一种用于预防病毒性心肌炎的重组病毒及其疫苗和应用的制作方法
【专利摘要】本发明一种重组病毒，以水疱型口炎病毒为载体，在水疱型口炎病毒的囊膜糖蛋白G和聚合酶蛋白L之间插入编码抗原CVB3结构蛋白VP1基因。本发明还提供了上述重组病毒的制备方法，由pP、pL、pXN2-VP1、pVSVG和pN五质粒转染BHK21细胞获得。本发明还提供了一种疫苗，含有有效量的上述的重组病毒。本发明的疫苗可以以滴鼻、口服或经生殖道方式实施粘膜部位接种，能解决现有技术中常规疫苗无法有效诱导高强度的粘膜免疫应答，抗原不能在粘膜局部有效停留、不足以被APC提的技术问题。本发明的重组病毒可有效增强CVB3特异性血清和粘膜局部抗体应答，明显加强全身及肠道粘膜局部特异性CD8T细胞杀伤能力。
【专利说明】一种用于预防病毒性心肌炎的重组病毒及其疫苗和应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及生物基因技术，尤其涉及一种重组病毒，特别是一种用于预防病毒性心肌炎的重组病毒及其疫苗和应用。
【背景技术】
[0002]病毒性心肌炎主要由B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染所致，青壮年发病较高，可导致约50%的人类急性及慢性心肌炎和25%扩张性心肌病的发生，是一常见、多发的心血管系统疾病。目前尚无有效的预防或治疗疫苗。CVB3属于肠道病毒，通过呼吸道、胃肠道入侵机体后，由于机体粘膜免疫(如肠道IgA)不能在感染早期及时清除病毒，使病毒迅速扩散入血、进而侵犯心脏，导致病毒性心肌炎；CVB3的持续性感染还可能导致扩展性心肌病的发生，致死率极高，危害严重。当前导致严重感染性疾病的病原体如人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)等均通过粘膜表面(生殖道、呼吸道、胃肠道)入侵和感染机体，由于机体不能诱导有效的粘膜免疫应答清除粘膜感染病原体，使病原体迅速扩散入血、进而侵犯全身，造成机体损伤；同时发展为慢性感染，导致慢性疾病的行成。
[0003]对于以上经粘膜感染病原体，如能诱导粘膜局部(鼻咽、胃肠道)的特异性粘膜免疫应答，特别是特异性的SIgA的形成和分泌，则可能在感染初期有效中和病毒，避免病毒入血而后感染全身器官，从而有效的阻止病毒性心肌炎的发生。因此研制出有效诱导SIgA分泌的粘膜疫苗迫在眉睫。
[0004]已知常规疫苗如灭活、蛋白疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗等，经常规途径免疫(肌肉注射、皮下等)通常不能诱导特异性粘膜免疫应答。无论疫苗的形式是什么，要诱导粘膜免疫应答通常需要将靶抗原从粘 膜部位接种，才能被粘膜中APC摄取并提呈，激活粘膜免疫系统，诱导粘膜免疫应答。
[0005]已知的粘膜接种抗原的瓶颈在于:粘膜局部纤毛的频繁物理摆动可迅速清除外来抗原；粘膜局部存在大量酸性溶液，富含水解酶、DNA酶等，可迅速降解外来抗原。因此粘膜部位接种抗原由于被迅速清除和降解，不能在粘膜局部有效停留，使不足以被APC提呈，不能诱导有效的粘膜免疫应答。即使诱导，其应答程度非常低下。
[0006]水疱型口炎病毒(VSV)能感染多种动物和昆虫。家畜中自然感染VSV的有马、牛(羊)、猪，而人群中自然状态下几乎不存在水疱型口炎病毒主动感染，对人的感染不会引起很明显的病症，因此将水疱型口炎病毒作为病毒载体疫苗是有潜在的可行性的。水疱型口炎病毒病毒内部为紧密盘旋的螺旋对称的核衣壳，VSV基因组为不分节段的线性单股负链RNA，长约llkb。从3’ 一5’端依次排列着N、NS (P)、M、G、L等5个不重叠的基因，分别编码核(N)蛋白、磷酸(P)蛋白、基质(M)蛋白、糖(G)蛋白、及RNA聚合酶(L)蛋白等5种不同的主要蛋白。其中核蛋白(N)和糖蛋白(G)在病毒免疫具有重要的意义。N基因编码的病毒核蛋白(N蛋白)，它可有效的保护病毒RNA免受各种核酸酶的消化。N基因编码的N蛋白呈群特异性，为许多型和亚型所共有，有高的抗原性，且在转录复制中担任了重要的角色。进入细胞的VSV的N蛋白作为优势抗原被V SV特异性CTL细胞识别，诱导CTL发挥作用，参与免疫反应。因此VSV作为病毒载体携带靶抗原，会增强机体的免疫应答强度，采取的粘膜部位接种免疫方式则会诱导机体产生更强的特异性黏膜免疫应答。
