一种栝楼根三萜提取物及其制备方法与用途

一种栝楼根三萜提取物及其制备方法与用途
【专利摘要】本发明提供了一种栝楼根三萜提取物，按如下步骤制备：（1）将原料栝楼根粉碎后，加入复合酶和水的混合液，进行酶解，过滤得滤液；（2）将所得滤液浓缩，所得浓缩液先用卤代烃萃取，分离出水层和卤代烃层，取水层再用乙酸乙酯萃取，分离出水层和乙酸乙酯层，卤代烃层和乙酸乙酯层分别浓缩干燥后，合并得粗提物；（3）将所得粗提物分散于水或者乙醇的水溶液中，先经树脂吸附分离，再用乙醇的水溶液进行分级洗脱，回收洗脱液，浓缩干燥后即得栝楼根三萜提取物；本发明所述的栝楼根三萜提取物可用于制备治疗糖尿病的功能食品及药物。
【专利说明】一种栝楼根三萜提取物及其制备方法与用途
(一)【技术领域】
[0001]本发明属医药【技术领域】，涉及药用植物栝楼，具体涉及栝楼根三萜提取物及其制备方法，以及在制备治疗糖尿病的功能食品和药物中的应用
(二)【背景技术】
[0002]本发明属医药【技术领域】，涉及栝楼中三萜提取物及其制备方法与用途，本发明以栝楼根为原料，先经酶解辅助萃取，过滤后获得提取液浓缩至一定体积后，用卤代烃以及乙酸乙酯分别提取，合并卤代烃及乙酸乙酯提取物，经树脂吸附纯化获得三萜活性部位提取物。经体外酶抑制活性测试及动物体内试验，结果表明，本发明三萜提取物具有明显的11 β羟类固醇脱氢酶I型(11 β-HSDl)抑制活性和降血糖效果，可用于制备治疗临床常见的糖尿病及相关代谢性疾 病的药物。
[0003]糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由遗传和环境因素导致胰岛素分泌绝对或相对不足或胰岛素的生物效应降低，引起一系列代谢紊乱的临床综合征。随着人们生活水平的提高、糖尿病发病率在世界范围内逐年上升，已被列为继心血管病、肿瘤之后严重威胁人类健康的第三大疾病，引起了世界各国的高度重视。目前糖尿病治疗口服药物主要分为3类，胰岛素分泌促进剂，胰岛素增敏剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂，但它们都具有不同程度的副作用，如低血糖、体重增加和心血管疾病等，因此避免传统糖尿病药物所存在的副作用的新型抗糖尿病药物开发已经渐渐成为国内外研究的热点。
[0004]糖皮质激素可以诱导胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的中心环节。而11β羟类固醇脱氢酶(Ι?β-HSD)在体内催化有活性的Cl-羟基化糖皮质激素(皮质醇、皮质酮)与无活性形式的Cll-酮类代谢物质(可的松，11-脱氢皮质留酮)之间的相互转化。它是属于短链脱氢/还原酶超家族(SDR)，有两个亚型:11β — HSDl和11 β — HSD2。
11β -HSDl是一种低亲和力的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原型)[NADP(H)]依赖性脱氢酶/氧化还原酶，在肝脏组织和脂肪组织、胎盘组织和脑组织中广泛表达。它的主要作用是使无活性的皮质酮转化为有活性的皮质醇，从而提高组织局部的糖皮质激素水平。
[0005]研究表明11 β -HSDl对胰岛素敏感性及糖尿病的发生、发展中起重要作用。在胰岛细胞中表达的11 β-HSDl通过活化糖皮质激素而下调细胞内胰岛素受体蛋白的表达及抑制胰岛β细胞导致胰岛素抵抗，减少胰岛素分泌而升高血糖，促进2型糖尿病的发生。药理学研究显示选择性的11 β -HSDl抑制剂可以降低肝脏和脂肪组织中皮质醇浓度，局部增强胰岛素敏感性，达到降低血糖、减肥的效果。
