一种代谢工程改造大肠杆菌产圣草酚的方法
【专利摘要】本发明公开了一种代谢工程改造大肠杆菌产圣草酚的方法，属于代谢工程领域。本发明通过基因工程技术，在大肠杆菌中将截去膜结合序列的黄酮3’羟化酶基因tF3’H和P450还原酶基因tCPR两个基因融合表达，成功实现了柚皮素转化圣草酚的步骤。同时表达来自R.glutinis的酪氨酸解氨酶基因TAL，P.crispum的4-香豆酸：辅酶A连接酶基因4CL，P.hybrida的査尔酮合成酶基因CHS和M.sativa的查尔酮异构酶基因CHI实现由酪氨酸直接生产柚皮素，从而构建得到由酪氨酸直接生产圣草酚的工程菌株。为进一步提高圣草酚产量，本发明敲除了大肠杆菌基因组中的乙酸激酶ackA基因，并过量表达乙酰辅酶A合成酶基因acs和乙酰辅酶A羧化酶基因ACC，最终圣草酚的产量可达106.7mg/L。
【专利说明】一种代谢工程改造大肠杆菌产圣草酚的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种代谢工程改造大肠杆菌产圣草酚的方法，属于代谢工程领域。
【背景技术】
[0002]近年来黄酮类化合物的抗氧化、抗炎、抗癌等对人类的保健和药用价值越来越得到科研人员的关注。以圣草酚为例，圣草酚具有抗菌抗炎的作用，在糖尿病的发病机制中起着至关重要的作用，可以抑制IgE/Ag诱导I型过敏反应，还具有止痛及温热作用。
[0003]尽管黄酮类物质对健康有众多益处，但该类物质的来源是其运用于保健医疗的的一个重大障碍。化学合成法多伴有有毒副产物和需要极端反应条件等不利因素，因而不利于大规模生产黄酮类物质。运用代谢工程技术改造大肠杆菌发酵生产圣草酚有望成为很好的解决方案。
[0004]采用代谢工程技术改造大肠杆菌，以酪氨酸为底物合成圣草酚在国内国外均未见报道。这主要是大肠杆菌内缺少P450单氧加酶家族的辅因子-P450还原酶以及P450细胞色素单氧加酶很难有效的可溶性表达。之前的研究，均以价格昂贵且微生物不能自身合成的咖啡豆酸(Caffeic acid)为底物合成圣草酹。Leonard等开发了从咖啡豆酸为底物的一条圣草酹代谢途径，他们在大肠杆菌中过量表达来自欧疗(Petroselinum cri spurn)的4CL，矮牵牛(Petunia X hybrid)的 CHS 和紫苜猜(Medicago sativa)的 CHI,以咖啡豆酸为底物成功获得了圣草酚产物。之后，研究人员在此途径基础上强化了丙二酰辅酶A代谢途径，使最终圣草酚产量达到了 114mg/L。
[0005]本发明，在L-酪氨酸合成柚皮素这一重要的黄酮骨干途径的基础上融合表达截去N端膜结合域的非洲菊(Gerbera hybrid)黄酮3’轻化酶(tF3’ H)和长春花(Catharanthus roseus)的P450还原酶(tC`PR),成功实现了属于P450单氧加酶家族的F3’H在大肠杆菌中的可溶性表达，使大肠杆菌能利用价格便宜且自身能够合成的酪氨酸为底物合成圣草酚。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的第一个技术问题是提供一种以酪氨酸为底物直接合成圣草酚的大肠杆菌基因工程菌，通过基因工程和代谢工程技术，在大肠杆菌内构建了由酪氨酸合成柚皮素的途径，并融合表达了截去膜结合序列的黄酮3’羟化酶基因tF3’ H和P450还原酶基因tCPR以实现由柚皮素向圣草酚转化的途径。
[0007]所述大肠杆菌基因工程菌是以敲除了基因组乙酸激酶ackA基因的大肠杆菌为宿主，过表达了乙酰辅酶A合成酶基因和乙酰辅酶A羧化酶基因，从而阻断乙酰辅酶A的醋酸盐副产物途径，增加转化丙二酰辅酶A的通量以强化丙二酰辅酶A途径。
[0008]所述乙酰辅酶A合成酶基因acs来自E.coli BL21 (DE3)基因组，乙酰辅酶A羧化酶基因acc (包括accBC和dtsRl两个基因)来自谷氛酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC13032)。所述乙酰辅酶A合成酶基因acs、乙酰辅酶A羧化酶accBC和乙酰辅酶A羧化酶dtsRl的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4所示，它们通过克隆到载体pRSFDuet-Ι (购自德国诺维信公司)，得到重组表达载体pRSF-acs-ACC,然后转化大肠杆菌进行表达。