【发明内容】
:
[0007]本发明的目的在于提供一种用于预防病毒性心肌炎的重组病毒及其疫苗和应用，所述的这一种用于预防病毒性心肌炎的重组病毒及其疫苗和应用解决了现有技术中的疫苗对B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染所致病毒性心肌炎效果不好的技术问题。
[0008]本发明为一种重组病毒，以水疱型口炎病毒为载体，在所述的水疱型口炎病毒的囊膜糖蛋白G和聚合酶蛋白L之间插入编码抗原CVB3结构蛋白VPl基因。
[0009]进一步的，所述的编码靶抗原CVB3结构蛋白VPl基因的序列如SEQ ID N0:1所
/Jn ο
[0010]进一步的，所述的CVB3结构蛋白来源于CVB3Nancy株。
[0011 ] 进一步的，所述的水疱型口炎病毒来源于水疱型口炎病毒印第安纳株。
[0012]进一步的，上述的重组病毒通过反向遗传重组质粒在BHK21细胞中包装出重组的水疱型口炎病毒。
[0013]本发明还提供了上述的一种重组病毒的制备方法，通过如下方法制备:
[0014](I)选择靶抗原CVB3结构蛋白VPl基因，以质粒pXN2为载体，在所述的pXN2载体中插入编码靶抗原CVB3结构蛋白VPl基因，得到重组质粒PXN2-VPl。
`[0015](2)在培养皿中培养BHK细胞，待细胞长满40~70%的时候，收集BHK细胞；
[0016](3)用痘病毒在无血清DMEM培养基中与BHK细胞共孵育，然后用脂质体将水疱型口炎病毒的反向遗传重组质粒PXN2-VPl、pP、pL、pN、和pVSVG的五质粒系统转染到BHK细胞中，36-60h后收集细胞上清，过滤膜后高速离心，所述的离心浓缩后的病毒分装溶解在PBS中备用。
[0017]上述的pP、pL、pN、pVSVG质粒系统的具体构建方法参照文献Proc Natl Acad SciUSA.1995;92:4477-81，构建的方法为本领域的常规技术。
[0018]具体来说pP包含了水疱型口炎病毒印第安纳株磷酸蛋白，pL含了 RNA聚合酶蛋白、PN包含了病毒核衣壳蛋白、pVSVG包含了病毒糖蛋白、pXN2质粒包含了全长基因组核酸，在BHK细胞中同时转染这5个质粒，通过扩增纯化，可以得到野生型的水疱型口炎病毒。在本发明中，我们构建了重组质粒PXN2-VP1，在BHK21通过共转染pP、pL、pN、pVSVG和PXN2-VP15个质粒，在T7RNA聚合酶的作用下，质粒pL、pVSVG、pN、pP和pXN2_VPl转录翻译形成聚合酶蛋白、糖蛋白、核蛋白、磷蛋白，和正链病毒核酸，其中聚合酶蛋白、核蛋白和磷蛋白可以形成核蛋白转录复合物，把正链病毒核酸转录形成副链病毒基因组，在病毒装配过程中，副链病毒基因组、核蛋白转录复合物被包裹进核蛋白形成的病毒颗粒里，同时病毒表面出膜获得双层膜结构和糖蛋白，形成新的子代感染性病毒颗粒VSV-VPl。
[0019]进一步的,过滤膜后22000~28000rpm高速离心。
[0020]具体的，在VeroE6细胞中得到单一的重组病毒，扩大培养，浓缩病毒，得到纯化单一的重组的水疱型口炎病毒。
[0021]本发明还提供了一种疫苗，含有有效量的上述的一种重组病毒。
[0022]本发明还提供了上述的一种重组病毒或者上述的疫苗在制备预防病毒性心肌炎药物中的应用。
[0023]本发明还提供了一种粘膜疫苗的免疫方法:
[0024]I)采取滴鼻或口服的方式免疫小鼠；
[0025]2)只需I次免疫；
[0026]3)免疫剂量为25ul的IO6Pfu的重组水疱型口炎病毒。
[0027]本发明的疫苗可以以滴鼻、口服或经生殖道方式实施粘膜部位接种，能解决现有技术中常规疫苗无法有效诱导高强度的粘膜免疫应答，抗原不能在粘膜局部有效停留、不足以被APC提等技术问题。