[0006]近年来中草药资源中筛选11 β -HSDl抑制剂逐渐引起相关关注。中医药治疗糖尿病(消渴证)具有悠久历史。很多中药已被临床证明确有疗效，栝楼即是其中之一。药食两用植物括楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)是葫芦科括楼属的多年生缠绕性藤本植物，常用中药瓜萎、瓜萎子、瓜萎皮和天花粉即为该植物的干燥成熟果实、种子、果皮和干燥根。在历代多部中医药典籍中，均有栝楼治疗消渴(糖尿病)的记载，如《本草图经》、《本草纲目》、《本草衍义》《药性赋》、《本草蒙筌》、《景岳全书》等。现在临床用于治疗糖尿病的中成药有出自《金匮要略》中的瓜萎瞿麦丸，栝楼亦为主药。上世纪70年代以来，国内外学者对栝楼属的化学成分、药理作用等方面做了一定的研究工作。从种子和根茎中分离出了葫芦烷型及齐墩果烷型三萜、黄酮、蛋白和有机酸类等活性化合物。对栝楼降血糖作用有效成分相关研究较少，且主要以水提物[马燕，河北联合大学硕士论文，2011]或者凝集素类糖蛋白成分[Hiroshi Hikino, planta med.，1989，55 (4)，349-350;李琼等，长春中医药大学学报，2012，28(1)，9-11]为主要研究对象，栝楼三萜降血糖及对11 β -HSDl酶有选择性抑制活性未见报道，而本发明主要关注栝楼三萜的制备及其降糖活性。
(三)
【发明内容】

[0007]本发明的目的是提供一种栝楼根三萜提取物及其制备方法。
[0008]本发明的另一个目的是提供所述三萜提取物的药物用途，尤其是ΙΙβ-HSDl酶抑制活性和降血糖作用。本发明的提取物可以用于制备治疗临床常见的糖尿病及相关代谢性疾病的药物。
[0009]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0010]一种栝楼根三萜提取物，所述的栝楼根三萜提取物是按如下步骤制备的:
[0011](I)将原料栝楼根粉碎后，加入复合酶和水的混合液，在pH为4.5~6.5的条件下，于25~65°C酶解10~120min，过滤得滤液；所述复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶以质量比0.2~5:1混合而得；所述纤维素酶的比活为4000U/g，所述木瓜蛋白酶的比活为5000U/g ;所述复合酶的质量用量是栝楼根质量的0.2%~10% ；
[0012](2)将步骤(1)中所得滤液浓缩至原体积的1/5~1/3得浓缩液，所得浓缩液先用卤代烃萃取，分离出水层和卤代烃层，卤代烃层浓缩干燥后得提取物A，取水层用乙酸乙酯萃取，分离出水层和乙酸乙酯层，乙酸乙酯层缩干燥后得提取物B，将提取物A与提取物B合并，得粗提物；所述的卤代烃为二氯甲烷或三氯甲烷；
[0013](3)将步骤(2)中所得粗提物分散于0wt%~20wt%乙醇的水溶液中，并经树脂吸附分离，然后先用20wt%~30wt%乙醇的水溶液洗脱，再用75wt%~90wt%乙醇的水溶液洗脱，回收75wt%~90wt%的乙醇水洗脱液，浓缩干燥后即得栝楼根三萜提取物；所述的树脂选自 AB-8, DlOl 或 H103。
[0014]本发明推荐步骤(1)中所述复合酶和水的混合液与栝楼根的质量比为5~20:1，优选11:1。
