一种强化前体供应增强α-酮戊二酸合成的解脂亚洛酵母的制作方法【专利摘要】本发明公开了一种强化前体供应增强α-酮戊二酸合成的解脂亚洛酵母，属于代谢工程【
技术领域：
】。本发明通过过量表达PDA1提高细胞内丙酮酸脱氢酶E1组分催化活力，不仅使中间代谢产物丙酮酸积累量下降，强化了细胞内乙酰-CoA供应；而且为细胞累积α-酮戊二酸提高了细胞内乙酰-CoA供应，致使细胞外积累的α-酮戊二酸明显提高。因此，过量表达PDA1不仅降低了中间代谢产物丙酮酸含量，并且强化了α-酮戊二酸积累，为细胞积累TCA循环中的有机酸提供了新思路。【专利说明】—种强化前体供应增强α-酮戊二酸合成的解脂亚洛酵母【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种强化前体供应增强α-酮戊二酸合成的解脂亚洛酵母，属于代谢工程领域。【
背景技术：
】[0002]α-酮戊二酸作为三羧酸循环(TCA)途径中重要中间产物之一，在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，不仅是三羧酸循环中的关键节点，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢；而且是微生物调控碳氮代谢平衡的重要节点，在研究与微生物氮代谢相关的调控机制方面具有重要作用。在工业上，α-酮戊二酸是重要的精细化工和医药工业的中间体，广泛用于合成多种氨基酸、维生素和其它小分子物质，在医药、有机合成、营养强化剂等领域都有着重要的应用前景。[0003]由于α-酮戊二酸在微生物胞内代谢中的特殊地位，筛选得到的α-酮戊二酸生产菌株，在高产α-酮戊二酸的同时，在发酵终期仍然会积累大量丙酮酸等代谢副产物。中间代谢产物丙酮酸是细胞进行TCA循环的前体物质，丙酮酸进入TCA循环的代谢通量不仅与菌体细胞维持生长有关更决定终产物α-酮戊二酸积累量。并且，由于丙酮酸和α-酮戊二酸具有相似的物理化学性质，大量存在丙酮酸增加了下游分离纯化过程的困难和成本。因此强化丙酮酸进入TCA循环不仅强化了细胞积累α-酮戊二酸所需的前体物质，也为下游分离纯化过程降低了难度和成本。【
发明内容】[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种强化前体供应增强α-酮戊二酸合成的解脂亚洛酵母基因工程菌，通过过量表达丙酮酸脱氢酶El组分α亚基的编码基因pdal强化丙酮酸脱氢酶活力，促进丙酮酸脱氢形成乙酰-CoA，强化进入三羧酸循环的碳代谢流，为脂亚洛酵母(Yarrowialipolytica)WSH-Z06合成α-酮戍二酸增加前体供应。[0005]所述基因pdal的核苷酸序列为NCBI中GeneID:2908574所示的核苷酸序列。[0006]所述基因工程菌是以解脂亚洛酵母WSH-Z06CCTCCN0:M20714为宿主，以含有潮霉素转磷酸移酶为筛选标记的整合型表达载体PO(hph)为表达载体。[0007]所述解脂亚洛酵母YarrowialipolyticaWSH-Z06从中国典型培养物保藏中心CCTCC获得，菌种保藏编号为CCTCCNO:M20714。过量表达基因pdal后，重组菌株细胞内乙酰-CoA含量提高，胞外丙酮酸含量下降，并且积累的α-酮戊二酸含量上升。[0008]一种构建所述解脂亚洛酵母基因工程菌的方法，包括以下步骤:(I)扩增潮霉素磷酸转移酶hph基因，hph基因的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示，利用限制性内切酶StuI与HindIII同时处理扩增得到的hph基因和pO质粒，并连接两酶切产物得到含有潮霉素转磷酸移酶为筛选标记的整合型表达载体PO(hph);(2)构建重组整合型表达质粒:根据NCBI公开的序列，全化学合成丙酮酸脱氢酶El组分α亚基的编码基因，并通过限制内切酶NotI和EcoRI同时切割获得的开放阅读框部分和整合型表达载体pO(hph)，连接获得重组表达质粒pO(hph)-PDAl;(3)将所得重组质粒转化Y.lipolyticaWSH-Z06:利用电穿孔转化方法将被限制性内切酶AvrII线性化的重组整合型表达质粒转化野生型Y.lipolyticaWSH-Z06，验证筛选阳性转化子。