一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种植物细胞悬浮培养方法，特别是一种鹿蹄草细胞悬浮方法，属生物【技术领域】。本发明鹿蹄草细胞悬浮培养方法包括外植体的选择与灭菌，愈伤组织诱导，细胞悬浮培养，培养细胞的扩大繁殖四个步骤。本发明可在较短时间内获得大量鹿蹄草悬浮细胞，解决鹿蹄草资源需求问题，具有生产周期短，增殖速度快的优点，可用于药用植物成分的提取和制药工业。
【专利说明】一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物细胞悬浮培养方法，特别是一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，属生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]鹿蹄草(Pyrolarotundifolia L)为鹿蹄草科(Pyrolaceae)鹿蹄草属(Pyrola)植物，具有较高的药用价值。有文献报道其具有增强机体免疫力、改善心脑血管系统功能等药效，并应用于肠道感染、肺炎、高血压等疾病的治疗，疗效显著。目前该植物资源基本来源于野生采挖，难以大规模应用，且对采集地生态环境及野生鹿蹄草资源造成极大损害。虽然已有研究人员对鹿蹄草的引种驯化进行了研究与探讨，但依然存在引种驯化率低，栽培条件难于控制等问题。本发明提供一种鹿蹄草细胞悬浮培养的方法，能够在较短时间内获得大量鹿蹄草悬浮细胞，通过生物技术手段解决鹿蹄草资源需求的问题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，该方法能够在较短时间内获得大量鹿蹄草悬浮细胞，可为提取鹿蹄草有效成分提供充足原料。
[0004]本发明采用如下技术方案:
[0005](I)外植体的选择与灭菌:以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片，无菌水清洗2遍，在75%乙醇中浸泡I~3min，随后放入0.1%~0.15%的HgC12溶液中浸泡20~40s，随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。
[0006](2)愈伤组织诱导:在超净工作台中，将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长3~8mm的小叶片，接种到愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为:MS+6-BA0.3 ~0.7mg / L+2, 4-D0.3 ~0.7mg / L+ 蔗糖 20 ~40g / L+ 琼脂 5 ~8g / L，PH值为5.6~6.0 ;培养温度为20~30°C，每天光照O~16h，光照强度1000~30001x。
[0007](3)细胞悬浮培养:在超净工作台中，将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散，接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养。悬浮细胞液体培养基配方为:MS+6_BA0.5~
1.0mg/L+2, 4-D0.2 ~0.5mg / L+蔗糖 20 ~40g / L，PH 值为 5.6 ~6.0 ;接种量为每IOOmL培养基中加入10~50g愈伤组织，培养温度为20~30°C，每天光照O~16h，光照强度1000~30001x，振荡速度30~lOOrpm。培养10~15d，得到鹿蹄草悬浮细胞。
[0008](4)培养细胞的扩大繁殖:在无菌条件下，将步骤(3)中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1: 10~1: 15的比例接种至增殖培养基中，振荡培养。增殖培养基配方为:MS+6-BA0.2 ~0.6mg/L+2, 4-D0.3 ~0.5mg / L+蔗糖 20 ~40g / L，PH 值为 5.6 ~6.0 ;培养温度为20~30°C，每天光照O~16h，光照强度1000~30001x，振荡速度30~lOOrpm，得到大量鹿蹄草悬浮细胞。
[0009]采用本发明制备鹿蹄草悬浮细胞，生产周期短、增殖速度快、产量大、能耗少，操作便捷，利于大规模生产操作。【具体实施方式】
[0010]实施例一:
[0011](I)外植体的选择与灭菌:以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片，无菌水清洗2遍，在75 %乙醇中浸泡2min，随后放入0.1 %的HgC12溶液中浸泡25s，随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。
[0012](2)愈伤组织诱导:在超净工作台中，将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长5mm的小叶片，接种到愈伤组织诱导培养基上。培养基配方为:MS+6-BA0.4mg /L+2，4-D0.4mg/L+蔗糖30g / L+琼脂6g / L，PH值为5.8 ;培养温度为25°C，每天光照0h，即黑暗培养。
[0013](3)细胞悬浮培养:在超净工作台中，将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散，接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养。培养基配方为:MS+6-BA0.7mg /L+2, 4-D0.3mg / L+蔗糖30g / L，PH值为5.8 ;接种量为每IOOmL培养基中加入20g愈伤组织，培养温度为25°C，每天光照0h，即黑暗培养，振荡速度80rpm。培养10d，得到鹿蹄草悬浮细胞。
[0014](4)培养细胞的扩大繁殖:在无菌条件下，将步骤(3)中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1: 10的比例接种至增殖培养基中，震荡培养。培养基配方为:MS+6-BA0.3mg /L+2, 4-D0.4mg / L+蔗糖30g / L，PH值为5.8 ;培养温度为25°C，每天光照0h，即黑暗培养，振荡速度80rpm。培养15d ，3000rpm离心得鹿蹄草细胞，称鲜重，与步骤(2)中所得愈伤组织相比，增重12倍。
[0015]实施例二:
[0016](I)外植体的选择与灭菌:以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片，无菌水清洗2遍，在75 %乙醇中浸泡Imin，随后放入0.15 %的HgCl2溶液中浸泡40s，随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。
