用于检测h7n9亚型流感病毒的引物组合及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于检测H7N9亚型流感病毒的引物组合及含有所述引物组合的检测试剂盒。所述引物组合包括特异性扩增H7N9亚型流感病毒HA基因的引物对（Seq?ID?No.1和2）以及特异性扩增H7N9亚型流感病毒NA基因的引物对（Seq?ID?No.3和4）。两对PCR引物可在同一PCR反应管里同时进行扩增，实现双重检测，经优化后可在5小时内完成H7N9亚型流感病毒HA和NA基因的快速分子鉴定，具有快速简便、特异性及灵敏度高、低成本、结果稳定等优点，对H7N9禽流感疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。
【专利说明】用于检测H7N9亚型流感病毒的引物组合及检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及H7N9亚型流感病毒的检测，具体地说，涉及一种用于检测H7N9亚型流感病毒的引物组合及含有所述引物组合的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]甲流病毒可引起鸟类和一些哺乳类动物的流感，属于正黏液病毒科。在鸟类中已经分离得到所有甲流病毒亚型病毒株，其中一些亚型可以在家禽及人类中引发严重的流感。
[0003]甲型流感病毒是负义单链RNA病毒,根据病毒薄膜表面血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA),可分为不同的亚型。目前已发现17种不同的血凝素(Hl到H17)和9种不同的神经氨酸酶(NI到N9)，所以理论上存在153种不同的组合。最新的H17抗原类型是2012年在果蝠中分离得到的。H7N9亚型禽流感病毒是其中的一种，以往仅在禽间发现，未发现过人的感染情况。
[0004]在H7N9病毒之前，已经有11种甲型流感病毒感染人类，它们分别是H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H5N2 和 H10N7。
[0005]2013年中国出现了人感染H7N9亚型禽流感病例。H7N9型禽流感是一种新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现。H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型流感病毒，尚未纳入我国法定报告传染病监测报告系统，且截至2013年4月初尚未有疫苗推出。被该病毒感染均在早期出现发热等症状，目前为止尚未证实此类病毒是否具有人传染人的特性。经调查，H7N9禽流感病毒基因来自于东亚地区野鸟和中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重配。截至2013年4月23日，全国共报告105例确诊病例，其中死亡21人，康复13人，其余71人正在各定点医疗单位接受救治。
[0006]对H7N9亚型流感病毒片段的重配研究结果显示，H7N9禽流感病毒的8个基因片段中，H7片段与浙江鸭群中分离的禽流感病毒相似，浙江鸭群中的病毒往上追溯，与东亚地区野鸟中分离的禽流感病毒基因相似；N9片段与东亚地区野鸟中分离的禽流感病毒相似。其余6个基因片段与H9N2禽流感病毒相似。据病毒基因组比对和亲缘分析显示，H9N2禽流感病毒来源于中国上海、浙江、江苏等地的鸡群。基因重配的发生地很有可能在中国的长三角地区，过程可能是亚欧大陆迁徙的野鸟(携带病毒)在自然迁徙过程中(经由韩国等东亚地区)和中国长三角地区的鸭群、鸡群携带的禽流感病毒进行基因重配而产生。鸭群、鸡群可能大量携带的禽流感病毒而不发病。
[0007]因此，开发一种快速简便、特异性及灵敏度高、低成本、结果稳定的H7N9亚型禽流感鉴定方法成为亟待解决 的问题。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种用于检测H7N9亚型流感病毒的引物组合及检测试剂盒。[0009]为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测H7N9亚型流感病毒的引物组合，所述引物组合包括特异性扩增H7N9亚型流感病毒HA基因的引物对I以及特异性扩增H7N9亚型流感病毒NA基因的引物对11。
[0010]引物对1:
[0011]H7F:5，-GGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGA-3，(Seq ID N0.1)
[0012]H7R:5，-GCCCCGAAGCTAAACCAAAGTAT-3，(Seq ID N0.2)
[0013]引物对I1:
[0014]N9F:5，-TCTGAATGTGTATGCCACAAC-3，(Seq ID N0.3)
[0015]N9R:5，-TGAGCCCTGCCAATTGTCCC-3，(Seq ID N0.4)