[0015]本发明栝楼根三萜提取物的制备方法，所述步骤(1)中，优选所述的酶解pH值为5，酶解温度为50°C，酶解时间为60min ;优选所述复合酶中纤维素酶与木瓜蛋白酶质量比为1:1 ;优选所述复合酶的质量用量是栝楼根质量的5%。
[0016]本发明栝楼根三萜提取物的制备方法，所述步骤(2)中，优选所述卤代烃的体积用量是所述浓缩液体积的0.5~2倍；优选所述乙酸乙酯的体积用量也是所述浓缩液体积的
0.5~2倍；优选所述卤代烃为二氯甲烷。
[0017]本发明栝楼根三萜提取物的制备方法，所述步骤(3)中，优选所述0wt%~20wt%乙醇的水溶液与粗提物的液固质量比为2~3:1，这里0wt%表示其中不含乙醇，只有水，即以0被％代表；优选所述树脂的质量用量是原材料栝楼根质量的1/5~1/3，特别优选1/4。
[0018]本发明所述的栝楼根三萜提取物的制备方法步骤(3)中，优选所述20wt%~30wt%乙醇的水溶液的体积用量以栝楼根的质量计为0.2~lL/kg ;优选所述75wt%~90wt%乙醇的水溶液的体积用量以栝楼根的质量计为0.3~2L/kg。
[0019]本发明所述的栝楼根三萜提取物对治疗糖尿病有作用，栝楼根三萜提取物显示出在制备治疗糖尿病的药物以及功能食品中的应用前景。
[0020]本发明提取物含量测量方法:采用紫外分光光度法进行测定提取物中三萜类成分含量:精密量取环栝楼二醇对照品28mg，以丙酮定容于IOmL容量瓶中。精密量取环栝楼二醇丙酮溶液0.05，0.1,0.15，0.2，0.25，0.3mL，分别置于6个IOmL容量瓶中。分别准确加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4mL,再加入1.4mL高氯酸，置于60°C水浴20min，用冷水冷却至室温，丙酮定容，摇匀，放置40min。在552nm处测定吸光度值，画出栝楼三萜紫外吸收标准曲线。精密称取本发明提取物10mg，以丙酮溶于IOmL容量瓶中，分别准确加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.5mL，再加入1.6mL高氯酸，置于60°C水浴20min，用冷水冷却至室温，丙酮定容，摇匀。检测吸光度，按以上标准曲线计算出相关浓度以及含量
[0021]本发明所述的栝楼根三萜提取物生物活性及用途分析方法:经体外11 β -HSDl酶抑制活性测试及动物体内降血糖效果试验考察验证，具体见实施例3。结果表明按本发明方法制得的栝楼三萜提取物具有明显的11 β-HSDl酶抑制活性和降血糖效果，可用于制备治疗糖尿病及其相关代谢性疾病的功能食品及药物。也可通过添加药用辅料经常规方法制备治疗糖尿病的药物。
[0022]本发明的有益效果为:
[0023]由于栝楼根质地坚硬，且含有大量的糖蛋白类成分，影响栝楼三萜的提取效果，对比实验表明以水提取或者以醇提取栝楼根中三萜，回收率小于3%，而且获得的产品分离困难，由于蛋白类成分容易皂化，且蛋白表面对活性物质吸附影响，在萃取分离过程中导致栝楼根回收率急剧下降，同时纯化效果差。而本发明的方法采用蛋白酶法先水解栝楼根中糖蛋白类成分，且纤维素酶的利用有利于三萜类成分溶出，三萜回收率达到7%以上，获得产品三萜纯度超过70%。明显优于传统提取方法
[0024]另一方面对栝楼根降血糖的研究前人发表文章主要关注栝楼根中糖蛋白类成分，且无明确降血糖活性机制研究。本发明通过试验认为栝楼降血糖活性成分为三萜，其三萜类成分有11 β -HSDl酶抑制活性是栝楼降血糖的主要原因。