[0017](2)愈伤组织诱导:在超净工作台中，将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长3mm的小叶片，接种到愈伤组织诱导培养基上。培养基配方为:MS+6-BA0.3mg /L+2，4-D0.3mg/L+蔗糖20g / L+琼脂5g / L，PH值为5.6 ;培养温度为20°C，每天光照16h，光照强度lOOOlx。(3)细胞悬浮培养:在超净工作台中，将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散，接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养。培养基配方为:MS+6-BA0.5mg /L+2, 4-D0.2mg / L+蔗糖20妙L，PH值为5.6 ;接种量为每IOOmL培养基中加入IOg愈伤组织，培养温度为20°C，每天光照16h，光照强度10001X，振荡速度30rpm。培养15d，得到鹿蹄草悬浮细胞。
[0018](4)培养细胞的扩大繁殖:在无菌条件下，将步骤⑶中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1: 15的比例接种至增殖培养基中，振荡培养。培养基配方为:MS+6-BA0.2mg /L+2, 4-D0.3mg / L+蔗糖20g / L，PH值为5.6 ;培养温度为20°C，每天光照16h，光照强度ΙΟΟΟΙχ，振荡速度30rpm。培养15d，3000rpm离心得鹿蹄草细胞，称鲜重，与步骤(2)中所得愈伤组织相比，增重8倍。
[0019]实施例三:
[0020](I)外植体的选择与灭菌:以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片，无菌水清洗2遍，在75%乙醇中浸泡3min，随后放入0.1%的HgC12溶液中浸泡20s，随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。
[0021](2)愈伤组织诱导:在超净工作台中，将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长8mm的小叶片，接种到愈伤组织诱导培养基上。培养基配方为:MS+6-BA0.7mg /L+2, 4-D0.7mg / L+蔗糖40g / L+琼脂8g / L，PH值为6.0 ;培养温度为30°C，每天光照16h，光照强度10001χ。
[0022](3)细胞悬浮培养:在超净工作台中，将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散，接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养。培养基配方为:MS+6-BA1.0mg /L+2, 4-D0.5mg / L+蔗糖40g / L，PH值为6.0 ;接种量为每1OOmL培养基中加入50g愈伤组织，培养温度为30°C，每天光照16h，光照强度10001χ，振荡速度lOOrpm。培养10d，得到鹿蹄草悬浮细胞。
[0023](4)培养细胞的扩大繁殖:在无菌条件下，将步骤(3)中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1: 12的比例接种至增殖培养基中，振荡培养。培养基配方为:MS+6-BA0.6mg /L+2, 4-D0.5mg / L+蔗糖40g/L，PH值为6.0 ;培养温度为30°C，每天光照16h，光照强度10001χ，振荡速度lOOrpm。培养15d，3000rpm离心得鹿蹄草细胞，称鲜重，与步骤(2)中所得愈伤组织相比，增重10倍。
【权利要求】
1.一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，其特征在于按照如下步骤进行: (1)外植体的选择与灭菌:以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片，无菌水清洗2遍，在75%乙醇中浸泡I~3min，随后放入0.1%~0.15%的HgC12溶液中浸泡20~40s，随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。 (2)愈伤组织诱导:在超净工作台中，将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长3~8mm的小叶片，接种到愈伤组织诱导培养基上，培养温度为20~30°C，每天光照O~16h，光照强度1000~30001x。 (3)细胞悬浮培养:在超净工作台中，将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散，接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养,接种量为每IOOmL培养基中加入10~50g愈伤组织，培养温度为20~30°C，每天光照O~16h，光照强度1000~30001x，振荡速度30~IOOrpm0培养10~15d。(4)培养细胞的扩大繁殖:在无菌条件下，将步骤(3)中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1: 10~1: 15的比例接种至增殖培养基中，振荡培养，培养温度为20~30°C，每天光照O~16h，光照强度1000~30001x，振荡速度30~lOOrpm。
2.如权力要求I所述的一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，其特征在于步骤(1)中外植体为健康无病害的鹿蹄草叶片，外植体清洗过程为无菌水清洗2遍，在75%乙醇中浸泡I~3min，随后放入0.1 %~0.15%的HgC12溶液中浸泡20~40s，随后用无菌水清洗5遍。
3.如权利要求1所述的一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，其特征在于步骤(2)中愈伤组织培养基配方为:MS+6-BA0.3 ~0.7mg / L+2, 4-D0.3 ~0.7mg / L+ 蔗糖 20 ~40g / L+琼脂5~8g / L，PH值为5.6~6.0。
4.如权利要求1所述 的一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，其特征在于步骤(3)中悬浮细胞液体培养基配方为:MS+6-BA(X 5~L Omg/L+2, 4-D0.2~(λ 5mg / L+蔗糖20~40g /L, PH 值为 5.6 ~6.0。
5.如权利要求1所述的一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，其特征在于步骤(4)中增殖培养基配方为:MS+6-BA0.2 ~0.6mg / L+2, 4-D0.3 ~0.5mg / L+ 蔗糖 20 ~40g / L，PH 值为 5.6 ~6.0。
【文档编号】C12N5/04GK103789253SQ201410080698
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】高宁, 刘博 , 程玉鹏 申请人:高宁