一种检测猪瘟病毒抗体的elisa方法及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法，该方法将全长的猪瘟病毒（CSFV）Erns蛋白基因序列进行优化，建立一种猪瘟病毒Erns蛋白的真核表达系统—毕赤酵母表达系统，实现Erns蛋白的高效表达；利用表达的Erns蛋白作为抗原，通过ELISA条件优化建立一种大规模筛查猪瘟特异性抗体的ELISA血清学诊断方法。本发明还提供了用于上述检测的ELISA试剂盒，该试剂盒具有良好的特异性、敏感性和重复性，能够快速有效地对猪瘟病毒抗体进行检测。本发明在很大程度上促进我国的猪瘟血清抗体监测的发展，并促进猪瘟分子标记疫苗的使用和推广，推动我国的活猪和新鲜猪肉的出口贸易，具有良好的经济效益和社会效应。
【专利说明】—种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法及检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体涉及检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法，本发明还涉及用于该检测的ELISA检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]Langedijk等研究发现，在CSFV的Ems蛋白上存在一处抗原表位，该表位具有鉴别诊断功能，位于Ems蛋白C末端191-227氨基酸处，它不仅能够将CSFV、BVDV, BDV区分开来，而且在未来的新型疫苗(以E2为目的蛋白)应用中，能够将疫苗免疫猪和野毒感染猪鉴别开，因此具有很好的应用前景。猪瘟病毒感染猪后能够诱导产生针对Ems糖蛋白的抗体。Ems糖蛋白的分子解析能够确定病毒感染后诱导产生的抗体，能够帮助设计有效的诊断抗原和疫苗。Lin等将猪瘟病毒Alfort/187多聚蛋白氨基酸序列297到776之间做缺失分析，Alfort/187多聚蛋白包括Ems的C端(aa) 27-227，整个El蛋白(aa) 1-195和E2蛋白N端(aa)l-87。不同缺失的基因片段连接于原核表达载体pET30，在原核细胞中表达，通过WesternBlot方法检测它们与猪瘟病毒感染猪血清的反应性，显示Ems基因可以分为三个抗原区域:Ems(aa)65-145、Erns(aa)84-160和Ems(aa) 109-220。每一个独立的区域或包含这3个区域的片段，都能跟猪瘟病毒感染猪血清很好的反应。尽管不同的瘟病毒株Ems基因内存在保守的或变异的区域，猪瘟病毒感染特异的血清学检测和瘟病毒感染的普遍性检测都能通过使用Ems基因某一片段或多个片段的组合应用。
[0003]当标记疫苗采用E2蛋白作为免疫原时，Erns蛋白可以作为配套的鉴别诊断试验的抗原来检测自然感染产生的抗体。最常用的检测CSFV抗体的方法所用抗原多为CSFVE2蛋白或浓缩纯化的细胞培养CSFV抗原，对于大多数比较成功的标记疫苗来说，这些方法大都不能作为配套的鉴别诊断实验。到目前为止，作为诊断抗原的Ems(EO)蛋白都是由重组鸡痘病毒、昆虫细胞表达的或直接以合成肽的形式或用原核表达系统来表达的【1_7】，成本较高，且产量方面也受到一定限制。`
【发明内容】
[0004]针对上述不足，本发明提供一种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法。
[0005]为实现上述目的，本发明首先提供Ems蛋白体外表达方法，包括如下步骤:人工合成SEQIDN0.1所示序列的基因并克隆到毕赤酵母表达载体中得到重组表达载体，将重组表达载体转化毕赤酵母，筛选阳性克隆，培养并诱导表达，分离纯化得到Ems蛋白。在本发明实例中所述毕赤酵母表达载体为PPIC9K，所述基因克隆到α因子信号肽序列下游；所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。
[0006]进而本发明提供一种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法，包括如下步骤:将上述方法制备的Ems蛋白作为抗原包被酶标板，将待测样品经稀释后加入酶标板温育，加入酶标二抗温育后显色。
[0007]优选，所述抗原包被浓度为6.25 μ g/mL,包被条件为37°C，2h，再于4°C过夜。[0008]优选，待测样品为血清，按1:100稀释后加入酶标板，37°C温育I小时。
[0009]优选，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG，稀释10000倍后加入酶标板，37 °C反应30min。
