一种森林革蜱抗菌肽蛋白及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种森林革蜱抗菌肽蛋白及其制备方法，通过PCR方法从蜱虫cDNA文库中扩增出目的基因Ds-defensin，将其克隆到载体pGEX-6P-2上，在大肠杆菌BL21中原核表达，再通过GST标签亲和层析的方法获得纯化的森林革蜱抗菌肽蛋白。通过上述方式，本发明的森林革蜱抗菌肽蛋白及其制备方法，森林革蜱抗菌肽蛋白来自于一类特殊媒介昆虫，基因序列确定，能被准确克隆表达，分子量小，性质稳定，吸收容易，免疫原性查，不易被宿主中和降解，该方法制备成本低，得到的森林革蜱抗菌肽蛋白抗菌效果广泛并明显，为开发蜱虫传染疾病及其他抗菌药物的开发提供候选。
【专利说明】一种森林革蜱抗菌肽蛋白及其制备方法【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种森林革蜱抗菌肽蛋白及其制备方法。【背景技术】
[0002]抗菌肽，又称宿主防御肽，是由多种生物细胞特定基因编码的一类小分子裂解肽，通常只有几十到几百个氨基酸残基。抗菌肽在非特异性免疫系统中发挥着重要作用，它可以抵抗不同种类的病原菌，如真菌、病毒及一些细胞裂解酶等引起的感染，在人类研究中还具有抗肿瘤作用。抗菌肽多由唾液、体表黏液、循环系统和其它一些高位感染区分离得到。
[0003]森林革蜱存在于森林地区，成蜱的宿主一般是牛、马、绵羊、山羊、猪等家畜和野生动物，也侵袭人，幼蜱和若蜱的宿主一般是松鼠、花鼠、黑线姬鼠等啮齿类及野兔、刺猬等小型野生动物。蜱的唾液中包含有很多具有生物活性的唾液蛋白，具有如抗菌，抗凝血、抗过敏、抗淋巴细胞活化和增殖等活性。
【发明内容】
[0004]本发明主要解决的技术问题是提供一种森林革蜱抗菌肽蛋白及其制备方法，该方法制备成本低，得到的森林革蜱抗菌肽蛋白具有显著的抗菌性。
[0005]为解决上述技术问 题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种森林革蜱抗菌肽蛋白，所述森林革蜱抗菌肽蛋白的基因序列为:
ATGCGCGGACTTTGCATCTGCCTTGTCTTTATCCTTGTCTGTGGTCTTCTAACCGCCACGGCGGCCGTCCCG
GCTGAAAGCGAGGCGGCTCACCTCCGTGTTCGTCGAGGCTTCGGGTGCCCCCTGAACCAAGGCGCCTGTCACAACCA
CTGCCGCAGCATTCGGCGCCGAGGCGGCTACTGCTCTGGCATAATCAAGCAGACCTGCACCTGCTACAGGAATTAA。
[0006]在本发明一个较佳实施例中，所述森林革蜱抗菌肽蛋白有用于抗金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌或鼠伤寒沙门氏菌的用途。
[0007]在本发明一个较佳实施例中，所述森林革蜱抗菌肽蛋白的抗菌活性与所述森林革蜱抗菌肽蛋白的使用剂量有关。
[0008]在本发明一个较佳实施例中，所述森林革蜱抗菌肽蛋白有用于抗藤黄微球菌或铜绿假单胞菌的用途。
[0009]在本发明一个较佳实施例中，所述森林革蜱抗菌肽蛋白的制备方法的步骤为:通过聚合酶链反应方法从蜱虫cDNA文库中扩增出目的基因Ds-defensin，将所述目的基因Ds-defensin克隆到载体pGEX_6P_2上，在大肠杆菌BL21中原核表达得到森林革蜱抗菌肽蛋白，再通过GST标签亲和层析的方法获得纯化的森林革蜱抗菌肽蛋白。
[0010]本发明的有益效果是:本发明的森林革蜱抗菌肽蛋白及其制备方法，森林革蜱抗菌肽蛋白来自于一类特殊媒介昆虫，基因序列确定，能被准确克隆表达，分子量小，性质稳定，吸收容易，免疫原性查，不易被宿主中和降解，该方法制备成本低，得到的森林革蜱抗菌肽蛋白抗菌效果广泛并明显，为开发蜱虫传染疾病及其他抗菌药物的开发提供候选。【专利附图】
【附图说明】
[0011]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中:
