表达gm-csf重组prrsv弱毒疫苗株及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，该疫苗株包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组核酸，在该HuN4-F112基因组的ORF1b和ORF2a之间插入有GM-CSF序列，该GM-CSF序列为SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。本发明还公开了一种上述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的制备方法和应用。本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，不仅能够稳定表达GM-CSF，具有遗传稳定性，而且该重组表达GM-CSF的PRRSV弱毒疫苗株，可促使DC细胞活化和成熟，进而增强APC的抗原呈递能力，明显提高PRRSV弱毒疫苗的细胞免疫水平。
【专利说明】表达GM-CSF重组PRRSV弱毒疫苗株及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程【技术领域】，尤其涉及一种表达GM-CSF重组猪繁殖与呼吸综 合征病毒（PRRSV)弱毒疫苗株及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 目前，猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)被认为是当今养猪业最严重的传染病，已经对 我国乃至世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)感染后宿 主产生中和抗体和细胞免疫应答比较迟缓，造成了一定程度的免疫抑制。PRRSV在宿主体 内感染的靶细胞为肺泡巨噬细胞，在体外PRRSV也感染其他的免疫相关细胞，如单核源树 突状细胞、类浆细胞源树突状细胞等。树突状细胞（DC)是专业的抗原呈递细胞（APC)，在先 天性免疫和获得性免疫中发挥了重要的桥梁作用。有研究表明PRRSV感染DCs时能够干扰 DCs的表面分子的表达，从而抑制DCs发挥抗原呈递的功能。亦或是通过感染单核源DCs阻 碍IFN-alpha的翻译或其RNA的转运和加工，使得I型干扰素表达量下降。
[0003] 目前针对PRRSV病毒感染最有效地预防和控制措施是疫苗接种，而现阶段临床应 用针对PRRSV的疫苗主要有两大类，即灭活疫苗和弱毒疫苗。其中对于灭活疫苗其免疫效 果尚存争议，有人认为PRRSV灭活疫苗安全性好，但是由于PRRSV存在抗体依赖增强作用， 导致灭活疫苗在临床上的免疫效果低于期望值，也有人认为灭活疫苗能够针对同源PRRS 毒株产生良好的免疫保护，但是由于PRRSV易发生变异，导致灭活疫苗对于PRRS的异源毒 株防控效果较差。PRRSV弱毒疫苗在该病防控上发挥了重要作用，PRRSV弱毒疫苗不仅能提 供高水平的体液免疫，而且还能提供良好的细胞免疫，具有免疫效率高，免疫持续期长等优 势，相对于灭活疫苗而言弱毒疫苗在临床上应用更为普遍。但现有的PRRSV弱毒疫苗的使 用依然存在诱导产生中和抗体和细胞免疫应答较为迟缓或者水平较低，导致对PRRSV感染 早期有效控制做出快速免疫应答的效果不佳，从而影响了 PRRS疫苗的免疫效果。
[0004] 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)是一种具有多项潜能的造血生长因子， 属于一种细胞因子。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决现有PRRSV弱毒疫苗普遍存在诱导产生中和抗体和细胞免疫应答 较为迟缓或者水平较低、导致免疫效果不佳的技术问题，提供一种PRRSV弱毒疫苗株，该弱 毒疫苗株能稳定表达猪源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)，显著提高了 PRRSV弱 毒疫苗的免疫效果。
[0006] 此外，还需要提供一种上述PRRSV弱毒疫苗株的制备方法和应用。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0008] 在本发明的一个方面，提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，包含猪 繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组核酸，在该HuN4-F112基因组的 ORFlb和0RF2a之间插入有GM-CSF序列，该GM-CSF序列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列。
[0009] 优选的，所述插入的GM-CSF序列还连接有转录调控序列；更优选的，所述插入的 GM-CSF序列3'端还连接有猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF6转录调控序列（TRS6)，该转录调 控序列（TRS6)为SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列。
[0010] 在本发明的另一方面，提供了一种核酸分子，包含连接有转录调控序列的GM-CSF 序列，该GM-CSF序列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
[0011] 优选的，所述转录调控序列与GM-CSF序列3'端相连接，该转录调控序列为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0012] 在本发明的另一方面，还提供了一种核酸分子，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱 毒疫苗株HUN4-F112的基因组多核苷酸序列，在该HUN4-F112基因组序列的ORFlb和0RF2a 之间插入连接有转录调控序列的GM-CSF序列。