[0009]质粒pO的构建方法参见文献:SwennenD,PaulMF,VernisL,BeckerichJM,FournierA,GaillardinC.Secretionofactiveant1-Rassingle-chainFvantibodybytheyeastsYarrowialipolyticaandKluyveromyceslactis.Microbiology-Sgm,2002.148:41-50。[0010]一种以所述基因工程菌发酵生产α-酮戊二酸的方法，是将所得重组基因工程菌接种至种子培养基中，28°C、200rpm，培养16-18小时；按10%的接种量从种子培养基中接种到3-L发酵罐中，培养温度为28°C、通气量为1.5vvm，搅拌转数为400rpm，培养144-168小时。[0011]所述种子培养基成分为:葡萄糖20g/L,蛋白胨10g/L,MgSO4.7Η200.5g/L，KH2PO4IgzUpH为5.5。所述发酵培养基成分为:甘油100g/L，(NH4)2S043g/L,KH2P043g/L，MgSO4.7Η201.2g/L，NaCl0.5g/L，K2HPO40.lg/L，盐酸硫胺素2Xl(T7g/L，调pH为5.0后再加入20g/LCaC03。[0012]与未过量表达基因pdal的对照菌相比:过量表达GeneID:2908574基因的重组菌株的细胞内丙酮酸脱氢酶El组分的催化活力提高10.7%;细胞内的乙酰-CoA含量提高了13.4%,从2.3nmol.mg_1DCff增加至2.6nmol.mg_1DCff;此时细胞外积累的丙酮酸含量下降T46.3%至18.7g.L-1，α-酮戊二酸含量从37.6g.L-1上升至42.5g.L-1。[0013]一种强化酵母合成α-酮戊二酸的方法，是通过过量表达丙酮酸脱氢酶El组分α亚基的编码基因Pdal强化丙酮酸脱氢酶活力，促进丙酮酸脱氢形成乙酰-CoA，强化进入三羧酸循环的碳代谢流，为酵母合成α-酮戊二酸增加前体供应。[0014]所述酵母优选解脂亚洛酵母(Yarrowialipolytica)WSH-Z06。[0015]本发明的有益之处:本发明通过过量表达丙酮酸脱氢酶El组分α亚基的编码基因，不仅使中间代谢产物丙酮酸积累量下降，强化了细胞内乙酰-CoA供应；而且为细胞累积α-酮戊二酸提高了细胞内乙酰-CoA供应，致使细胞外积累的α-酮戊二酸明显提高。【专利附图】【附图说明】[0016]图1过量表达PDAl促进细胞生长，Y.lipolyticaffSH-Z06(),Y.1ipolyticaTl(?)。[0017]图2过量表达PDAl增加乙酰-CoA供给。[0018]图3过量表达PDAl提高丙酮酸脱氢酶El组分催化活力。[0019]图4重组菌株细胞外酮酸含量。[0020]图5过量表达PDAl对发酵生产α-酮戊二酸的影响；Α:野生菌发酵生产α-酮戊二酸；Β:重组菌株Y.1ipolyticaTl发酵生产α-酮戊二酸；菌体干重(Λ)，α-酮戊二酸(〇)，丙酮酸(口)。【具体实施方式】[0021]材料与方法[0022]YPD培养基(g.L—1):蛋白胨10，酵母浸膏5，葡萄糖10，固体培养基另加20g.L-1琼脂。转化子筛选时加入潮霉素B至终浓度为400mg.L'[0023]种子培养基(g.I/1):葡萄糖20，蛋白胨10，MgSO4.7Η200.5，KH2PO4LO。用稀盐酸调pH至5.5，115°C维持15min灭菌。固体斜面另添加20g.L-1琼脂粉。