(四)【具体实施方式】
[0025]下面通过实施例对本发明作进一步具体描述，但本发明的保护范围不限于此。
[0026]实施例1栝楼根中三萜提取物的制备
[0027]栝楼干燥根茎20公斤粉碎后，和复合酶I公斤(纤维素酶:木瓜蛋白酶/1:1，质量比)均匀混合，加入220升水，于50度，pH为5的条件下酶解60分钟，过滤后滤液浓缩至65升左右，先用50升二氯甲烷萃取，再用50升乙酸乙酯萃取，分别回收二氯甲烷层和乙酸乙酯层的溶剂，得两份提取物，合并二提取物，干燥得粗提物451克。将粗提物分散于1.35升水中，并采用5公斤AB-8树脂吸附分离，然后先以20wt%乙醇的水溶液10升洗脱，再用80wt%乙醇的水溶液30升洗脱 ，回收80wt%的乙醇水洗脱液，浓缩干燥获得三萜提取物138克。经紫外分光光度法测定，提取物中三萜含量74.2%。
[0028]实施例2栝楼根中三萜提取物的制备[0029]栝楼干燥根茎I公斤粉碎后，和复合酶0.1公斤(纤维素酶:蛋白酶/1:1，质量比)均匀混合，加入10升水，于55度，pH为4.5的条件下酶解50分钟，过滤后滤液浓缩至2升左右，先用1.5升二氯甲烷萃取，再用I升乙酸乙酯萃取，分别回收二氯甲烷层和乙酸乙酯层的溶剂，得两份提取物，合并二提取物，干燥得粗提物23.1克。将粗提物分散于60毫升水中，并采用250克AB-8树脂吸附分离，然后先以20wt%乙醇的水溶液0.5升洗脱，再用80wt%乙醇的水溶液1.5升洗脱，回收80wt%的乙醇水洗脱液，浓缩干燥获得三萜提取物7.5克。经紫外分光光度法测定，提取物中三萜含量72.3%。
[0030]实施例3栝楼根中三萜提取物的制备
[0031]栝楼干燥根茎4.3公斤粉碎后，和复合酶0.2公斤(纤维素酶:木瓜蛋白酶/1:1，质量比)均匀混合，加入50升水，于60度，pH为5.5的条件下酶解60分钟，过滤后滤液浓缩至16升左右，先用12升二氯甲烷萃取，再用12升乙酸乙酯萃取，分别回收二氯甲烷层和乙酸乙酯层的溶剂，得两份提取物，合并二提取物，干燥得粗提物113克。将粗提物分散于330毫升10wt%乙醇的水溶液中，并采用1.3公斤AB-8树脂吸附分离，然后先以30wt%乙醇的水溶液2.3升洗脱，再用87wt%乙醇的水溶液7.2升洗脱，回收87wt%的乙醇水洗脱液，浓缩干燥获得三萜提取物34.1克。经紫外分光光度法测定，提取物中三萜含量73.8%。
[0032]实施例4栝楼根三萜提取物抗糖尿病活性研究
[0033]取健康成年大鼠60只，雌性，饲以钴-60辐照基础饲料，动物房温度控制在22°C左右，适应性喂养7天后，大鼠体重维持在200±10g，用腹腔注射四氧嘧啶的方法，建立四氧嘧啶型糖尿病模型大鼠。大鼠在禁食不禁水16h后，腹腔注射2%的四氧嘧啶溶液，剂量为200mg/kg体重,造成糖尿病模型。注射7d后取血,选择血糖浓度> llmmol/L确定为糖尿病大鼠模型。根据实验需求，将模型大鼠按随机数字表分为正常对照组，栝楼根水提取物组(栝楼根于热水中以液固比8L/g回流提取3小时获得产品，主要成分为糖类和糖蛋白类成分)，栝楼根三萜提取物(实施例1获得)组，模型对照组和罗格列酮组，每组10只。每日一次，连续给药28天，进行以下3项实验。
[0034]①栝楼根提取物对四氧嘧啶型糖尿病大鼠空腹血糖的影响
