一种促进猪体细胞克隆胚胎体外发育的培养液的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种促进猪体细胞克隆胚胎体外发育的培养液，所述培养液中含有表观遗传修饰剂EPZ00477。EPZ004777能够特异性改变克隆胚胎早期发育过程中组蛋白H3K79的甲基化修饰水平，改善卵母细胞对体细胞核重编程的不足。利用本发明提供的培养液对猪体细胞克隆胚胎进行体外培养处理，可以促进胚胎的囊胚发育率与发育质量，从而降低体细胞克隆猪的生产成本并提高其生产效率，有助于克隆技术的进一步发展与应用。
【专利说明】一种促进猪体细胞克隆胚胎体外发育的培养液
[【技术领域】]
[0001]本发明涉及动物胚胎培养液，特别涉及一种促进猪体细胞克隆胚胎体外发育的培养液。
[【背景技术】]
[0002]动物的体细胞克隆，是指利用一定的设备和技术手段，将动物的体细胞与已经去除细胞核遗传物质的卵母细 胞进行体外重组即体细胞核移植，接着再将克隆胚胎体外培养至特定的发育时期后，然后移植到生理状态相同的代孕母体的子宫内，完成发育，生产与体细胞供核体遗传上同质后代的过程。十几年来，体细胞克隆技术结合分子生物学和细胞培养技术生产了大量的基因修饰后代，包括外源基因的随机整合和基因定点插入、敲除的动物。借助体细胞克隆生产转基因动物，获得了远比原核注射高的效率，这在动物育种、拯救濒危动物乃至医学基础与临床研究方面具有广泛的应用价值，例如为人类器官移植开辟异源供体(L.X.Lai et al., Production of alpha-1, 3-galactosy I transferase knockoutpigs by nuclear transfer coning, Science, 295 (2002) 1089-1092.)、制备人类疾病医学动物模型以及生物学基础研究等提供了一个比较理想的平台。通过体细胞克隆技术还成功建立了来自克隆胚胎的小鼠、大鼠、人胚胎干细胞系，为治疗性克隆打下了坚实的基础。
[0003]体细胞克隆胚胎的体外培养是克隆动物体外生产十分重要的环节，这一步将直接关系到克隆胚胎生产的效率和质量、重构程序的优化以及早期胚胎移植等问题。为了确保体外培养的效果，实验室中所使用的培养液的成分和培养的环境(包括温度、气体浓度和湿度等)，都是尽量模拟母体生殖道的内环境。但是由于毕竟是模拟的，所以动物胚胎的体外培养体系仍不能完全模仿母体生殖道的内环境，因此胚胎体外的培养效果与体内胚的发育效果仍然有一定的差距。母体生殖道内的液体成分较为复杂，含有大量的激素和生长因子，且这些成分并非恒定的，或多或少对胚胎的后期发育有积极地调控作用，而实验室常用的培养液成分相对单一、固定，无法充分模拟母体生殖道内的液体成分，这也解释了为什么动物的克隆效率比较低的部分原因。因此，实验室内常用的培养液还需通过添加或者调节生长因子、激素等，使其能够达到最佳的模拟状态，从而使胚胎的体外培养体系进一步完善，在实验室内可以得到足够多的优质胚胎，为该动物的后期实验研究提供好的素材。
[0004]不过，除了影响胚胎体外培养的各种生理条件方面的因素，重构得到的体细胞克隆胚胎本身的发育能力也远远低于自然受精胚胎，因为在胚胎重构的过程中包含的表观遗传重编程事件众多，而核重编程又很难在短时间内发生完全重编程，其主要事件包括染色质重塑、DNA甲基化、组蛋白甲基化与乙酰化、基因组印记、X染色体失活等。这些程序中的任何一个环节出现问题，都有可能影响重编程的结果，最终影响到体细胞克隆动物的生产效率。从目前的经验看来，体细胞重编程水平的不完善是导致克隆胚胎质量差、体内发育异常以及死亡流产等不良现象产生的核心因素(L Armstrong et al., Epigeneticmodification is central to genome reprogramming in somatic cell nucleartransfer, Stem Cells,24 (2006)805-814;Κ.M.Whitworth et al.，Somatic cell nucleartransfer efficiency:how can it be improved through nuclear remodeling andreprogramming?, Mol Reprod Dev, 77 (2010) 1001-1015)。在体细胞克隆的过程中，供体细胞一般来自终末分化阶段的体细胞，而这些细胞的基因组已经历了高度特异的DNA甲基化和组蛋白乙酰化等表观修饰。因此在移入去核卵母细胞后，供体细胞必须经过卵母细胞内天然的重编程因子介导的表观修饰重编程，先关闭与分化相关的、体细胞特异性基因的表达，然后激活胚胎特异性的、对早期发育起重要作用的那部分基因，克隆胚胎才能获得发育的全能性。但是，卵母细胞本身是重编程精子染色体而非体细胞，所以核移植引导的重编程效果不是很理想，已经高度分化的细胞能够重编程发育到胚胎状态是缓慢的而且相对来说是不完全的(X.C.Tian et al., Nuclear reprogramming by somaticcell nuclear transfer-the cattle story, Society of Reproduction and Fertilitysupplement, 64(2007): 327-339)，这可能因为体细胞重编程的不彻底以及表观遗传方面发生异常改变所致，由此而导致目前动物体细胞克隆的效率依然低下。因此，研究者迄今仍在不断探索从表观遗传层面干预体细胞克隆胚胎的早期发育的方法，以期提高胚胎的发育效率与质量。