[0024]发酵培养基(g.I/1):甘油100，(NH4)2S043，KH2P043，MgSO4.7Η201.2，NaCl0.5，K2HPO40.1，盐酸硫胺素2Χ10_7,ρΗ=4.5。115°C，灭菌15min。接种前加入121°C灭菌30min的CaCO3至含量为20g.L-1。[0025]解脂亚洛酵母Y.lipolyticaWSH-Z06从中国典型培养物保藏中心CCTCC获得，菌种编号为CCTCCNO:M20714o[0026]细胞乙酰-CoA测定:离心收集细胞，迅速放到液氮中冷冻120s，使细胞代谢活动终止；于4°C、5000rpm条件下离心10min;然后将离心所得细胞悬浮在lmL6%的高氯酸中，将细胞溶解；加入0.3mL3mol/L的碳酸钾将酸中和，随后4°C、5000rpm条件下离心20min,除去细胞碎片；取上清液经0.22μm的微滤膜过滤后，用于HPLC分析。HPLC条件:StableBondC18反相柱，柱温:28°C,进样体积:10μL,流速:1.0mL/min,紫外检测波长:254nm;流动相:A为0.2mol/L的磷酸钠(ρΗ5.0)，B为800mL0.25mol/L的磷酸钠(ρΗ5.0)和200mL乙腈的混合物，以80%的A、20%的B混合为最终流动相。[0027]丙酮酸脱氢酶El组分催化活力和丙酮酸脱氢酶复合酶总催化活力测定:离心收集处于指数生长期的细胞，用0.9%生理盐水洗涤，用IOmL0.1MKH2PO4-K2HPO4ImMEDTA0.01mMDTTpH7.5缓冲液悬浮细胞,在4°C条件下,加入石英砂研磨5min,13000Xg离心10min,上清液用于丙酮酸脱氢酶El组分催化活力和丙酮酸脱氢酶复合酶总催化活力测定。[0028]丙酮酸脱氢酶El组分催化活力测定:将0.5ml细胞破碎上清液，加入至含有50mMKH2P04-K2HP04、IOmMMgCl2、2.0mM丙酮酸、0.2mM焦磷酸硫胺素、0.lmM2,6-DCPIP，pH7.0的反应混合液中至总体积为3mL，在30°C，600nm条件下检测2，6-DCPIP含量变化，IU的El组分催化活力定义为:单位时间内还原IμmoI的2，6-DCPIP所需要的酶量。[0029]丙酮酸脱氢酶复合酶总催化活力测定:将0.5ml细胞破碎上清液，加入至含有50mMKH2P04-K2HP04、10mMMgCl2、2.0mM丙酮酸、0.2mM焦磷酸硫胺素、2.5mMNAD\0.13mMCoApH8.0的反应混合液中至总体积为3mL，在30°C，340nm条件下检测NADH含量变化，IU的El组分催化活力定义为:单位时间内生成IμmoI的NADH所需要的酶量。[0030]细胞外α-酮戊二酸和丙酮酸测定:将发酵培养液13000Xg离心，取适量上清液，用超纯水稀释50倍，过过0.22μm滤膜，用于HPLC分析。HPLC条件:AminexHPX-87Hionexchangecolumn;流动相:5mmol.L-1硫酸溶液(550μL浓硫酸定容到2L),用0.22μm孔径的微滤膜抽滤并脱气；柱温:35°C;进样量:10μL;流速:0.6mLmin'紫外检测器检测:波长210nm。[0031]Y.lipolytica转化方法:将在YI3D培养基上长出的新鲜Y.lipolyticaWSH-Z06单菌落转接至液体YI3D培养基中，28°C，200rpm，过夜培养。按10%接种量转接至新鲜的液体YI3D培养基中28°C，200rpm培养至OD6qq=L2左右，离心收集细胞，于30°1:用8mL100mmol.L-1LiAc,10mmol.L^1DTT,0.6mol.TT1Scrrbito110mmol.L^1Tris-HCL,pH=7.5缓冲液处理8XIO8细胞。