[0013] 在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述核酸分子的重组载体。
[0014] 在本发明的另一方面，还提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的制备 方法，包括以下步骤：
[0015] 构建包含一种核酸分子的重组载体，该核酸分子包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱 毒疫苗株HuN4-F112的基因组多核苷酸序列，在该HuN4-F112基因组序列的ORFlb和0RF2a 之间插入连接有转录调控序列的GM-CSF序列；
[0016] 将所述重组载体线性化后，体外转录成病毒RNA，再将该病毒RNA转染细胞；
[0017] 将转染的细胞进一步接种于细胞上培养，进行病毒拯救，获得重组表达GM-CSF的 猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株。
[0018] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株在 制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。
[0019] 在本发明的另一方面，还提供了一种区分上述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗 株与野毒株感染的检测试剂盒，包含：针对SEQ ID NO. 1所示插入基因序列设计的引物对。
[0020] 本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)弱毒疫苗株，不仅能够稳定表达 GM-CSF，具有遗传稳定性，而且重组表达GM-CSF的PRRSV弱毒疫苗株，可促使DC细胞活化、 成熟，进而增强APC的抗原呈递能力，明显提高PRRSV弱毒疫苗的细胞免疫水平。因此，本 发明的PRRSV弱毒疫苗株有望成为今后新型疫苗开发和临床应用的候选弱毒疫苗株。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0022] 图1是本发明实施例2拯救的病毒感染Marc-145细胞后的细胞病变图；
[0023] 图2是本发明实施例2重组病毒rHN4-GM-CSF的RT-PCR鉴定结果图；
[0024] 图3是本发明实施例2重组病毒rHN4-GM-CSF的Mlu I酶切鉴定结果图；
[0025] 图4是本发明实施例2重组病毒的间接免疫荧光鉴定结果图；
[0026] 图5是本发明实施例2重组病毒的Westernblotting鉴定结果图；
[0027] 图6是本发明实施例3重组病毒的生长曲线图；
[0028] 图7是本发明实施例3重组病毒的蚀斑形态观察图；
[0029] 图8是本发明实施例3的第5代、10代、15代和20代重组病毒的RT-PCR检测结 果图；
[0030] 图9是本发明实施例3重组病毒rHN4-GM-CSF遗传稳定性分析图；
[0031] 图10是本发明实施例3第20代重组病毒表达GM-CSF的IFA鉴定结果图；
[0032] 图11是本发明实施例4重组病毒rHN4-GM_CSF的功能分析柱状图。
【具体实施方式】
[0033] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物 学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京： 科学出版社，2004)中所述的方法进行。
[0034] 为了能进一步提高PRRSV弱毒疫苗的免疫效果，本发明通过分子生物学手段 对PRRSV商品化弱毒疫苗株HuN-F112的基因组进行设计和改造。PRRSV弱毒疫苗株 HuN-F112是本实验室通过将高致病性PRRSV强毒HuN4株体外传代致弱获得的减毒活疫 苗株，之前的大量临床实验证实HuN4-F112弱毒疫苗株具有很好的免疫保护力（专利号为 200810097546. 8的中国发明专利)。本发明在PRRSV弱毒疫苗HuN-F112株感染性分子克 隆(专利号为201010559005. X的中国发明专利)的基础上，通过融合PCR的方法在ORFlb和 0RF2a之间插入猪源GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)和PRRSV 0RF6转录调控序列 (TRS6)，获得了重组表达载体pHuN4-F112-GM-CSF，将重组载体用限制性内切酶Swa I线性 化后，通过体外转录获得病毒RNA，用脂质体法将病毒RNA转染BHK-21细胞，并在Marc-145 细胞进行病毒拯救，获得的重组病毒利用间接免疫荧光试验（IFA)和Western blotting分 析，结果表明本发明救获了一株能够表达猪源GM-CSF的重组病毒rHN4-GM-CSF。重组病 毒rHN4-GM-CSF的生长曲线和蚀斑形态分析，结果表明，该重组病毒的生物学特性与亲本 毒HuN4-F112基本一致，表明重组病毒表达猪源GM-CSF并不能影响病毒的复制。通过在 Marc-145上连续传代分析其遗传稳定性，结果显示该重组病毒可以稳定遗传，引入的猪源 GM-CSF未发生突变或缺失。进一步通过体外实验分析重组病毒表达猪源GM-CSF的生物学 功能，结果显示重组病毒作用骨髓源DC细胞，能够引起DC细胞表面分子⑶80/86、MHCI和 MHCII的显著表达，而亲本毒HuN4-F112要明显低于重组病毒rHN4-GM-CSF，表明本发明获 得的重组病毒rHN4-GM-CSF可促使DC细胞活化、成熟，进而有利于增强APC的抗原呈递能 力，提高弱毒苗的免疫效果，该重组病毒rHN4-GM-CSF可以作为今后新型疫苗开发和临床 应用的候选弱毒疫苗株。
