成。
6.权利要求1的dsRNA，其中所述dsRNA含有选自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有义链和选自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反义链。
7.权利要求1或2或6的dsRNA，其中所述互补区域的长度是19个核苷酸。
8.权利要求1或2或6的dsRNA，其中所述互补区域由SEQID NO:169组成。
9.权利要求1或2或6的dsRNA，其中所述dsRNA的各链长度是19、20、21、22、23或24个核苷酸。
10.权利要求1或2或6的dsRNA，其中各链长度是21个核苷酸。
【文档编号】C12N15/113GK103937793SQ201410053075
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2009年10月20日 优先权日:2008年10月20日
【发明者】D·W·萨, G·辛克尔, R·阿尔瓦雷兹, S·米尔斯泰恩, 陈庆敏 申请人:阿尔尼拉姆医药品有限公司