[0016]本发明还提供含有上述引物组合的用于检测H7N9亚型流感病毒的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0017]本发明还提供利用上述引物组合或检测试剂盒鉴定H7N9亚型流感病毒HA和NA基因的方法，该方法为:以待测样品核酸(如cDNA、DNA)为模板，采用上述引物组合对H7N9亚型流感病毒HA和NA基因进行PCR扩增(可在同一 PCR反应管内进行，实现双重检测)，然后采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当扩增产物出现132bp的特异性扩增条带(Seq ID N0.5)时判断为H7亚型HA基因，当扩增产物出现213bp的特异性扩增条带(SeqID N0.6)时判断为N9亚型NA基因。
[0018]PCR扩增体系为:模·板 4 μ L，2 X PCR扩增缓冲液 12.5 μ L，10 μ M Seq ID N0.1-4 引物各 luL，加 ddH20 至 25 μ L。
[0019]PCR扩增程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，61°C复性30s，72°C延伸30s，共35个循环；72°C延伸IOmin。
[0020]本发明设计了两对PCR引物分别特异性扩增H7N9亚型流感病毒HA和NA基因，两对PCR弓丨物可在同一 PCR反应管里同时进行扩增，实现双重检测，经优化后可在5小时内完成H7N9亚型流感病毒HA和NA基因的快速分子鉴定，具有快速简便、特异性及灵敏度高、低成本、结果稳定等优点，对H7N9禽流感疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为本发明实施例2中利用引物组合检测H7N9亚型流感病毒的特异性分析结果；其中，泳道I为H7N9亚型流感病毒样品，泳道2为HlNl亚型流感病毒样品，泳道3为H3N2亚型流感病毒样品，泳道4为H9N2亚型流感病毒样品，泳道5为纯化水样品对照，泳道6为不加模板的空白对照，泳道7为DNA Marker。
[0022]图2为本发明实施例3中利用引物组合检测H7N9亚型流感病毒的灵敏度分析结果；其中，泳道1-6为分别为样品A-F的PCR扩增产物，泳道7为DNA Marker,泳道8和9分别为样品G、H的PCR扩增产物，泳道10为阴性对照。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。[0024]以下实施例均按照常规实验条件，如SambiOOk等分子克隆实验手册(NewYork:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技术规程,或按照制造厂商所建议的实验条件。
[0025]实施例1用于检测H7N9亚型流感病毒的引物的合成
[0026]根据MEGA比对H7N9亚型流感病毒(来源于中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所)HA和NA基因序列的结果，用Primer Premier软件设计用于特异性扩增H7N9亚型流感病毒HA和NA基因的引物，并将设计的引物与Genbank中所有的禽流感病毒及病毒数据进行比对，利用Primer Premier进行引物设计时综合条件最优，进行BLAST时无其他序列配对情况。H7N9亚型流感病毒HA和NA的基因序列分别如Seq ID N0.8和9所示。
[0027]特异性扩增H7N9亚型流感病毒HA基因的PCR引物H7F和H7R，其碱基序列为:
[0028]H7F:5，-GGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGA-3，(Seq ID N0.1)
[0029]H7R:5，-GCCCCGAAGCTAAACCAAAGTAT-3J (Seq ID N0.2)
[0030]特异性扩增H7N9亚型流感病毒NA基因的PCR引物N9F和N9R，其碱基序列为:
[0031]N9F:5，-TCTGAATGTGTATGCCACAAC-3，(Seq ID N0.3)
[0032]N9R:5，-TGAGCCCTGCCAATTGTCCC-3J (Seq ID N0.4)
[0033]引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0034]实施例2利用引物组合检测H7N9亚型流感病毒的特异性分析
[0035]1.样本来源
[0036]本实施例中采用的H7N9亚型流感病毒毒株、HlNl亚型流感病毒毒株、H3N2亚型流感病毒毒株、H9N2亚型流感病毒毒株保存于中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所。
[0037]2.RNA的提取及cDNA的获得
[0038]在P3实验室内分别提取上述不同甲型流感病毒亚型毒株的RNA并反转录成cDNA。RNA 提取按 Simply P Total RNA Extraction Kit (BioFlux 公司、Cat#BSC52Ml)试剂盒说明书操作。采用M-MLV反转录酶(TaKaRa公司)建立如下反转录体系:提取的RNA30 μ L，反转录引物2 μ L。在75°C下反应5min，然后冰浴8min，置于冰上加入5 XMLV缓冲液12 μ L，dNTP (IOmM) 3 μ L, M-MLV 反转录酶 2.0 μ L，RNase 抑制剂 2.0 μ L，无 RNA 酶的 ddH209 μ L,42°C孵育90min，然后75°C 15min，进行反转录(反转录引物为5 ‘-AGCAAAAGCAGG-3’)。
