一种玉米珠心原生质体的制备和转化方法
【专利摘要】本发明公开了一种玉米珠心原生质体的制备和转化方法，涉及细胞工程领域。本发明是取授粉后6天到8天的玉米珠心组织，高渗处理后酶解，然后再用含0.55M甘露醇的MMG溶液重悬，制得珠心原生质体；最后采用PEG诱导转化。本发明操作简单，制备珠心原生质数量大、活性高，原生质细胞转化效率高，为后续基因功能分析，特别是有关细胞程序化死亡机理解析提供有力的技术支持。
【专利说明】一种玉米珠心原生质体的制备和转化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞工程领域，尤其涉及的是一种玉米珠心原生质体的制备和转化方法。
【背景技术】
[0002]植物原生质体指去除细胞壁并被质膜所包围的具有生活力的细胞。其结构包括细胞膜、细胞质和细胞核等部分。植物原生质体去除了细胞壁的保护，因而较易从外界摄入病毒、细菌、细胞器、细胞核、蛋白质、核酸等。植物原生质体这些特点，使其在基础理论研究及生物工程技术中都有重要利用。[0003]原生质体的制备主要包括材料选择、材料预处理及原生质体的分离等过程。通常选用植物幼嫩组织作为原生质体制备材料，如幼根、子叶下胚轴、子叶、根及根毛等。研究表明不同组织原生质体的制备效率存在差异，如子叶原生质体制备效率高于叶、子叶下胚轴及根的原生质体制备。原生质体的分离前，通常会对材料进行预处理。材料预处理目的主要是改变细胞和细胞壁的生理状态，提高细胞壁酶解的效率，减少原生质体损伤的。高渗处理及暗处理是材料预处理常用的方法，如在紫罗兰原生质体制备时，将下胚轴先甘露醇高渗处理，再进行酶解，可提高原生质体制备效率。原生质体的分离主要有两种方式:机械分离法及酶解分离法。相对于机械分离法而言，酶解分离法是大量分离原生质体的常用方法。酶解分离原生质体中，纤维素酶和果胶酶是酶解过程中主要两种酶。纤维素酶主要用于酶解植物细胞壁主要成分纤维素，而果胶酶主要是用于分离酶解后原生质体细胞。在植物原生质体制备过程中，多种因素响原生质体的制备效率，包括材料细胞壁的厚度，酶解液渗透压，酶解时间，酶解过程中摇晃速度等情况。
[0004]植物原生质体的转化通常指原生质体细胞吸收外源核酸等，为外源核酸等提供一个行使功能的场所。原生质体的转化是进行下一步试验，特别是基因功能研究等试验的重要步骤。PEG (polyethyleneglycol)诱导转化植物原生质体是较早发现并利用较多的试验，PEG浓度过高过低都不利于原生质体的转化，PEG浓度过高会加快原生质体的融合，浓度过低转化效率也很低，并且PEG中加入MgCl2能提高原生质体的转化效率。利用电击仪电击原生质体是另外一种原生质体转化方法，M.Nishiguchi试验首次利用电击转化实验将烟草花叶病毒RNA转化到了原生质体中。R.M.Hauptmann等在双子叶和单子叶植物中原生质体的电击转化系统进行了探索。此外，显微注射转化原生质体也是方法之一。目前，以上三种转化方法在原生质体的转化上都有利用，而对不同的实验内容及实验目的，为提高原生质体转化效率，需选择适合本身试验的最佳转化方法及体系。
[0005]植物原生质体制备和转化技术最为常见也最为成熟的是叶片原生质体的制备。叶片原生质体制备相关实验技术，在对目的蛋白进行亚细胞定位、蛋白活性、蛋白与蛋白间相互作用及基因调控都有很好利用。Lee，Y.等利用拟南芥叶片原生质体技术，借助于荧光标记蛋白GFP，鉴定了 At0EP7蛋白跨膜区及C端7个氨基酸在靶定到叶绿体中的重要作用。Worley, C.K.利用烟草叶片原生质体等技术，证明生长素响应因子PSIAA6参与生长素信号调控，该蛋白的降解为信号传导过程中的必须过程。ShuichiYanagisawa等利用拟南芥叶片原生质体相关技术，进一步阐明了转录因子EIN3参与了葡萄糖和乙烯相互作用信号的传递。
[0006]虽然叶片原生质体的利用在基础理论研究中取得了巨大成功，但对不同生理过程及代谢途径而言，叶片原生质体并不是通用载体对象。