[0010]当被检血清样品的OD450≥0.38时，判为阳性；0D45Q < 0.33判为阴性，介于两者之间的视为可疑，重检。
[0011]本发明还提供一种猪瘟病毒ELISA检测试剂盒，其包括包被上述方法制备的Ems蛋白的酶标板和选自以下试剂中的一种或多种:酶标二抗、稀释液、显色液、终止液、阳性标准品、阴性标准品。
[0012]本发明用酵母真核表达系统来表达猪瘟兔化弱毒株Ems蛋白并建立检测Ems抗体的间接ELISA方法，为进一步开发诊断试剂盒和研究Erns蛋白的免疫学功能奠定基础。另外，本发明研究发现酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关，本发明将猪瘟病毒(CSFV) Ems蛋白基因进行了改造，即选择性地对密码子的优化，并在片断5’端加EcoRI酶切位点，3’端加NotI酶切位点，实现Ems蛋白的有效表达，具有较高的表达效率。
[0013]本发明采用巴斯德毕赤酵母高效表达具有生物学活性的Ems蛋白，其中，毕赤酵母真核表达系统具有原核表达系统或低级真核表达系统不具备的优势:①毕赤酵母更接近高等真核细胞，不含内毒素和其他有害物质，使用安全；②同酿酒酵母一样，繁殖速度快，对培养条件要求低,培养基价廉,能进行高密度培养,且能耐受较高的液体静压,便于工业化生产；③该系统的载体能与核基因组进行整合，因此构建的菌株较稳定，一般不会在传代过程中出现丢失现象；④在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内，又可在分泌信号作用下将蛋白分泌到胞外；⑤具有强有力的易控制的乙醇氧化酶基因(AOXl)或磷酸甘油酸脱氢酶(GAP)基因启动子作为外源基因启动子，可对外源蛋白的表达进行严格的调控；⑥作为真核表达系统，可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰，即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N糖基化、O糖基化，从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性；⑦外源蛋白表达量高，同时自身分泌的背景蛋白少，表达产物易于纯化；⑧和酿酒酵母相比，毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8-14个甘露糖残基，比酿酒酵母每条侧链平均50-150个甘露糖残基短得多。毕赤酵母极少出现过度糖基化，可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能，而且糖链中不含具有致敏作用的α-1，3-甘露糖，使其作用更加安全。
[0014]本发明使用的载体pPIC9K具有酿酒酵母a -factor分泌信号肽，在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外，以分泌方式表达外源蛋白。外源蛋白可占培养物上清总蛋白的80%左右，更有利于目的蛋白的分离纯化，此表达载体还具有pAOXl诱导型强启动子，受甲醇的严格调控，可以有效的调控外源基因的表达，存在抑制/去抑制和诱导两种调控机制:培养物中抑制物(如葡萄糖或甘油)去除后，并不能使基因大量转录，只有在甲醇诱导下，基因才能大量转录。
[0015]本方法获得的阳性克隆表达量可达54mg/L。利用巴斯德毕氏酵母表达的Ems蛋白接近天然Ems蛋白，没有出现过度糖基化，建立的间接ELISA反应表现出对Ems蛋白产生抗体的专一性和敏感性，这提供了一种更为低价猪瘟诊断试剂盒的方法。由此，可建立一种大规模筛查猪瘟特异性抗体的血清学ELISA诊断试验，也为E2蛋白标记疫苗的推广应用打下基础。
[0016]本发明检测试剂盒具有良好的特异性、敏感性和重复性，能够快速有效地对猪瘟病毒抗体进行检测。本发明在很大程度上促进我国的猪瘟血清抗体的监测的发展，并促进猪瘟分子标记疫苗的使用和推广，推动我国的活猪和新鲜猪肉的出口贸易，具有良好的经济效益和社会效应。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是重组载体pGM_T/Ems酶切鉴定图，其中1_2为阳性克隆的质粒酶切条带；M为 DL2000 分子量 marker。
[0018]图2是重组分泌载体pPIC9K/Ems构建示意图。
[0019]图3是重组酵母基因组DNAPCR分析图，其中1_6为重组酵母PCR结果；MSDL2000分子量marker。
[0020]图4是重组酵母培养诱导上清SDS-PAGE电泳分析结果,其中1_2为重组酵母诱导上清液；3为空载体转化子诱导上清液；4为GS115菌诱导上清；5为重组酵母诱导沉淀；Marker为SDS-PAGE低分子量标准蛋白质。