[0005]近年来的研究显示，表观遗传学调控在细胞生长与发育中扮演着越来越重要的作用，组蛋白甲基化修饰是表观遗传学重要调控机制之一。其中，组蛋白H3第79位赖氨酸(H3K79)的修饰对建立与维持常染色质与异染色质两种状态的调控至关重要，与细胞核的重编程密切关联。Feng等数个研究小组发现，一类新的组蛋白赖氨酸甲基转移酶DOTl可以将其催化(Q.Feng et al., Methylation of H3_lysine79is mediated by a new familyof HMTases without a SET domain, Curr Biol, 12 (2012): 1052-1058)。而据研究，利用小分子化合物 EPZ004777 (W.Y.Yu et al., Catalytic site remodelling of the D0T1Lmethyl transferase by selective inhibitors, Nat Commun 3 (2012): 1288)特异性革巴向抑制组蛋白H3第79位赖氨酸的二甲基化(H3K79me2)甲基转移酶D0T1L，在诱导性多能干细胞(Induced pluripot ent stem cells, iPSCs)的工作中，可取代 Klf4 和 c_Myc 基因显著加快重编程速度，增加iPSCs阳性克隆数量(T.T.Tian et al., Chromatin-modifyingenzymes as modulators of reprogramming, Nature, 483 (2012) 598-602)。在重编程过程早期抑制D0T1L与两种在重编程增强作用中发挥关键性功能作用的因子NAN0G、LIN28表达上调有关。全基因组水平分析H3K79me2的分布发现，与上皮间质转化相关的成纤维细胞特异性基因在重编程的初期失去了 H3K79me2。D0T1L抑制推动了在多能状态中受到抑制的基因H3K79me2标记的丢失。这些研究结果表明特异的染色质修饰酶可在体细胞重编程中充当阻碍因子或是促进因子，揭示了如何通过调节这些染色质修饰酶来减少外源转录因子等，促进更高效地生成iPSCs。
[0006]在早期胚胎发育过程中，基因呈现出时空的表达模式，而在此过程中组蛋白甲基化的修饰也表现出动态学的变化，组蛋白甲基化修饰酶参与了早期胚胎发育复杂的网络调控。这些也提示我们，在不同时期的培养液中添加表观遗传修饰剂如EPZ004777等来调节卵母细胞介导的核重编程事件的发生，对体细胞克隆胚胎的体外发育以及用于后续的动物生产活动或将有着积极的作用。
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【发明内容】
][0007]本发明的一个目的是提供了表观遗传修试剂EPZ004777的应用，即用于制备促进猪体细胞克隆胚胎体外发育的培养液的应用。
[0008]本发明的另一个目的是提供了一种促进猪体细胞克隆胚胎体外发育的培养液，包括表观遗传修试剂EPZ004777，其含量为0.1~lnmol/L。优选地，所述EPZ004777的浓度为 0.5nmol/L。
[0009]根据本发明所述的培养液的进一步特征，该培养液还包括以下含量的组分:氯化钠 6.305 ~6.315g/L ;碳酸氢钠 2.115 ~2.125g/L ;氯化钾 0.740 ~0.750g/L ;磷酸二氢钾 0.045 ~0.055g/L ;硫酸镁 0.045 ~0.055g/L ;乳酸钙.五水 0.600 ~0.610g/L ;丙酮酸钠 0.015 ~0.025g/L ；L-谷氨酰胺 0.140 ~0.150g/L ;肌醇 0.495 ~0.505g/L ;亚硫磺酸0.540~0.550g/L ;青霉素G0.060~0.070g/L ;链霉素0.045~0.055g/L ;牛血清白蛋白2.990~3.010g/L ;必需氨基酸(50 X) 2% ;非必需氨基酸(IOX) 10%。