[0035]在给药前、给药14天、给药28天时采用葡萄糖测定试剂盒测定大鼠空腹血糖。空腹血糖的测定主要是用来衡量基础血糖水平，空腹血糖高，说明该大鼠血糖高，是糖尿病的症状之一。上述测定结果表明:栝楼根水提取物和栝楼根三萜提取物皆有降低大鼠血糖作用，三萜提取物效果较水提物更佳，与罗格列酮组相当，具体见表1。
[0036] 表1大鼠血糖值变化(mmol/L, x^SD )
[0037]
【权利要求】
1.一种栝楼根三萜提取物，其特征在于所述的栝楼根三萜提取物是按如下步骤制备的: (1)将原料栝楼根粉碎后，加入复合酶和水的混合液，在pH为4.5~6.5的条件下，于25~65°C酶解10~120min，过滤得滤液；所述复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶以质量比0.2~5:1混合而得；所述纤维素酶的比活为4000U/g，所述木瓜蛋白酶的比活为5000U/g ；所述复合酶的质量用量是括楼根质量的0.2%~10% ； (2)将步骤(1)中所得滤液浓缩至原体积的1/5~1/3得浓缩液，所得浓缩液先用卤代烃萃取，分离出水层和卤代烃层，卤代烃层浓缩干燥后得提取物A，取水层用乙酸乙酯萃取，分离出水层和乙酸乙酯层，乙酸乙酯层缩干燥后得提取物B，将提取物A与提取物B合并，得粗提物；所述的卤代烃为二氯甲烷或三氯甲烷； (3)将步骤(2)中所得粗提物分散于0wt%~20wt%乙醇的水溶液中，并经树脂吸附分离，然后先用20wt%~30wt%乙醇的水溶液洗脱，再用75wt%~90wt%乙醇的水溶液洗脱，回收75wt%~ 90wt%的乙醇水洗脱液，浓缩干燥后即得栝楼根三萜提取物；所述的树脂选自AB-8, DlOl 或 H103。
2.如权利要求1所述的栝楼根三萜提取物，其特征在于步骤(1)中所述复合酶和水的混合液与括楼根的质量比为5~20:1。
3.如权利要求1所述的栝楼根三萜提取物，其特征在于所述步骤(1)中，所述的酶解PH值为5，酶解温度为50°C，酶解时间为60min ;所述复合酶中纤维素酶与木瓜蛋白酶质量比为1:1 ;所述复合酶的质量用量是栝楼根质量的5%。
4.如权利要求2所述的栝楼根三萜提取物，其特征在于步骤(1)中所述复合酶和水的混合液与栝楼根的质量比为11:1。
5.如权利要求1所述的栝楼根三萜提取物，其特征在于步骤(2)中所述卤代烃的体积用量是所述浓缩液体积的0.5~2倍。
6.如权利要求1所述的栝楼根三萜提取物，其特征在于步骤(2)中所述乙酸乙酯的体积用量是所述浓缩液体积的0.5~2倍。
7.如权利要求1所述的栝楼根三萜提取物，其特征在于步骤(3)中所述的0wt%~20wt%乙醇的水溶液与所述粗提物质量比为2~3:1。
8.如权利要求1所述的栝楼根三萜提取物，其特征在于步骤(3)中所述树脂的质量用量是所述栝楼根质量的1/5~1/3。
9.如权利要求1所述的栝楼根三萜提取物，其特征在于步骤(3)中，所述20wt%~30wt%乙醇的水溶液的体积用量以栝楼根的质量计为0.2~lL/kg ;所述75wt%~90wt%乙醇的水溶液的体积用量以栝楼根的质量计为0.3~2L/kg。
10.如权利要求1所述的栝楼根三萜提取物在制备治疗糖尿病的功能食品和药物中的应用。
【文档编号】A23L1/29GK103893242SQ201410104179
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】郭辉, 钱俊青, 张斌, 戴承恩 申请人:浙江工业大学