[0035] 实施例1重组表达GM-CSF病毒全长cDNA克隆的构建
[0036] 1.材料与方法
[0037] 1. 1病毒株、细胞及载体
[0038] PRRSV疫苗株HuM-Fl 12由本实验室传代致弱并保存、感染性克隆 载体pSK-Hun4-F112、含有HuN4-F112株基因组ABC片段的质粒和EDF片段 的质粒（pSK-HuN4-F112-ABC和pSK-HuN4-F112-DEF)由本实验室构建并保存 (TongGZetal.，2007;Zhou YJ et al.，2008;周艳君等 2011;Zhang SR et al.，2011，质粒 pGM-CSF、BHK-21细胞，Marc-145细胞、抗PRRSVN蛋白单抗均由中国农科院上海兽医研究所 猪传染病研究室保存。
[0039] 1. 2主要试剂
[0040] RNA提取试剂盒RNeasy Plus Mini Kit购自QIAGEN公司；质粒小提试剂盒和胶回 收试剂盒购自上海华舜生物科技有限公司；DNA纯化回收试剂盒购置Omega公司；PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase 购自 Stratagene 公司；lexa Fluor?:568 goat anti-mouse lg G(H+L)和脂质体DMRIE-C购自Invitrogen公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶购自NEB 公司；体外转录试剂盒mMessage High Yield Capped RNA Transcription kit;AMV反转录 酶 RNA 酶抑制剂、Taq 酶、dNTP、DL-2000DNAMarker、DL-15000DNA Marker 均购自 TaKaRa 公 司；胎牛血清、opti-MEM?.培养基和高糖的DMEM培养基购自Gibco公司；其他化学试剂均 为进口或国产分析纯。
[0041] 1.3引物设计
[0042] 根据 PRRSV HuN4 株（GenBank 登录号：EF635006)基因序列，用 Primer5. 0 软件设 计了 3对引物F1/RUF2/R2以及F3/R3(见表1)。
[0043] 表1 :实验中用到的引物
[0044]
【权利要求】
1. 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，包含猪繁殖与呼吸综合征 病毒弱毒疫苗株HUN4-F112的基因组核酸，在该HUN4-F112基因组的ORFlb和0RF2a之间 插入有GM-CSF序列，该GM-CSF序列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述插 入的GM-CSF序列3'端还连接有猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF6转录调控序列，该转录调控 序列为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
3. 根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述 HuN4-F112基因组还包含标记性的Mlul限制性内切酶位点。
4. 一种核酸分子，其特征在于，包含连接有转录调控序列的GM-CSF序列，该GM-CSF序 列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
5. 根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述转录调控序列与GM-CSF序列3' 端相连接，该转录调控序列为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
6. -种核酸分子，其特征在于，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HUN4-F112 的基因组多核苷酸序列，在该HuN4-F112基因组序列的ORFlb和0RF2a之间插入有权利要 求4所述核酸分子的核苷酸序列。
7. -种包含权利要求4或6所述核酸分子的重组载体。
8. -种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： 构建包含权利要求6所述核酸分子的重组载体； 将所述重组载体线性化后，体外转录成病毒RNA，再将该病毒RNA转染细胞； 将转染的细胞进一步接种于细胞上培养，进行病毒拯救，获得重组表达GM-CSF的猪繁 殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株。
9. 权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗高致病 性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。
10. -种区分权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株与野毒株感染的检 测试剂盒，其特征在于，包含：针对SEQ ID NO. 1所示插入基因序列设计的引物对。
【文档编号】C12R1/93GK104152417SQ201410056557
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】童光志, 虞凌雪, 周艳君, 姜一峰, 童武, 于海, 李国新, 高飞 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所