[0010]优选地，所述的培养液包括以下含量的组分:氯化钠6.312g/L ;碳酸氢钠2.119g/L ;氯化钾0.746g/L ;磷酸二氢钾0.048g/L ;硫酸镁0.048g/L ;乳酸钙.五水0.606g/L ；丙酮酸钠0.022g/L ；L-谷氨酰胺0.146g/L ;肌醇0.500g/L ;亚硫磺酸0.546g/L ;青霉素G0.066g/L ;链霉素0.050g/L ;牛血清白蛋白3.000g/L ;必需氨基酸(50X)2% ;非必需氨基酸(10X) 10%。
[0011]本发明的再一个目的是提供一种促进猪体细胞克隆胚胎体外发育的方法，包括以下步骤:
[0012]A.将刚刚经过重构并融合的猪体细胞克隆胚胎置于如权利要求2至5之一所述的培养液中处理6~30小时；
[0013]B.将处理在步骤A入不含EPZ004777的培养液中，继续培养至所述胚胎体外发育成囊胚。
[0014]优选地，在步骤A中，所述胚胎在培养液中培养处理的时间为24小时。
[0015]本发明的优点在于:
[0016](I)本发明促进猪体细胞克隆胚胎体外发育的培养液，对体细胞克隆胚胎进行体外培养处理后，增强了胚胎的囊胚发育率并增加囊胚中的总细胞数，从而提高囊胚的数量、质量，因此，能够降低克隆猪的生产成本并提高其生产效率，有助于克隆技术的进一步发展与应用；
[0017](2)本发明中培养液所含的表观遗传修饰剂EPZ004777是高特异性的表观遗传修饰剂，比如，其在肿瘤医学领域已被用于选择性抑制MLL重排性白血病细胞的增殖，相比市售同类的多数化合物，并不会造成广谱的表观遗传位点的干预，因而具有较高的生物安全性；
[0018](3)本发明中培养液所含的EPZ004777半衰期非常短，在处理完胚胎的早期发育后，不会因药物残留而对后期发育造成不利影响。
[【专利附图】
【附图说明】]
[0019] 图1是H3K79me2的表达动态变化图。
[【具体实施方式】][0020]为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
[0021]下列实施列举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例，根据本发明公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的常规实验技术。
[0022]若未特别指明，以下实施例中使用的试剂和材料均可从商业途径获得。
[0023]实施例1.猪卵母细胞成熟培养液的配制
[0024]在基础TCM-199 (Earle，s salts)中加入10%猪卵泡液、5%胎牛血清、10IU/mL孕马血清促性腺激素、10IU/mL人绒毛膜促性腺激素、10ng/mL表皮生长因子、100IU/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素配制而成。
[0025]实施例2.猪卵母细胞的获取与体外成熟
[0026]将从屠宰场刚摘取的猪卵巢，放入37°C含青霉素、链霉素的生理盐水中，2小时内运回实验室；取回的卵巢用75%酒精喷洒消毒一次，无菌生理盐水洗涤3遍，然后用配有18号针头的IOmL 一次性塑料注射器抽取卵巢上2~6mm直径的卵泡，将抽取液注入置于38.5 °C恒温水浴锅中的15mL离心管内，抽卵结束后，将离心管放置在38.5°C恒温热台上静置15分钟,让卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-Oocyte Complexes, COCs)自然沉降；弃除离心管中的上清液，并加入洗卵液(含0.0P/oPVA的DPBS缓冲液)稀释沉淀并混匀，在带有热台的体式镜下迅速捡取 胞质均匀、有两层以上卵丘细胞且包裹完整的COCs。
[0027]将获得的COCs用卵母细胞成熟培养液洗涤3遍后转入在38.5°C、5%C02、100%湿度培养箱中平衡4小时以上的石蜡油覆盖的成熟培养滴中培养42±2小时，每50 μ L成熟液滴培养15枚COCs。
[0028]实施例3.猪MII期卵母细胞的获得与核移植供体细胞的准备
[0029]将成熟培养42±2小时后的COCs移入已用38.5°C预热的含lmg/mL Hya透明质酸酶的DPBS缓冲液中，再用移液器轻轻并反复吹打200次或3分钟左右，之后在镜下检查COCs周围卵丘细胞是否已脱除干净，将脱完卵丘的卵母细胞移入T2操作液(含2%胎牛血清的TCM199)液滴洗涤3遍，移进矿物油覆盖的T2滴中；挑选卵周隙明显，卵细胞膜完整，且排出第一极体的卵母细胞，即为MII期卵母细胞。
[0030]供核细胞采用培养至第3~9代次的猪胎儿成纤维细胞或耳成纤维细胞体细胞，选择汇合度在70%~90%的细胞，在开始进行显微操作前I小时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA于37°C消化为单细胞悬液后，保存在4°C冰箱中待用。
[0031]实施例4.猪核移植即体细胞克隆胚胎的制备