[0021]图5是重组酵母Western-Blotting分析结果，其中M为SDS-PAGE低分子量标准蛋白质；1为重组酵母菌诱导沉淀；2，3为阳性重组酵母菌诱导上清。
[0022]图6是Ems蛋白纯化收集图谱。
[0023]图7是可溶性Ems蛋白纯化后SDS-PAGE结果，其中M为SDS-PAGE低分子量标准蛋白质；1为阳性诱导菌纯化后上清。
[0024]图8是本发明ELISA方法构建的流程图(图8A、图8B)。
【具体实施方式】
[0025]以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。任何不背离本发明精神和实质下的修该或替换，均属于本发明要求保护的范围。
[0026]实施例1 Ems蛋白的体外表达及活性检测
[0027]1.重组表达载体构建
[0028]1.1将猪瘟病毒(CSFV) Erns蛋白基因进行了改造，选择性地对密码子进行优化，并在片断5’端加EcoRI酶切位点，3’端加NotI酶切位点。优化过的Ems全长序列如SEQIDN0.1所示,进一步通过人工合成得到所述序列。
[0029]1.2将人工合成得到的SEQIDN0.1与pGM_T质粒按照5:1的比例建立反应体系连接，然后将连接产物10 μ L轻轻加入到DH5 α感受态细胞中，轻轻转动EP管以混匀内容物，冰上放置30min。42°C水浴热激90sec后快速转移至冰上，放置2~3min后加入800 μ LLB液体培养基，200rpm振摇45~60min，使菌体复苏并表达抗性基因。然后吸出IOOyL涂在Amp抗性的LB板上，培养16h~18h至平板上长出菌落。
[0030]使用限制性内切酶EcoR1、NotI双酶切鉴定阳性克隆菌株的质粒，1%琼脂糖凝胶电泳，分别出现片段条带和质粒条带，说明目的基因片段通过连接后整合进入克隆载体。(见图1)。
[0031]1.3将含有Ems基因全编码序列的pGMT/Ems进行进行EcoRI和NotI双酶切，回收后插入到相同酶切的毕赤酵母分泌表达载体PPIC9K中，并位于α因子信号肽序列下游，获得重组质粒pPIC9K/Ems，构建过程(见图2)
[0032]表达载体构建完成后，随机挑取转化子提取质粒进行0.8%琼脂糖电泳，以阴性质粒作为对照，根据质粒电泳速度，初步判断出插入目的片段的转化子，阳性质粒迁移速度比阴性对照迁移速度慢，进而通过测序验证阳性质粒目的片段的存在以及序列是否与设计序
列一致。
[0033]2.重组酵母构建
[0034]pPIC9K/Erns线性化转化酵母GSl 15后涂布MD平板，从MD平板挑取60个酵母重组转化子点种于含有l_6mg/mLG418的YPD平板上筛选多拷贝转化子，在6mg/mLG418的YPD板上共获得6个阳性高拷贝转化子。根据酵母操作手册，当转化子是甲醇利用快型时，则引物P1、P2可扩增出两条条带，分别为2.2Kb和1174bp，当转化子是甲醇利用慢型时，引物P1、P2只能在1174bp处扩增出I条条带。重组酵母的菌落PCR鉴定如图3示，6个阳性转化子均在1174bp处和2.2Kb处各有I条带，将在1174bp处扩增出条带的酵母进行MM平板筛选，点种在MM平板上的重组酵母全部不能够正常生长，说明获得的重组酵母全部为甲醇利用快型。[0035]Pl:5/ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'
[0036]P2:5/ -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'
[0037]3.Erns蛋白的诱导表达及分离纯化
[0038]3.1挑取筛选到的重组酵母接种于25mLBMGY培养基中，菌体生长16_18h后，即OD600在4时，转入到IL的BMGY中继续28_30°C培养，至OD6tltl在4左右，再转入4LBMMY培养基中进行诱导表达，28~30°C、250rpm摇床连续培养，每24h加100%的甲醇至甲醇终浓度为0.5%~1%，每24h收集ImL菌液，直至最佳诱导时间出现为止。培养96h或144h后，12000rpm离心5min，将上清和沉淀分开放于_80°C冰箱，后续试验备用。以电转化时使用PPIC9K阴性质粒获得的重组酵母作为阴性对照。分别处理上清和菌体后进行SDS-PAGE，结果样品上清在约47-48KDa左右处有特异条带，空载体转化子诱导后的上清无此条带，样品沉淀进行蛋白电泳后只有微弱的特异条带(见图4)，说明重组蛋白主要以分泌的形式得到表达。
[0039]3.2Erns蛋白生物活性分析如图5示:对重组酵母表达上清和空载体转化的酵母进行SDS-PAGE和Western-Blotting，结果96h诱导上清在47_48KDa处出现特异性条带，重组菌诱导沉淀只有很微弱的条带出现，表明重组蛋白主要以分泌的形式进行表达，且用酵母表达系统使表达的目的蛋白具有天然的生物活性，为进一步研究Ems蛋白的特性奠定了扎实的基础。