[0009]所述大肠杆菌基因工程菌表达了融合基因tF3’H_tCPR，以实现柚皮素向圣草酚的转化。所述融合基因tF3’ H-tCPR的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，是截去膜结合序列的源于非洲菊(Gerbera hybrid)的黄酮3’轻化酶基因tF3’ H和长春花(Catharanthusroseus)的P450还原酶基因tCPR这两个基因的融合基因。所述tF3’H-tCPR基因通过克隆于pACYCDuet-Ι (购自德国诺维信公司)，得到重组质粒pACYC_tF3’ H-tCPR,然后转化大肠杆菌进行表达。
[0010]所述大肠杆菌基因工程菌还表达了来自粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶基因tal,来自欧疗(Petroselinum cri spurn)的4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl,来自矮牵牛(Petunia Xhybrid)的查尔酮合成酶基因CHS以及来自紫苜猜(Medicagosativa)的查尔酮异构酶基因chi，以实现酪氨酸向柚皮素的转化；编码所述TAL、4CL的基因通过克隆到载体P⑶FDuet-1 (购自德国诺维信公司)，得到P⑶F-TAL-4CL，编码所述CHS和CHI的基因通过克隆到载体pETDuet-Ι (购自德国诺维信公司)，得到pET-CHS-CHI。
[0011]本发明要解决的另一个技术问题是提供所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其主要步骤如下:
[0012](I)合成融 合基因tF3 ’ H-tCPR，连接载体pACYCDuet-Ι，得到重组表达载体pACYC-tF3，H-tCPR ；
[0013](2)敲除E.coli的乙酸激酶ackA基因，强化丙二酰辅酶A途径；
[0014](3)将编码乙酰辅酶A合成酶的基因和乙酰辅酶A羧化酶的基因克隆到载体pRSFDuet-Ι,构建重组表达载体pRSF-acs-ACC ；
[0015](4)将编码酪氨酸解氨酶的基因tal、4_香豆酸:辅酶A连接酶的基因4cl克隆到P⑶FDuet-1构建重组表达载体P⑶F-TAL-4CL，将编码查尔酮合成酶的基因chs以及查尔酮异构酶基因chi克隆到载体pET Duet-1构建重组表达载体pET-CHS-CHI ；
[0016](5)将重组表达载体 pACYC-tF3’ H-tCPR、pRSF-acs-ACC、pCDF_TAL_4CL 和pET-CHS-CHI 一起转化敲除了乙酸激酶ackA基因的E.coli BL21 (DE3)。
[0017]应用所述大肠杆菌基因工程菌发酵产圣草酚的方法，是将改造的工程菌株在25mLLB培养基中，于温度37°C、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以2%接种量转接到25mL发酵MOPS培养基中37°C培养，待菌种生长至OD6tltl=L 2-1.8时，添加新鲜的25mL发酵MOPS培养基和终浓度为0.6mM的IPTG诱导以及ImM的L-酪氨酸为底物，转至25°C低温诱导培养 48h。
[0018]所述发酵MOPS 培养基(/L):Κ2ΗΡ041.32mM、NH4C19.52mM、MgCl20.523mM、K2SO40.276mM、FeSO40.01mM, CaCl25 X 10_4mM、NaC150mM、M0PS40mM、Tricine4mM、(NH4) 6 (MO7) 243 X I(T6HiM、H3B034 X l(T4mM、CoC123 X l(T6mM、CuS04l(T5mM、MnCl28 X l(T5mM、ZnS0410_5mM、葡萄糖 5g,调节 pH 至 7.4。
[0019]本发明在L-酪氨酸合成柚皮素这一重要的黄酮骨干途径的基础上融合表达tF3’ H-tCPR，成功实现了以L-酪氨酸为底物合成圣草酚。之前的研究，均需要添加价格昂贵且大肠杆菌不能自身合成的咖啡豆酸为底物才能合成圣草酚。本发明以价格便宜且微生物能够自身合成的L-酪氨酸为底物合成圣草酚，降低了生产成本提高了经济效益，并且为将来进一步降低成本以葡萄糖为底物合成圣草酚奠定了基础。本发明为其他需要植物P450家族参与的羟基黄酮合成提供了一种有效的借鉴，使能够从L-酪氨酸甚至是葡萄糖这样的廉价底物出发获得更多种能运用于药品和营养化学品领域的高价值黄酮类物质。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1黄酮3’羟化酶和P450还原酶功能融合蛋白。截短和修饰的F3’ H和CPR被重命名为tF3’ H和tCPR，tF3’ H和tCPR通过PCR技术融合，tF3’ H-tCPR融合蛋白具有一段 Gly-Ser-Thr linker 序列。