[0032]用T2液洗涤冰箱中准备的体细胞，将挑出的MII期卵母细胞和体细胞一起放入显微操作皿的核移植操作液中，该核移植操作液为HEPES缓冲的含7.5 μ g/mL细胞松弛素B及2%胎牛血清的TCM199，并将操作皿置于38.5°C恒温热台的显微操作台上；用固定针固定住卵母细胞后，用去核针吸取第一极体及其周围约1/5~1/4处含有卵母细胞核的胞质，之后吸取体细胞(直径约15~20μπι，折光性强、圆形、光滑的)，从去核切口进入卵母细胞透明带下注核，点压透明带，使体细胞与胞质膜紧密接触；操作完后将重构卵转移到石蜡油覆盖好的Τ2液滴中，在38.50C的恒温箱中恢复30分钟；将Τ2液滴中已恢复好的重构卵移入融合/激活液中洗涤3遍，每批10枚放入已经铺满融合液的融合槽内，是供体细胞-受体卵母细胞膜接触面与电场方向垂直，用CF-150B型融合仪(BLS公司，匈牙利)施加单个156V/mm、100 μ s的直流电脉冲诱导融合同时电激活，随后用胚胎培养液洗涤3遍，立即转入覆盖石蜡油的ΡΖΜ-3培养液中，38.5°C、5%C02、100%湿度培养30分钟后取出，在体式显微镜下判
定融合。
[0033]实施例5.猪胚胎培养液的配制
[0034]分别取胚胎培养水50mL溶解0.024g硫酸镁和0.303g乳酸钙.五水，待完全融合后将二者混合，并按顺序加入3.156g氯化钠、1.053g碳酸氢钠、0.373g氯化钾、0.024g磷酸二氢钾、0.01lg丙酮酸钠、0.073g L-谷氨酰胺、0.250g肌醇、0.273g亚硫磺酸、0.033g青霉素G、0.025g链霉素、IOmL必需氨基酸、50mL非必需氨基酸、0.5nmol/L EPZ004777 (实验组添加，对照组不添加)，充分混合均匀后用容量瓶添加胚胎培养水定容至500mL ;最后，添加
1.5g牛血清白蛋白，调pH值为7.2~7.4，4°C保存。
[0035]实施例6.猪体细胞克隆胚胎的体外培养
[0036]将判定融合的克隆胚胎，移入化学辅助激活液(含胚胎培养液、10 μ g/mL放线菌酮、5 μ g/mL细胞松弛素B)中激活培养4小时，接着用胚胎培养液洗涤3遍，转入在38.5°C、5%C02、100%湿度培养箱中平衡4小时以上的石蜡油覆盖的胚胎培养滴中培养处理24小时，每50 μ L胚胎培养液滴培养约15枚胚胎；随后用同上但不含ΕΡΖ004777的胚胎培养液洗涤3遍，再转入平衡过的该胚胎培养滴中继续培养至体外发育到囊胚。
[0037]对照组克隆胚胎的生产、培养与观察、鉴定，除全程使用不含ΕΡΖ004777的胚胎培养液之外，所有试验步骤均与上述保持一致。
[0038]实施例7.猪体细胞克隆胚胎体外发育情况的观察与统计
[0039]胚胎在培养箱中培养48小时和168小时后(开始化学辅助激活培养时，即计为第O小时)，在体式显微镜下分别观察记录卵裂和囊胚的形成情况；囊胚总细胞计数是采用荧光染料Propidium 1dide对胚胎细胞进行核染，然后在荧光显微镜下进行统计。试验数据采用SPSS13.0软件中One-way ANOVA进行数据统计分析，所有分析结果中，P < 0.05表示差异显著。
[0040]通过将本实施例的对照组与实验组的试验结果进行比对(实验重复6次)，其数据统计结果如表3所示。
[0041]表3.EPZ004777处理猪体细胞克隆胚胎对早期发育的影响
[0042]
【权利要求】
1.表观遗传修试剂EPZ004777用于制备促进猪体细胞克隆胚胎体外发育的培养液的应用。
2.一种促进猪体细胞克隆胚胎体外发育的培养液，其特征在于:包括表观遗传修试剂EPZ004777，其含量为 0.1 ~lnmol/L。
3.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于:所述EPZ004777的浓度为0.5nmol/L。
4.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于，还包括以下含量的组分:
5.根据权利要求4所述的培养液，其特征在于，包括以下含量的组分:
6.一种促进猪体细胞克隆胚胎体外发育的方法，其特征在于，包括以下步骤: A.将刚刚经过重构并融合的猪体细胞克隆胚胎置于如权利要求2至5之一所述的培养液中处理6~30小时； B.将处理后的胚胎移入不含EPZ004777的培养液中，继续培养至所述胚胎体外发育成囊胚。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述步骤A中，所述胚胎在培养液中培养处理的时间为24小时。
【文档编号】C12N5/071GK103952368SQ201410122806
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】张运海, 张宇, 陶佳, 吴蓉花, 刘星, 李运生, 章孝荣 申请人:安徽农业大学