[0028]本发明选择活病毒作为载体，携带特异性靶抗原基因，利用水疱型口炎病毒在细胞中的复制能力，高效快速的表达靶抗原，趋引T细胞到达疫苗给予的粘膜部位、促进CD8+T细胞应答等性质，来增强特异性粘膜免疫应答的诱导。由于病毒本身的特异性，会引起很强的固有免疫应答，激活机体的免疫系统，类似于佐剂的作用，随着病毒被免疫系统发现识别以及清除的过程中，病毒携带的靶抗原会充分被发现，区别于普通疫苗的抗原不稳定，易被降解，本发明的病毒载体的靶抗原会随着病毒的复制大量表达在胞浆中，充分被递呈给免疫细胞，引起机体的特异性免疫应答，由于采取的是粘膜部位接种疫苗，因此会诱导很强的局部黏膜免疫应答。
[0029]本发明的重组的水疱型口炎病毒可用于多种经粘膜感染病原体的预防或治疗性疫苗的粘膜递送。本发明的疫苗滴鼻或口服免疫小鼠，可有效诱导针对CVB3的特异性粘膜SIgA和全身IgG的产生，能否更好的预防病毒性心肌炎的发生。
[0030]本发明和已有技术相比较，其效果是积极和明显的。本发明的重组水疱型口炎病毒经鼻粘膜进行粘膜免疫，证实可有效`增强B3型柯萨奇病毒特异性血清和粘膜局部抗体应答，能有效的诱导全身和粘膜部位的SlgA抗体和T细胞应答，明显加强全身及肠道粘膜局部特异性CD8T细胞杀伤能力，显著提高免疫小鼠抵御病毒感染的能力，具备作为新型粘膜疫苗的应用价值和潜力。
【专利附图】
【附图说明】:
[0031]图1是VSV-VPl重组病毒反向遗传重组质粒构建示意图。
[0032]图2是重组的VSV-VPl病毒靶抗原以及VSV-G囊膜蛋白的免疫印迹检测示意图；A显示了重组的VSV-VPl病毒的构建示意图，B显示了 VSV-VPl感染BHK细胞后表达产物的western Blot鉴定；C显示了重组的VSV-VPl病毒感染BHK细胞的免疫荧光照片。
[0033]图3显示了 VSV-VPl病毒疫苗滴鼻免疫诱导小鼠产生的CVB3特异性血清IgG和粪便特异性IgA水平(A、B);血清特异性IgG抗体滴度和粪便特异性IgA抗体滴度(C、D)。
[0034]图4显示了 VSV-VPl病毒疫苗滴鼻免疫诱导小鼠诱生的CVB3特异性脾脏和肠系膜淋巴T细胞增殖能力(A、B),以及诱生的CVB3特异性脾脏和肠系膜淋巴T细胞CTL杀伤能力(C、D)。
[0035]图5显示了 VSV-VPl病毒疫苗滴鼻免疫小鼠产生的免疫保护作用。末次免疫后2周，以3LD50剂量的CVB3腹腔感染小鼠。显示第7天血清血清肌酶(CK)水平(A);显示第7天血清肌酶同功酶(CK-MB)水平(B);显示感染第7天体重下降水平(C);显示小鼠14天内的生存率曲线(D);显示第7天小鼠心脏病理改变情况(E)。[0036]图6显示了 VSV-VPl病毒疫苗滴鼻免疫可显著降低感染小鼠心脏和胰腺中病毒的滴度。
[0037]图1是水疱型口炎病毒的结构示意图。
【具体实施方式】
[0038]以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的使用和用途，而不是限制本发明。
[0039]实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下:
[0040]B3型柯萨奇病毒Nancy株(复旦大学中山医院卫生部病毒性心肌炎重点实验室提供)。质粒 pXN2, pP, pL, pN 和 pVSVG 来自 Dr.John Rose, Yale university,该实验室免费提供。宿主细菌DH5 a、BL21 (Invitrogen公司)。BHK21和VeroE6由本实验室保存。基因合成委托上海赛百盛公司。HRP标记羊抗小鼠IgG多克隆抗体，HRP标记羊抗小鼠IgA多克隆抗体(SouthernBiotech公司)。限制性核酸内切酶XhoI和NheI (TaKaRa公司)、T4DNA连接酶(TaKaRa) ；Taq DNA聚合酶(Promega 公司)；dNTP (Promega) ;LB 培养基(英国 OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、EB (上海化学试剂采购供应站)，Tris (USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜公司)，大量质粒抽提试剂盒(Qiagen),乳酸脱氢酶LDH试剂盒购自Roche。6-8周龄雄性BALB/c (H-2d)小鼠购自上海斯莱克实验动物中心，清洁级饲养。动物饲养及操作符合国家相关规定。