[0021]图2圣草酚合成途径
[0022]A.圣草酹合成途径包括5个酶:来自R.glutinis的酪氨酸解氨酶TAL, P.crispum的4-香豆酸:辅酶A连接酶4CL, P.hybrida的查尔酮合成酶CHS, M.sativa的查尔酮异构酶CHI以及G.hybrid的黄酮3’羟化酶F3’ H和C.roseu的P450还原酶CPR融合蛋白。
[0023]B.强化丙二酰辅酶A途径包括三个酶:由C.glutamicum的accBC和dtsRl基因编码的乙酰辅酶A羧化酶ACC，E.coli的乙酰辅酶A合成酶ACS和敲除E.coliBL21 (DE3)的乙酸激酶AckA。
【具体实施方式】
[0024]圣草酚含量的测定方法:
[0025](I)样品处理:取发酵培养后发酵液25mL，转移入50mL EP管中，于液氮中冷冻后置于冷冻干燥机中冻干，冻干后加入25mL 二甲基亚砜(DMSO)复溶；5000rpm，4°C离心IOmin后取上清，经0.45 μ m过`滤膜过滤至液相瓶。
[0026](2)圣草酚及相应代谢物的测定:使用日本岛津LCMS-1T-T0F液相质谱联用仪检测。采用SHIM-PACKVP-ODS 150LX2.0柱子进行液相分离:流速0.2mL/min的梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，0minl0%B，10min40%B，15min60%B，17min 恢复到初始的 10%B。液相柱分离后，经电喷雾电离源(ESI)进入MS检测器，采用负离子模式检测，检测条件为:检测电压，1.60kV;雾化气体(N2)流量1.5L/min;干燥气体(N2)流量，200kPa;离子富集时间，30ms ;二级质谱(MS2)碰撞能量设置为40% ; 一级质谱(MS1)扫描范围为m/Z100-300 ；二级质谱(MS2)扫描范围为m/z50-300。多级检测模式(MRM)用于圣草酚及相应代谢物的定量定性。
[0027]实施例ltF3’ H-tCPR表达载体的构建
[0028]MLRC 二级结构预测方法分析黄酮3’羟化酶(F3’ H)的蛋白质二级结构，确定N端25aa可能为F3’ H的膜结合部位。设计引物以pUC57_F3’ H(F3’ H由南京金斯瑞公司密码子优化合成并克隆于PUC57载体，优化后F3’H序列见SEQ ID N0.5)为模板，PCR扩增得到
1.47kb的截去膜结合域、5’端带有NdeI限制性酶切位点、3’端带有Gly-Ser-Thr linker序列以及18bp CPR同源臂的目的基因tF3’H。以pUC57_CPR为模板(CPR由南京金斯瑞公司密码子优化合成并克隆于PUC57载体，优化后CPR序列见SEQ ID N0.6) PCR扩增得到大小1.94kb的截去膜结合域的目的基因、5’端带有Gly-Ser-Thr linker序列以及22bpF3’H同源臂和3’端带有KpnI限制性酶切位点的目的基因tCPR。再以此两目的基因为模板，融合PCR，得到大小为3.41kb的融合基因tF3’H-tCPR，融合基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。将融合基因tF3’H-tCPR克隆至质粒pACY⑶uet-Ι (购自德国诺维信公司)中，得到重组质粒 pACYC-tF3’ H-tCPR ο
[0029]实施例2强化丙二酰辅酶A途径的构建
[0030]利用Red同源重组敲除技术，敲除E.coli基因组中乙酸激酶基因(ackA)从而阻断乙酰辅酶A的醋酸盐副产物途径，增加转化丙二酰辅酶A的通量。以质粒pKD13(购自CGSChttp: //cgsc.biology, yale.edu/)为模板,经PCR得到1.40kb的两端带有乙酸激酶基因(ackA)上下游50bp同源臂的目的片段ackA::kan (序列见SEQ ID N0.7)。将ackA::kan片段电转化携带 pKD46 (购自 CGSChttp: //cgsc.biology, yale.edu/)的 E.coli BL21 (DE3)感受态细胞，由于敲除成功的菌株同源重组了 ackA::kan片段，重组菌对卡那霉素具有一定的抗性。经筛选得到能在卡那平板上生长的敲除菌株。提取此敲除菌株基因组，经PCR得到大小约为1.40kb的特异性条带，而以未经敲除操作的E.coli BL21 (DE3)基因组为模板进行PCR，没有产生特异性条带，说明乙酸激酶基因(ackA)已经从E.coliBL21(DE3)基因组中成功敲除。