[0039]3.PCR 反应
[0040]采用实施例1中合成的引物组合(Seq ID N0.1-4)分别对上述获得的模板cDNA中的HA和NA基因进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系(25 μ L体系)为:模板4 μ L，2 X TaqPCR MasterMix (TIANGEN公司、目录号:ΚΤ201) 12.5 μ L, 10 μ M Seq ID N0.1-4 引物各 I μ L，加水至25 μ L0 PCR反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，61°C复性30s，72°C延伸30s，共35个循环；72°C延伸IOmin0
[0041 ] 4.PCR产物电泳检测
[0042]取5 μ L上述PCR扩增产物，用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定，电泳结果见图1，图中从左至右，泳道I 为Η7Ν9亚型流感病毒样品，泳道2为HlNl亚型流感病毒样品，泳道3为Η3Ν2亚型流感病毒样品，泳道4为Η9Ν2亚型流感病毒样品，泳道5为纯化水样品对照，泳道6为不加模板的空白对照，泳道7为DNA Marker0结果显示第I泳道显示的两条特异性扩增条带分别为132bp (Seq ID N0.5)和213b (Seq ID N0.6)，鉴定为H7N9亚型流感病毒；第2-6泳道分别为HlNl亚型流感病毒、H3N2亚型流感病毒、H9N2亚型流感病毒、水及空白对照，没有出显条带；鉴定结果表明本发明的引物组合可特异地检测出H7N9亚型流感病毒。
[0043]实施例3利用引物组合检测H7N9亚型流感病毒的灵敏度分析
[0044]1.样品浓度
[0045]在P3实验室内对样品A (107EID50/0.1mL H7N9亚型流感病毒)进行10倍梯度分别稀释，稀释成B (106EID50/0.1mL H7N9亚型流感病毒)、C (105EID50/0.ImL H7N9亚型流感病毒)、D (IO4EID50A).1mL H7N9亚型流感病毒)、E (103EID50/0.1mL H7N9亚型流感病毒)、F (IO2EID5tlAXlmL H7N9 亚型流感病毒)、G (10EID50/0.1mL H7N9 亚型流感病毒)、H(lEID50/0.1mL H7N9亚型流感病毒)、I (空白对照)，并提取样品A-H的RNA，反转录成cDNA作为模板备用。
[0046]2.引物组合灵敏度检测
[0047]采用实施例1中合成的引物组合(Seq ID N0.1-4)分别对样品A-1的cDNA中的HA和NA基因进行PCR扩增。PCR扩增体系及扩增程序同实施例2。
[0048]3.结果
[0049]对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳检测结果如图2所示，图中从左至右，泳道1-6为分别为样品A-F的PCR扩增产物，泳道7为DNA Marker,泳道8和9分别为样品G、H的PCR扩增产物，泳道10为阴性对照。结果显示第1-6泳道出现两条特异性扩增条带分别为132bp (Seq ID N0.5)和213b (Seq ID N0.6)。利用本发明提供的引物组合可最低检测出102EID5Q/0.1mL H7N9亚型流感病毒。
[0050]虽然，上文中已经用一般性说明及具`体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.用于检测H7N9亚型流感病毒的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括特异性扩增H7N9亚型流感病毒HA基因的引物对I以及特异性扩增H7N9亚型流感病毒NA基因的引物对II ； 引物对1:
H7F:5’ -GGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGA-3，
H7R:5’ -GCCCCGAAGCTAAACCAAAGTAT-3’ ； 引物对II:
N9F:5’ -TCTGAATGTGTATGCCACAAC-3’
N9R:5’ -TGAGCCCTGCCAATTGTCCC-3’。
2.含有权利要求1所述引物组合的用于检测H7N9亚型流感病毒的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求2或`3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
【文档编号】C12Q1/70GK103866047SQ201410052165
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2013年4月27日
【发明者】金宁一, 田明尧, 鲁会军, 李昌, 李霄, 周博, 胡宁宁, 薛斐, 辛舒 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所