[0041]实施例1 Hela细胞培养及CVB3病毒传代:
[0042]本发明的人宫颈癌 细胞系Hela细胞按常规方法培养，以含10%NBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和硫酸卡那霉素的RPM1-1640培养基在37°C、5%C02条件下培养，隔天传代。以IOOul CVB3病毒冻存液感染约5 X IO6Hela细胞，培养40hr后80%细胞被复制病毒裂解，将液体及细胞碎片以3000rpm/min离心20min，所得上清即新鲜CVB3悬液。
[0043]实施例2 CVB3病毒的LD5tl (半数致死量)滴定:
[0044]取出生48h的BALB/c乳鼠，分为8组，每组6只小鼠，将新鲜制备的CVB3悬液以10倍递次稀释法依次稀释为10—1、10_2、10_3、ΙΟ'ΙΟ—5、10_6、10_7、10_8，分别取100 μ I经腹腔注射8组乳鼠，逐日观察乳鼠存活情况，按病毒学常规方法计算该批次CVB3病毒的LD5tl效价。距离比例=(>50%的死亡百分数一 50) / 050%的死亡百分数一〈50%的死亡百分数)LD50 = >50%的死亡率稀释度的对数(Log) +距离比例
[0045]本试验中同一批次内CVB3的LD5tl效价为l(T5 5/100ul。
[0046]实施例3重组VSV病毒的构建及体外表达功能鉴定
[0047]I靶抗原质粒pXN2-VPl构建:以CVB3结构蛋白VPl为靶抗原构建了以pXN2为载体的pXN2-VPl质粒。其中，VPIcDNA序列根据文献(Klump WM, et al.JVirol, 1990,64(4): 1573-1583)，具体如 SEQ ID NO:1 所示。
[0048]I)从新鲜培养的CVB3 (Nancy株)中经RT-PCR获得CVB3VP1基因。
[0049]设计VPl 上下游引物:KVl:5' -CCCAAGCTTGCCACCATGGGCCCAGTG GAAGACGCG-3'；KV2:5' -CGGGATCCTTACTAAAATGCGCCCGTA TTTGT C-3 '。按上海华舜生物公司 RNAexReagent&System Kit 提取病毒 RNA，CVB3 总 RNA 以 20 μ IDEPC H2O 溶解，_80°C保存。
[0050]cDNA 逆转录按上海生工生物公司 2_N First Strand cDNA Synthesis Kit 进行:总体积 20μ 1，5μ I 病毒 RNA，加 1μ I Oligo dT、6ul DEPC 水，70°C 5min ;于 4°C 加缓冲液 4 μ 1、dNTP2 μ 1、Rnase 抑制剂 I μ I, 37°C 5min，加 MMLV 逆转录酶 I μ 1,37°C 60min,70 V IOmin,得cDNA，-20 °C保存。特异引物PCR扩增:总体积25 μ 1，水13.3ul、10XPCR2.5μ l、50mmol/L MgCl2L 5 μ 1、2.5mmol/L dNTP0.5 μ 1、IOpmol/μ I KV-1/KV-2引物各 0.5 μ 1、TaqDNA 聚合酶 IU、cDNA 模板 5 μ I。反应条件:94 °C 5min,94°C lmin,58°C 2min, 72°C 2min，35 循环，72°C IOmin0 得 VPl 基因。