[0031]由于本研究之后要用到卡那抗性、氨苄抗性和氯霉素的质粒，因此基因组中的卡那抗性以及Red系统的质粒必须需要消除。抗性基因的去除采用辅助质粒pCP20购自(CGSChttp://cRsc.biology, yale.edu/),经消除操作挑取单菌落至无抗性和含有卡那抗性、氨苄抗性和氯霉素的抗性平板，以验证抗性基因和PCP20、pKD46质粒是否成功去除。在无抗性平板上能生长，在卡那抗性、氨苄抗性和氯霉素平板上不能生长的即为成功消除抗性标记和Red系统质粒的敲除菌株。
[0032]以E.coli BL21(DE3)的基因组为模板，PCR得到1.96kb两端具有BamHI和NotI两个限制性酶切位点的目的片段acs(序列见SEQ ID N0.2)。以C.glutamicum ATCC13032的基因组为模板，PCR获得1.77kb两端具有EcoRV和KpnI限制性酶切位点的目的基因accBC(序列见SEQ ID N0. 3)，PCR扩增得到1.63kb两端具有KpnI和AvrII限制性酶切位点的的目的基因dtsRl (序列见SEQ ID N0.4)。将目的片段acs、accBC和dtsRl分别克隆至质粒pRSFDuet-Ι (购自德国诺维信公司)中，得到重组质粒pRSF-acs-ACC。
[0033]实施例3圣草酚工程菌的构建
[0034]将得到的重组表达载体pACYC_tF3 ’ H-tCPR和pRSF-acs-ACC与本实验室构建的 PCDF-TAL-4CL 和 pET-CHS-CHI (构建方法参见文献:WuJ, Du G, Zhou J, Chen J.2012.Metabolic engineering of Escherichia coli for(2S)-pinocembrin production fromglucose by a modular metabolic strategy.Metab.Eng.16:48-55.)一起转化敲除的乙酸激酶ackA基因的E.coli BL21(DE3)，经抗性平板筛选和菌落PCR鉴定，得到圣草酚工程菌株。
[0035]实施例4发酵产圣草酚
[0036]发酵MOPS 培养基(/L) =K2HPO4L 32mM、NH4C19.52mM、MgCl20.523mM、K2SO40.276mM、FeSO40.01mM, CaCl25 X l(T4mM、NaC150mM、M0PS40mM、Tricine4mM、(NH4) 6 (MO7) 243 X l(T6mM、H3B034X l(T4mM、CoC123X l(T6mM、CuS04l(T5mM、MnCl28 X l(T5mM、ZnS04l(T5mM、葡萄糖 5g，调节pH 至 7.4。
[0037]工程菌株培养条件:改造的工程菌株在25mLLB培养基中，于温度37°C、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以2%接种量转接到25mL发酵MOPS培养基中37°C培养，待菌种生长至待0D_=1.2-1.8时，添加新鲜的25mL发酵MOPS培养基和终浓度为0.6mM的IPTG诱导以及ImM的L-酪氨酸为底物，转至25°C低温诱导培养48h。改造的工程菌株圣草酚产量达到106.7mg/L ;只含空质粒的对照组菌株圣草酚产量为O。
[0038]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准`。
【权利要求】
1.一种以酪氨酸为底物合成圣草酚的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，在大肠杆菌内构建了由酪氨酸合成柚皮素的途径，并融合表达了截去膜结合序列的黄酮3’羟化酶基因tF3’ H和P450还原酶基因tCPR以实现由柚皮素向圣草酚转化的途径。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，敲除了大肠杆菌基因组乙酸激酶ackA基因，过表达了乙酰辅酶A合成酶基因和乙酰辅酶A羧化酶基因以强化丙二酰辅酶A途径。