[0007]珠心是高等植物胚囊周围的一种特殊组织。珠心在胚囊的发育过程中起了重要作用。研究报道，珠心的降解主要是为胚及胚乳提供营养物质，珠心停止降解将会导致胚乳发育的停止。珠心也是植物细胞程序化死亡研究的理想组织，珠心组织降解过程中存在着多种细胞程序化死亡方式，这对深入研究细胞程序化死亡机理具有重要意义。目前，对胚乳发育过程了解较为详细，但对胚乳发育调控研究还不清楚；同时，植物细胞程序化死亡机理的研究仍不清楚。珠心原生质体的制备及转化相关实验技术的利用将会为解决相关科学问题提供有力的技术支撑。
[0008]至今，国内外还未曾发现有对珠心细胞原生质体的制备及转化相关研究报道，由于珠心材料的特殊性，使其原生质体制备与转化都与叶片原生质体制备有所不同。同时，相对于其他植物而言，玉米珠心组织发育成熟后寿命较长，组织较大，易于分析，因此选用玉米珠心组织为对象，对玉米珠心原生质体的制备及转化条件进行摸索。该试验技术的成功探索，将为其他植物珠心原生质体的制备及转化提供借鉴，同时为研究玉米胚囊发育及细胞程序化死亡提供技术支撑。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种玉米珠心原生质体的制备和转化方法。
[0010]本发明的技术方案如下:
[0011]一种玉米珠心原生质体的制备方法，其步骤如下:
[0012](I)在授粉后6天到8天，取玉米珠心组织2g，加入20mL浓度为0.6M的甘露醇高渗暗处理10分钟，去除甘露醇后加入20mL酶解液，立即用真空泵在压力
0.04xl05Pa-0.05xl05Pa之间抽真空30min，然后酶解，酶解条件是28°C恒温摇床，80rpm黑暗情况下摇4-6小时，在摇的过程中，隔一小时用手来回晃荡两次，使其充分酶解；
[0013](2)将(I)中酶解后的珠心混合液加入W5溶液终止酶解反应后，80g水平离心3min,弃去上清，用4mL含0.55M甘露醇的MMG溶液重悬，重悬液转移至5mL的EP管中自然放置30分钟；然后弃去上清，保留下面沉淀，再用2mL含0.55M甘露醇的MMG溶液重悬，制得珠心原生质体；
[0014]所述的酶解液如下表所示:[0015]
【权利要求】
1.一种玉米珠心原生质体的制备方法，其特征是，其步骤如下: (1)在授粉后6天到8天，取玉米珠心组织2g，加入20ml浓度为0.6M的甘露醇高渗暗处理10分钟，去除甘露醇后加入20ml酶解液，立即用真空泵在压力0.(MxlO5Pa-0.05xl05Pa之间抽真空30min，然后酶解，酶解条件是28°C恒温摇床，80rpm黑暗情况下摇4_6小时，在摇的过程中，隔一小时用手来回晃荡两次，使其充分酶解； (2)将(I)中酶解后的珠心混合液加入W5溶液终止酶解反应后，80g水平离心3min，弃去上清，用4mL含0.55M甘露醇的MMG溶液重悬，重悬液转移至5mL的EP管中自然放置30分钟；然后弃去上清，保留下面沉淀，再用2mL含0.55M甘露醇的MMG溶液重悬，制得玉米珠心原生质体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述酶解液如下表所示:
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述W5溶液如下表所示:
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述0.55M甘露醇的MMG溶液如下表所示:
5.根据权利要求1所述的制备方法制得的玉米珠心原生质体的转化方法，其特征在于，在离心管中加入10μ g质粒DNA，其体积不超过20 μ 1，再加入玉米珠心原生质体100 μ L,轻轻混合；然后采用PEG诱导转化,加入W5溶液终止转化过程后，80g水平离心3min,弃去上清，用500 μ L含0.55Μ甘露醇的MMG溶液重悬培养，培养12小时后进行相应试验分析。
【文档编号】C12N15/82GK103789252SQ201410052434
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月17日 优先权日:2014年2月17日
【发明者】黄玉碧, 张军杰, 陈江, 刘汉梅, 胡育峰, 刘应, 余国武, 顾勇 申请人:四川农业大学