[0051]3)胶回收经RT-PCR所得VPl基因:电泳琼脂糖内RT-PCR产物以Golden BeadsDNA Gel Purification Kit 纯化回收，每 IOmg 胶加 400 μ I Solution S 液、20 μ I GoldenBeads, 65°C IOmin ; 12000rpm 离心 lmin,去上清，加 500 μ I Wash Solution, 12000rpm 离心lmin,去上清，50°C 5min ;以 20 μ I Elution Buffer 洗脱，37°C 2min, 12000rpm 离心 lmin,上清含回收VPlDNA和Ltn DNA。
[0052]4)回收VPlDNA 以 Xho1、NheI 双酶切:总体积 20 μ 1，Η2013μ 1,10ΧΗ buffer2 μ 1，DNA5y I, XhoI,NheI 各 1U，37°C 2hr，走 1.0%琼脂糖电泳，割胶经 Golden Beads 回收 VPl 双酶切产物；同理将pXN2质粒以Xho1、NheI双酶切，酶切产物回收、定量。
[0053]5)VP1酶切片段与pXN2酶切载体连接:按摩尔比3:1连接，总体积10 μ 1，10X连接酶 Bufferl μ 1，pcDNA3.1 双酶切产物 3 μ 1，VPl 酶切产物 5ul，Ligase 酶 lul，4°C过夜，转化DH5a，筛阳性单克隆。
[0054]6)质粒pXN2-VPl鉴定:分别经PCR、酶切和DNA测序来鉴定。PCR鉴定:以T7-1/T7-2、T7-l/KV-2 以及 T7-2/KV-1 为正反向引物鉴定 VPl 插入；以 T7-1/Ltn_2、T7-2/Ltn_l鉴定Ltn插入；以Xho1、NheI双酶切pXN2_VPl，以Xho1、NheI双酶切pXN2_VPl。由上海Invitrogen DNA测序服务中心进行DNA测序鉴定。
[0055]7) pXN2-VPl的鉴定:pXN2_VPl经Xho1、NheI双酶切可切出877bp条带。鉴定结果表明，VPl基因被有效构建`于VSV病毒包装载体中。
[0056]8)如图1所示，VSV-VPl重组病毒的包装:首先在IOcm培养皿中培养BHK细胞，待细胞长满50%，用IOul痘病毒(MOI=IO)在无血清DMEM培养基中与BHK细胞共孵育2h，用痘病毒感染BHK (10cm dish)细胞，然后用脂质体2000将水疱型口炎病毒的反向遗传重组质粒 PXN2-VPl (IOug), pP (5ug), pL (lug), pN (3ug)和 pVSVG(2ug)的五质粒系统转染到 BHK细胞中，48h后收集细胞上清，过0.22um的滤膜后25000rpm高速离心，所述的离心浓缩后的重组的VSV-VPl病毒分装溶解在IOOul PBS中，用TCID50的方法测定病毒载量后，将剩余的病毒保存于_80°C冰箱。
[0057]9)如图2所示，将重组的VSV-VPl感染新鲜的BHK细胞6h后，收集细胞样品，经SDS-PAGE分离蛋白表达产物，转膜，然后以抗VPl和抗VSV-G囊膜蛋白特异性抗体孵育并显色，结果显示:VP1可在体外有效表达，表达产物VPl约为34KD，VSV-G约为55KD。
[0058]实施例4新型病毒疫苗VSV-VPl滴鼻免疫可诱导CVB3全身和粘膜特异性抗体应答
[0059]I)小鼠滴鼻免疫方法及血清、粪便收集
[0060]以水疱型口炎病毒作为病毒载体预防病毒性心肌炎的粘膜疫苗，将6-8周BALB/c雄性小鼠分为3组，滴鼻免疫，分别为=VSV-VP 1、VSV-GFP、PBS (对照组)，每组6只小鼠。滴鼻免疫程序如下:以0.75%戊巴比妥钠80-120 μ I经腹腔注射小鼠，使小鼠轻微麻醉。以含有VSV-VPl的PBS病毒疫苗溶液逐滴滴入小鼠两侧鼻腔，其它两组采取相同的操作方法。每两周经眼眶后目此静脉采血，37°C静置30min,6000rpm离心10min,收集血清，分装冻存于-70°C。同时，收集小鼠粪便标本，以100mg/ml浓度溶解于PBS溶液中(5%脱脂牛奶、IOmM Leupeptin、I μ g/ml aprotinin、ImM PMSF),充分混旋后离心收集上清冻存 _70°C。