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，乙酰辅酶A合成酶基因acs来自E.coli BL21(DE3)基因组，乙酰辅酶A羧化酶基因acc来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，通过表达来自粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶基因 tal,来自欧芳:(Petroselinum crispurn)的4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl,来自矮牵牛(Petunia X hybrid)的查尔酮合成酶基因CHS以及来自紫苜猜(Medicago sativa)的查尔酮异构酶基因chi,实现酪氨酸合成柚皮素的途径。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述tF3’H和tCPR的融合基因tF3’ H-tCPR的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，是截去膜结合序列的源于非洲菊(Gerbera hybrid)的黄丽 3’轻化酶基因 tF3’H 和长春花(Catharanthus roseus)的 P450还原酶基因tCPR的融合基因。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述tF3’H-tCPR基因通过克隆于pACYCDuet-Ι，得到重组质粒pACYC_tF3’ H_tCPR，然后转化大肠杆菌进行表达。
7.根据权利要求4所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，编码所述TAL、4CL的基因通过克隆到载体P⑶FDuet-1，得到P⑶F-TAL-4CL，编码所述CHS和CHI的基因通过克隆到载体 pETDuet -Ι，得到 pET-CHS-CHI。
8.根据权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A羧化酶基因acc包括accBC和dtsRl两个基因，所述基因acs、accBC和dtsRl的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示，它们通过克隆到载体pRSFDuet-1，得到重组表达载体pRSF-acs-ACC，然后转化大肠杆菌进行表达。
9.一种构建权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于，主要步骤如下: Cl)合成融合基因tF3’ H-tCPR，连接载体pACYCDuet-Ι，得到重组表达载体pACYC-tF3，H-tCPR ； (2)敲除E.coli的乙酸激酶ackA基因，强化丙二酰辅酶A途径； (3)将编码乙酰辅酶A合成酶的基因和乙酰辅酶A羧化酶的基因克隆到载体pRSFDuet-Ι,构建重组表达载体pRSF-acs-ACC ； (4)将编码酪氨酸解氨酶的基因tal、4-香豆酸:辅酶A连接酶的基因4cl克隆到P⑶FDuet-1构建重组表达载体P⑶F-TAL-4CL，将编码查尔酮合成酶的基因chs以及查尔酮异构酶基因chi克隆到载体pET Duet-1构建重组表达载体pET-CHS-CHI ； (5)将重组表达载体pACYC-tF3’H-tCPR、pRSF-acs-ACC、pCDF-TAL-4CL 和 pET-CHS-CHI一起转化敲除了乙酸激酶ackA基因的E.coliBL21 (DE3)。
10.一种应用权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌生产圣草酚的方法，其特征在于，是将工程菌株在25mL LB培养基中，于温度37°C、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以2%接种量转接到25mL发酵MOPS培养基中37°C培养，待菌种生长至OD6tltl=L 2-1.8时，添加新鲜的25mL发酵MOPS培养基和终浓度为0.6mM的IPTG诱导以及ImM的L-酪氨酸为底物，转至25°C低温诱导培养48h。`
【文档编号】C12R1/19GK103865864SQ201410076587
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月4日 优先权日:2014年3月4日
【发明者】陈坚, 周景文, 朱赛杰, 堵国成 申请人:江南大学