黄瓜est-ssr分子标记的制作方法
【专利摘要】本发明公开了黄瓜EST-SSR分子标记，该方法以15个黄瓜种或品种的基因组DNA模板为研究对象，根据公布的黄瓜EST序列，采用Primer3.0引物设计软件，设计EST-SSR引物。经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出4个具有多态性的EST-SSR分子标记SSR003357、SSR005987、SSR003154和SSR9473。本发明可应用于黄瓜的种群遗传结构和遗传变异水平等的研究。
【专利说明】黄瓜EST-SSR分子标记
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种黄瓜EST-SSR分子标记。
【背景技术】
[0002]黄瓜sativus L.)是一种在全球范围内均有栽培的葫芦科蔬菜作物,我国黄瓜的种植面积和生产总量均排名世界第一，其栽培面积已占世界黄瓜总体栽培面积的50%。
[0003]尽管黄瓜地理分布范围广，但其遗传背景却较为狭窄，同工酶、RFLP、RAPD、AFLP等标记技术难以在黄瓜育种中提供大量有效的遗传信息，不利于黄瓜有基因的发掘与利用。
[0004]从表达序列标签(expressedsequence tag, EST)中开发 SSR 标记(EST-SSR)是近年来发展起来的新型分子标记，与基因组SSR相比，其免去了文库的构建和大量的序列测定，节约了时间和经费，具有高效、低花费的特点。同时，EST作为基因转录本的一部分，更易获得基因表达的信息，可为功能基因的直接鉴定提供重要依据。
[0005]目前，已相继在葡萄、大豆、甘蔗、水稻、番茄和小麦等物种均已开展了 EST-SSR标记的研究。与这些物种相比，黄瓜EST-SSR标记开发滞后，目前仅利用少量黄瓜EST序列开发了一些SSR引物，标记数量不足，限制了黄瓜的分子遗传学研究。因此，迫切需要获取更多EST-SSR标记以进行黄瓜遗传多样性和系谱认证等方面的研究和应用。
[0006]为开发更多的标记，本发明利用GeneBank公布的黄瓜EST序列以及MISA软件寻找SSR位点，合成了 30 对引物，经15个不同基因型黄瓜筛选，得到4个具有多态性的通用型标记。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题在于:开发黄瓜EST-SSR分子标记，提供多态性引物，建立黄瓜EST-SSR标记开发的技术体系，为黄瓜的遗传背景分析提供更多新的EST-SSR标记，弥补目前黄瓜EST-SSR标记较为缺乏的不足。
[0008]本发明解决技术问题的技术方案:根据公布的黄瓜EST序列，设计EST-SSR引物，经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出4个具有多态性的EST-SSR分子标记。4个黄瓜分子标记的编号为:SSR003357、SSR005987、SSR003154、SSR9473，其核苷酸序列分别如SEQID N0.1，SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.3，SEQ ID N0.4 所示。
[0009]4 个 EST-SSR 分子标记 SSR003357，SSR005987，SSR003154，SSR9473 的引物序列分别为:
SSR003357-F:CGTTGAAAGATCAAGGGCAT
SSR003357-R:GAATCCGCGATTACAGAAGC
SSR005987-F:GGCAGTGCTTCCTCTACTCC
SSR005987-R:TTCACATGGATCTCAAGGCA
SSR003154-F:ATGTCTGTGAGATGCGATGGSSR003154-R:CTCTTCGTCAAGTTCCTCCG
SSR9473-F: GATATCAAGCCGTCGCAGAT
SSR9473-R: GGAAGGCGTTGGACAATAAA。
[0010]本发明可应用于黄瓜的种群遗传结构和遗传变异水平等的研究。
[0011]
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是EST-SSR标记SSR003357变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
图2是EST-SSR标记SSR005987变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
图3是EST-SSR标记SSR003154变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
图4是EST-SSR标记SSR009473变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果。
[0013](1-15分别表不:中农9号，中农29号，佳园玲珑春，新津研4号，翠玉黄瓜，唐山秋瓜，白叶三，春秋黄瓜，麻皮老黄瓜， 日本小黄瓜，荷兰小黄瓜，美国小黄瓜，西双版纳型，华南型栽培种，华北型栽培种)
【具体实施方式】
实施例1:黄瓜EST-SSR标记引物的设计
开发引物所用的黄瓜EST序列来自GenBank (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)。采用Primer 3.0软件设计引物，引物设计的总体原则为:SSR序列的开始和结束位置分别距5’和3’端不少于50bp ;引物长度18~25bp ;Tm值52.0~60.(TC，而且上游和下游引物的Tm值相差不大于5°C ；GC含量40%~60% ；PCR扩增产物长度100~300bp ;尽量避免引物二级结构以及连续6个碱基配对的出现。引物设计完成以后，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，共合成30对EST-SSR引物，见下表:
【权利要求】
1.一种黄瓜EST-SSR分子标记,其特征在于,所述EST-SSR分子标记的标号分别为:SSR003357、SSR005987、SSR003154、SSR9473，其核苷酸序列分别为:
SSR003357:
CGTTGAAAGATCAAGGGCATTTATGGAGGTTGAATAATAAGTATGGTGTGAGAGCAATTTCGTCTCATCACAACAAGCTTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCGAAGTCTTCAGCTTCTGTAATCGCGGATTCCSSR005987:
GGCAGTGCTTCCTCTACTCCATCTTCACCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTAATTCACCTTATTCTCTTATGGGTTTCATCCTTACGCTGCTACCTTTCTATGCCTTGAGATCCATGTGAASSR003154:
ATGTCTGTGAGATGCGATGGCGATTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCGCGGCTGTGGATTCCAATTTTTGACGCCAAGGTGTTCCGGAGGAACTTGACGAAGAGSSR9473:
GATATCAAGCCGTCGCAGATTCCGTCGTTAATAAATTCAAGAAGGTTATTTCTTTGCTTGACCGCAACAGAACCGGCCATGCTCGTTTCAGAAGGGCTCCGGTTCTTACAACTACTACTACTACTACTACTCCGCCTCCTCCTCCTCCGCCAAAGGTCAAGCCCCAGCATCAAGATCCGAGTTCGTCGTCTCCGATTTCGGTACCTCCGGTTCAAGTAAAGAAACAAGAATCAGTTTCTGCTTTTAAGGTTTATTGTCCAACGCCTTCC。
2.根据权利要求1所述的黄瓜EST-SSR分子标记，其特征在于:所述的SSR003357、SSR005987, SSR003154, SSR9473四个位点的引物序列为:
SSR003357-F:CGTTGAAAGATCAAGGGCAT
SSR003357-R:GAATCCGCGATTACAGAAGC
SSR005987-F:GGCAGTGCTTCCTCTACTCC
SSR005987-R:TTCACATGGATCTCAAGGCA
SSR003154-F:ATGTCTGTGAGATGCGATGG
SSR003154-R:CTCTTCGTCAAGTTCCTCCG
SSR9473-F:GATATCAAGCCGTCGCAGAT
SSR9473-R:GGAAGG CGTTGGACAATAAA。
【文档编号】C12N15/11GK103740712SQ201410052097
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年2月17日 优先权日:2014年2月17日
【发明者】胡丽芳, 段紫英, 刘世强, 黄长干, 贺浩华, 刘秋圆, 贺晓鹏 申请人:江西农业大学