[0040]3.3利用CLCProtein Workbench Version5.1蛋白分析软件对Erns蛋白进行分析，其Pl值为7.57，根据其等电点，将诱导表达96h上清经pH计调至所用交换柱要求的pH范围内，0.22μηι过滤器过滤待纯化。利用GE公司的AKTApurifierlOO层析仪对可溶性蛋白Erns进行离子交换层析，首先将Al管道放入缓冲液或平衡液中，将BI管道放入高盐溶液中或洗脱液中进行泵清洗；然后选择流速为lmL/min、输入填料的耐受压力为高耐受，待阴离子交换柱平衡好了(观察电导COND，pH的数值和变化趋势)即准备上样；将Erns样品约4~5mL吸进注射器，推掉气泡，推入样品环，用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线后收集洗脱液，每管收集体积为ImL/管。观察蛋白峰图，记录下蛋白达到峰值时的样品管编号并储存以备下一步检测和利用。用Microcon超滤管YM-1O将纯化后的Ems蛋白进行进一步浓缩。
[0041]使用Unicon5.20蛋白纯化分析软件对Ems进行了结果分析(图6)，对洗脱峰后的两个蛋白峰分别进行多管超滤浓缩后进行SDS-PAGE和Western-Blotting,结果显示收集管为15~16两管的蛋白为目的蛋白，在280nm蛋白吸收光下，此目的蛋白峰为486.915mAu，除了洗脱过程、蛋白处理过程和蛋白本身降解外，此得率说明蛋白纯化纯度和质量都不错。更有利于下步ELISA的操作。
[0042]收集到的峰蛋白进行SDS-PAGE鉴定，目的蛋白条带上有一条杂带出现(图7)，利用蛋白含量分析软件BandScan version5.0对蛋白条带进行了分析,结果显示目的蛋白占85.2%，可见纯化效果比较好。
[0043]4.纯化Ems蛋白浓度的测定
[0044]纯化后Ems蛋白，经紫外分光光度计测定样品在A260nm和A280 nm波长的光吸收值。Α280=1.038 ；Α260=1.801 代入公式蛋白质浓度(mg/mL) = (l.45XA280 —0.74XA260) X稀释倍数，计算蛋白浓度为:17.24mg/mL。
[0045]用上述软件并对其抗原性进行了分析，Erns是唯一可分泌到猪瘟病毒浸染细胞培养上清的糖蛋白。
[0046]Erns的抗原表位位于332-412位氨基酸、351-427位氨基酸和376-487位氨基酸三个重叠抗原区中。
[0047]实施例2猪瘟病毒抗体检测ELISA方法的建立
[0048]1.猪瘟病毒抗体检测ELISA方法的建立
[0049]使用方阵滴定的方法确定抗原Ems的最佳抗原包被浓度和待检猪血清的稀释度，同时确定最佳反应程序。以阳性、阴性血清孔OD值之比即P/N值作为指标，对包被抗原浓度、血清稀释倍数、酶结合物最适工作浓度、各步反应时间等项目进行比较试验，确定各项最适反应条件,将纯化的重组Ems蛋白用0.025mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至适当浓度，包被96孔酶标板，每孔加入50μ L经1:20,1:40、1:80、1:160、1:320、1:640倍比稀释的纯化重组抗原，每个稀释度重复两排，置湿盒中，37°C，4h后，再4°C包被过夜，用含 0.05%Tween-20 的 0.01mol/LPBS (pH7.4)的(PBST)洗涤 5 次，间隔 2min,期间振摇；以50g/L脱脂奶粉37°C封闭2h，同上步骤洗板；将猪瘟阳性和阴性血清分别用PBST进行1:25、1:50,1 =IOOU:200倍比稀释，加入封闭后的酶标板，每孔50yL，用封口膜封闭，37°C感作60min，同上步骤洗板；将辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG以不同比例稀释，每孔加入50μ L，37°C感作30min,同上洗板；加入50 μ L底物液(TMB)，避光显色15~30min，最后加Λ 50 μ L终止液(2mol/LH2S04)终止反应，用酶标仪检测OD450,计算阳性血清孔的平均OD450值(P)和阴性血清孔的平均OD45tl值(N)之比(P/N)。
[0050]利用方阵滴定法对抗原包被浓度、血清稀释浓度、酶标二抗工作浓度等ELISA参数进行优化。结果抗原稀释在1:40和抗体稀释在1:100时P/N值相对最大，且阴性血清的非特异性反应不明显，所以选择抗原作1:40，血清1:100为最佳稀释度。此时抗原的最佳包被浓度为6.25 μ g/mL。(当用此抗原包被浓度和血清稀释度时，经过几次试验验证，标准阴性血清的OD45tl值< 0.10，标准阳性血清的OD450值≥0.7)。