离心收集细胞，用5mL预冷的Imol.L-1的sorbitol洗漆细胞三次，并用Imol.L—1的sorbitol悬浮细胞至101°细胞.mL'加入Iyg预先线性化的整合型载体至细胞悬浮液中，置于冰上温孕5分钟，将该混合物转移至预冷的0.2cm电转杯中，电击，电击条件为2.5KV，25μF，200Ω，立即加入ImL预冷的Imol.L^sorbitol,室温静置I小时，将0.2mL电击产物涂布于含有400mg.L-1的潮霉素B的选择平板中，28°C培养48-72小时。[0032]表1整合型表达过量验证引物[0033]【权利要求】1.一种强化前体供应增强α-酮戍二酸合成的解脂亚洛酵母(YarrowiaIipolytica)基因工程菌，其特征在于，是在解脂亚洛酵母中过量表达编码丙酮酸脱氢酶El组分α亚基的基因pdal。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因pdal的核苷酸序列为NCBI中GeneID:2908574所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，是以解脂亚洛酵母CCTCCN0:M20714为宿主，以含有潮霉素转磷酸移酶为筛选标记的整合型表达载体pO(hph)为表达载体。4.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，步骤为:(I)构建表达目的基因所用的整合型表达载体:扩增潮霉素磷酸转移酶hph基因，hph基因的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示，利用限制性内切酶StuI与HindIII同时处理扩增得到的hph基因和PO质粒，并连接两酶切产物得到含有潮霉素转磷酸移酶为筛选标记的整合型表达载体PO(hph);(2)构建重组整合型表达质粒:根据NCBI公开的序列，全化学合成编码丙酮酸脱氢酶El组分α亚基的基因的开放阅读框序列，并通过限制内切酶NotI和EcoRI同时切割获得的开放阅读框部分和整合型表达载体PO(hph)，连接获得重组表达质粒；(3)将所得重组质粒转化Y.1ipolyticaWSH-Z06:利用电穿孔转化方法将被限制性内切酶AvrII线性化的重组整合型表达质粒转化野生型Y.1ipolyticaWSH-Z06,验证筛选阳性转化子。5.一种应用权利要求1所述基因工程菌发酵生产α-酮戊二酸的方法，是将所得重组基因工程菌接种至种子培养基中，28°C、200rpm培养16-18小时；按10%的接种量从种子培养基中接种到3-L发酵罐中，培养温度为28°C、通气量为1.5vvm，搅拌转数为400rpm，培养144-168小时。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子培养基成分为:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，KH2PO41g/L,ilpH为5.5。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为:甘油100g/L，(NH4)2S043g/L，KH2P043g/L，MgSO4.7Η201.2g/L，NaCl0.5g/L，K2HPO40.1g/L,盐酸硫胺素2Xl(T7g/L，调pH为5.0后再加入20g/LCaC03。8.一种强化酵母合成α-酮戊二酸的方法，其特征在于，是通过过量表达丙酮酸脱氢酶El组分α亚基的编码基因pdal强化丙酮酸脱氢酶活力，促进丙酮酸脱氢形成乙酰-CoA，强化进入三羧酸循环的碳代谢流，为酵母合成α-酮戊二酸增加前体供应。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酵母为解脂亚洛酵母(YairowiaIipolyticaX【文档编号】C12N15/81GK103923847SQ201410093771【公开日】2014年7月16日申请日期:2014年3月14日优先权日:2014年3月14日【发明者】陈坚,周景文,郭洪伟,堵国成申请人:江南大学