图1是本发明的森林革蜱抗菌肽蛋白的表达纯化图；
图2是本发明的森林革蜱抗菌肽蛋白对金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗菌活性图，其中PBS、BSA、HBP分别为阴性对照；
图3是本发明的森林革蜱抗菌肽蛋白对藤黄微球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抗菌活性图，其中PBS、BSA、HBP分别为阴性对照。
【具体实施方式】
[0012]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0013]实施例一:PGEX-6P-2-Ds_defensin重组质粒的构建 (1)通过聚合酶链式反应PCR的方法从蜱虫cDNA文库中扩增出目的基因Ds-defensin，用Eco RI和Xho I双酶切，其中通过聚合酶链式反应方法PCR扩增出目的基因Ds-defensin的条件是:95°C下 3 min、95°C下 20s、57°C下 20s、72°C下 30s，35 个循环；
(2)对载体pGEX-6P-2用EcoRI和Xho I双酶切；
(3)将酶切好的Ds-defensin和pGEX_6P_2连接，转化到大肠杆菌DH5α菌株中，其中将连接液转化到大肠杆菌DH5a的方法是:取出一管感受态细胞DH5a至于冰上融化，加入5 ul连接液轻轻混匀冰浴30 min，再将管放到预加温到42°C的循环水浴中进行90 S，冰浴5~10 min，加入I ml LB培养基中，37°C下转速为250 rpm摇床温育45~60 min，转速为4000rpm下离心3 min,吸去上清，留管中10(Tl50 ul培养基吹匀菌液涂布于氨苄板上，至于37°C培养箱，抽提质粒得到所需重组质粒pGEX-6P-2-Ds-defensin。
[0014]实施例二:抗菌肽蛋白Ds-defensin (简称DFS)的表达与纯化
(1)取构建好的pGEX-6P-2-Ds-defensin质粒转化BL21，挑单克隆摇菌IL，且至其OD值为0.6^0.8，以体积比为1:1000加入IPTG诱导蛋白表达4 h，后放入4°C下诱导表达过夜；
(2)向菌液中加入适量PBS吹匀菌液，后加入工作液蛋白酶抑制剂PMSF，超声破碎细菌，转速为12000 rpm, 20 min后，4°C下离心收集蛋白上清，将蛋白上清用0.45 uM滤膜过滤，将过滤好的蛋白样加入到纯化滤柱中，4 °C下孵育过夜。其中纯化滤柱是向柱中加入适量的GST标签的介质，用PBS平衡柱子，后加入塞子堵住柱孔；
(3)打开塞子让杂蛋白液流出，每次用5ml PBS洗结合到介质上的蛋白，共洗60-100ml PBS可除去绝大部分杂蛋白，用酶切缓冲液平衡柱子后，取适量蛋白酶presciss1nprotease到酶切缓冲液中，4°C下酶切蛋白过夜(cleavage on column),收集DFS蛋白，并且跑胶鉴定。[0015]请参阅图1，所述森林革蜱抗菌肽蛋白DFS的基因序列为: ATGCGCGGACTTTGCATCTGCCTTGTCTTTATCCTTGTCTGTGGTCTTCTAACCGCCACGGCGGCCGTCCCG
GCTGAAAGCGAGGCGGCTCACCTCCGTGTTCGTCGAGGCTTCGGGTGCCCCCTGAACCAAGGCGCCTGTCACAACCA
CTGCCGCAGCATTCGGCGCCGAGGCGGCTACTGCTCTGGCATAATCAAGCAGACCTGCACCTGCTACAGGAATTAA。
[0016]实施例三:柱层析的方法纯化重组抗菌肽蛋白
用GST介质纯化重组目的蛋白DFS，用特异性蛋白酶在柱上酶切的方法，去除GST标签，重组的DFS浓缩后出去内毒素用于活性测试。
[0017]实施例四:DFS抗菌活性检测
(O摇菌至其对数生长期0.4^0.6，分别是金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，铜绿假单胞杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，藤黄微球菌，短小芽孢杆菌；