[0051]根据抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定结果，将纯化抗原和CSFV阳性血清分别作最佳稀释后进行ELISA操作，酶标抗体分别作1:8000，1:1OOOO，1: 15000，1:20000四个稀释度进行ELISA试验，测其OD45tl值并计算P/N。通过OD45tl值下降幅度及ELISA判定标准，认为二抗浓度均作10000倍稀释最佳。
[0052]用重组蛋白Ems以其最佳抗原包被浓度条件下包被ELISA反应板，37°C，2h，再4°C过夜，将血清及其酶标二抗都作最佳稀释倍数，分别在37°C下反应1.5h，lh,40min,30min,进行ELISA测定，测定OD45tl值并求其P/N值，以确定血清和酶标二抗的最佳反应时间，通过试验最终确定一抗结合时间为Ih, 二抗结合时间为30min。
[0053]对50份阴性血清进行间接ELISA检测，按照已经确定的ELISA程序进行测定，读出OD45tl值，进行样本OD45tl值平均值(X)、标准方差(S.D)的计算。计算出50份血清的OD450的平均值和标准方差S.D，确定阳性血清临界值为0.37，阴性血清临界值为0.33，即当被检血清样品的OD45tl≥0.37时，判为阳性；0D45(i < 0.33判为阴性，介于两者之间的视为可疑，
需要重检。
[0054]2.猪瘟病毒抗体检测ELISA方法的特异性
[0055]建立的Ems-ELISA检测猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清、猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清、猪传染性胸膜肺炎阳性血清(TGEV)、副猪嗜血杆菌病阳性血清(HPS )、猪圆环病毒-2型(PCV-2 )阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清，结果显示被检血清的OD45tl值均低于0.30，均为阴性，表明该ELISA法具有良好的特异性。见表1。
[0056]表1猪瘟抗体间接ELISA交叉特异性检测结果
[0057]
【权利要求】
1.Erns蛋白体外表达方法，包括如下步骤:人工合成SEQIDN0.1所示序列的基因并克隆到毕赤酵母表达载体中得到重组表达载体，将重组表达载体转化毕赤酵母，筛选阳性克隆，培养并诱导表达，分离纯化得到Ems蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毕赤酵母表达载体为PPIC9K，此表达载体具有pAOXl诱导型强启动子，所述基因克隆到α因子信号肽序列下游。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。
4.一种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法，包括如下步骤:将权利要求1~3任一项所述方法制备的Ems蛋白作为抗原包被酶标板，将待测血清样品经稀释后加入酶标板温育，加入酶标二抗温育后显色，测定反应后血清样品OD450值。
5.根据权利要求4所述的ELISA方法，其特征在于，所述抗原包被浓度量为6.25 μ g/mL，包被条件为37°C，2h，再于4°C过夜。
6.根据权利要求4或5所述的ELISA方法，其特征在于，待测样品为血清，按1:100稀释后加入酶标板，37 C温育I小时。
7.根据权利要求4或5所述的ELISA方法，其特征在于，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG，稀释10000倍后加入酶标板，37°C反应30min。
8.根据权利要求4或5所述的ELISA方法，其特征在于，当被检血清样品的OD45tlS0.38时，判为阳性；0D45(i < 0.33判为阴性，介于两者之间的视为可疑，重检。
9.猪瘟病毒ELISA检测试剂盒，其包括包被权利要求1~3任一项所述方法制备的Ems蛋白的酶标板和选自以下试剂中的一种或多种:酶标二抗、稀释液、显色液、终止液、阳性标准品、阴性标准品。`
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，Ems蛋白包被浓度为6.25μ g/mL，包被条件为37°C，包被2h，再于4°C过夜。
【文档编号】C12N15/81GK103882051SQ201410104452
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】孙惠玲, 刘彦, 白佳桦, 许晓玲, 冯涛, 李桂萍, 张平 申请人:北京市农林科学院