一种产Kdo2-lipidA的基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种产Kdo2-lipidA的基因工程菌及其构建方法和应用，属于遗传工程领域。所述基因工程菌为WJW00，所述基因工程菌为无抗性E.coliW3110△rfaD，其中rfaD发生缺失突变失活。本发明构建的菌株Kdo2-lipidA结构正确，生长状况良好，没有引入任何外源抗性基因序列，更有利于大规模工业化生产。
【专利说明】—种产Kdo2-1 ipidA的基因工程菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种产KdO2-1ipidA的基因工程菌及其构建方法和应用，是一种无抗性的Kdo2-1ipidA大肠杆菌生产菌。
技术背景
[0002]Kdo2-1ipidA是体现革兰氏阴性菌毒力的疏水性成分，其可以被宿主免疫细胞表面的TLR4/MD2所识别，是感染宿主的毒力因子。随着人们对其致病机制的深入研究，脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、Kdo2_lipidA和类脂 A广泛用于动物免疫实验。Kdo2-1ipidA携带类脂A毒力因子，可以达到刺激细胞相同的反应，但是通过基因工程构建的类脂A结构菌株只能在低温下生长，且生长状况非常差。通过化学降解方法提取类脂A的过程繁琐，成本又高。而LPS具有较多缺点，如分子较大，在反应体系中分散不均一，并且细胞刺激反应前后LPS不易于被检测等。而Kdo2-1ipidA分子较小，分散均一，也易被ESI/MS等方法检测。同时，I μ gKdo2-lipidA相当于10 μ gLPS所引起的反应,而且同样实验反应的花费也仅为LPS的一半。因此，通过基因工程构建一株可以产Kdo2-1ipidA的大肠杆菌可以解决上述问题。目前，Kdo2-1ipidA的生产菌主要是WBB06菌株。现有菌株的缺点在于:第一、WBB06生长状态较野生型差很多，最终菌体量少；第二、WBB06菌带有氨苄青霉素和四环素抗性标记；第三、WBB06的基因组序列并不清晰，即遗传背景不清楚。本发明是构建了一株不带任何抗性标记，遗传背景很清晰，且生长状况较好的生产Kdo2-1ipidA的大肠杆菌基因工程菌。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种无任何抗性标记，生长状况良好的产Kdo2-1ipidA的新型基因工程菌，以适应大规模生产。
[0004]为解决上述技术问题，本发明提供的基因工程菌为E.coliW3110 Λ rfaD,即WJW00，其中rfaD发生缺失突变失活。
[0005]本发明还提供了一种构建上述基因工程菌的方法，将人工构建的rfaD敲除片段电转化入含PKD46质粒的E.coliff3110,获得突变株E.coliff3110 ΔrfaD-Fkan,再化转入PCP20质粒，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；去除PCP20质粒后获得无抗性产Kdo2-1ipidA的基因工程菌。
[0006]所述位点特异性重组为FLP酶介导的FRT位点特异性重组，最终42°C培养去除PCP20质粒，获得无抗性 产Kdo2-1ipidA的基因工程菌。
[0007]所述rfaD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
[0008]SEQINN0.1:
[0009]tccgttacac cttcagcaac ggttttgaac ggtttgtcgt aacccgccgc gcgcagattt 60
[0010]gtcagatctg cctgagtgaa cgcctgatag cggcctttca gtttatccgg gaacggaatg 120
[0011]tattcgatct ggcctttctt gtgataagcc agcgtagcat cagctaccgc ctggaaggat 180
【权利要求】
1.一种产Kdo2-1ipidA的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为无抗性E.coliW3110 ArfaD，其中rfaD发生缺失突变失活。
2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤: 将人工构建的rfaD敲除片段电转化入含pKD46质粒的E.coliff3110,获得突变株E.Co I iW3110 ArfaD-Fkan，再化转入pCP20质粒，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；去除PCP20质粒后获得无抗性产Kdo2-1ipidA的基因工程菌。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于位点特异性重组为FLP酶介导的FRT位点特异性重组，最终42oC培养去除pCP20质粒，获得无抗性产Kdo2-1ipidA的基因工程菌。
4.权利要求2或多所述的方法，其特征在于所述rfaD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示。
5.权利要求1所述基因工程菌在发酵生产Kdo2-1ipidA的应用。
6.权利要求5所述的应用，其特征在于以权利要求1构建的基因工程菌为生产菌株，采用常规发酵后，对Kdo2-1ipidA进行提取，提取方法为:收集发酵后的菌体，0.1MNaCl溶液洗漆菌体一次后用Bligh-Dyer —相体系76mL悬浮菌体,磁力搅拌lh,2000rpm离心30min分相，取上相，弃沉淀，加入20mL氯仿和20mLl.0MNaCl溶液配成Bligh-Dyer 二相体系，2000rpm离心30min,取下相 移入旋蒸瓶中，旋转蒸发；最后加入氯仿/甲醇溶液(2:1, v/v)将Kdo2-1ipidA洗出；所述Bligh-Dyer—相体系成分为氯仿/甲醇/1.0MNaCl溶液体积比为 1:2:0.8。
【文档编号】C12N1/21GK103820377SQ201410052649
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月17日 优先权日:2014年2月17日
【发明者】王小元, 王建莉, 马文渐, 王洲, 李烨 申请人:江南大学