(2)用PB培养基稀释菌液至其OD值为0.001，培养基由1%蛋白胨，0.5%NaCl组成；
(3)DFS做检测抗菌活性实验前要先去内毒素，操作过程为在EP管中加入适量的去内毒素介质Detox1-Gel Endotoxin,转速为5000 rpm下离心I min,吸去上层的乙醇,用PBS平衡后加入纯化后的DFS蛋白液,其中GST介质和去内毒素介质Detox1-Gel Endotoxin都可再生重复使用；
(4)设置实验组DFS分别为0.4 uM、2 uM、10 uM，其中DFS浓度为150 ng/ul，对照组分别为磷酸盐缓冲液PBS、牛血清白蛋白BSA、蜱虫唾液内另外一种蛋白HBP，每组两个复孔，在96孔板中每组先加入90 ul菌液，实验组0.4 uM DFS加入2.4 ul DFS和57.6 ul PBS,实验组2 uM DFS加入12 ul DFS和48 ul PBS,实验组10 uM DFS加入60 ul DFS,对照组PBS加入60ul PBS,对照组BSA加入浓度为10 mg/ml的0.9ul BSA和59.1 ul PBS,对照组HBP加入浓度为 450 ng/ul 的 20ul HBP 和 40 ul PBS, 37°C下摇菌 20 h ；
(5)595 nm波长处测吸光度值。[0018]请参阅图2，通过用不同浓度的重组DFS做抗菌实验，发现其对金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌具有显著的抗菌活性，并且有剂量依赖关系。以金黄色葡萄球菌为例，在抗菌肽浓度为10 uM的浓度下，抗菌活性可以达到93%。请参阅图3，重组DFS对藤黄微球菌和铜绿假单胞菌有抗菌作用，但抗菌活性不明显，对大肠杆菌没有抗菌活性。
[0019]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的【技术领域】，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【权利要求】
1.一种森林革蜱抗菌肽蛋白，其特征在于，所述森林革蜱抗菌肽蛋白的基因序列为: ATGCGCGGACTTTGCATCTGCCTTGTCTTTATCCTTGTCTGTGGTCTTCTAACCGCCACGGCGGCCGTCCCGGCTGAAAGCGAGGCGGCTCACCTCCGTGTTCGTCGAGGCTTCGGGTGCCCCCTGAACCAAGGCGCCTGTCACAACCACTGCCGCAGCATTCGGCGCCGAGGCGGCTACTGCTCTGGCATAATCAAGCAGACCTGCACCTGCTACAGGAATTAA。
2.根据权利要求1所述的森林革蜱抗菌肽蛋白，其特征在于，所述森林革蜱抗菌肽蛋白有用于抗金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌或鼠伤寒沙门氏菌的用途。
3.根据权利要求2所述的森林革蜱抗菌肽蛋白，其特征在于，所述森林革蜱抗菌肽蛋白的抗菌活性与所述森林革蜱抗菌肽蛋白的使用剂量有关。
4.根据权利要求1所述的森林革蜱抗菌肽蛋白，其特征在于，所述森林革蜱抗菌肽蛋白有用于抗藤黄微球菌或铜绿假单胞菌的用途。
5.根据权利要求1所述的森林革蜱抗菌肽蛋白的制备方法，其特征在于，包括步骤为:通过聚合酶链反应方法从蜱虫cDNA文库中扩增出目的基因Ds-defensin，将所述目的基因Ds-defensin克隆到载体pGEX_6P_2上，在大肠杆菌BL21中原核表达得到森林革蜱抗菌肽蛋白，再通过GST标签 亲和层析的方法获得纯化的森林革蜱抗菌肽蛋白。
【文档编号】C12N15/12GK104031133SQ201410076429
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年3月4日 优先权日:2014年3月4日
【发明者】戴建锋, 冯婷婷, 卞刚 申请人:苏州大学