[0061]2) CVB3特异性血清IgG和肠道SIgA的ELISA检测:
[0062]ELISA 方法:以 10ug/ml CVB4VP1237 ~249 多肽、包被液(0.1M Na2CO3, pH9.6、
0.1%BSA)4°C包板；以5%milk-PBS封闭；依次加1:40稀释血清及粪便原液、HRP-羊抗小鼠IgG, IgA, OPD,显色中止，测 0D49(lnm。
[0063]VSV-VPl免疫组在免疫2周后即诱生了较高水平的特异性IgG，第4周OD值达
0.88，且随时间推移IgG水平逐渐降低，IgG抗体效价在第4周时高达3500。而单独的空病毒VSV-GFP不能诱生血清IgG，第4周IgG效价约为200，明显低于前者。更为重要的是:VSV-VP1有效的诱生了粘膜SIgA的分泌，第2周OD值高达1.1，而单独VSV-GFP组为
0.35 ;结果显示VSV-VPl病毒疫苗经滴鼻免疫不仅可诱生高水平血清IgG，还能增强肠道局部SIgA的产生(如图3所示)。
[0064]实施例5以水疱型口炎病毒作为载体预防病毒性心肌炎的疫苗滴鼻免疫可诱导脾脏和肠系膜淋巴结T细胞的特异性增殖和CTL杀伤
[0065]I)小鼠脾脏和肠系膜淋巴结T细胞增殖功能检测
[0066]小鼠脾脏和肠系膜淋巴结T细胞增殖功能使用Roche Brdu cell proliferationELSA试剂盒进行检测，方法如下:取末次免疫后2周，各组小鼠脾脏及肠系膜淋巴结(MLN)细胞，制备无红细胞的淋巴细胞悬液，调整浓度为4X106/ml，加入96孔板，100 μ I/孔，以终浓度为20 μ g/ml的VPl蛋白为刺激物，以1640作为空白对照，培养72h后加入Brdulabeling solution, 0.1 μ I/孔，24h 后收集细胞,固定后加入 ant1-Brdu-PODI μ I/孔,PBS洗涤后，TMB室温显色lOmin，2N H2S04终止，测0D450nm值。
[0067]结果显示:与VSV-GFP免疫组相比，VSV-VPl免疫组脾脏细胞对VP1237_249产生了很强烈的增殖反应(图4A，P〈0.05)。不仅如此，其诱导的肠系膜淋巴结局部特异性T细胞也显著强于对照组(图4B，0D值0.75vs0.25)，提示该粘膜疫苗滴鼻免疫可显著增强全身和远端粘膜局部的特异性T细胞增殖反应。
[0068]2)小鼠脾脏和肠系膜淋巴结T细胞CTL功能检测
[0069]以灭活的CVB3刺激培养24h的SP2/0细胞作为靶细胞，制备方法如下:靶细胞按100 μ 1/1 X IO4/孔加入96孔U底板。末次免疫后2周，以3LD50CVB3腹腔感染小鼠，4d后取小鼠脾脏和肠系膜淋巴结细胞，调整浓度为5X106/ml。以该浓度为起始(即效靶比50:1)在板外作倍比稀释，依次为2.5 XlO6M (25:1)、1.25 X 106/ml (12.5:1)，各按100 μ I/孔加入96孔板中，加样均为三复孔。LDH释放对照组的设计(每组均设3个复孔):
(I)培养液对照组:单纯无血清1640培养液200 μ I/孔；(2)LDH低释放组:靶细胞100 μ I/孔+无血清1640培养液100 μ I/孔；(3) LDH高释放组:靶细胞100 μ I/孔+细胞裂解液(2%TritonX-100溶液)100 μ I/孔；(4)效应细胞对照组:分别为效应细胞5X IO5/孔，
2.5 X IO5/孔，1.25 X IO5/孔+培养液100 μ I/孔。将已加入细胞的96孔板置37°C，体积分数5%C02培养箱中培养72h。培养结束后将培养板以250g速度离心10min。每孔取100 μ I细胞培养上清液，加入96孔平底细胞培养板中，于每孔中加入100 μ I LDH反应液(Roche)，室温避光放置30min。将细胞板置于酶标仪中检测492nm的吸光度(A)值。特异性CTL活性的
[0070]计算方法:CTL细胞毒相对活性=[(A效靶细胞混合一 A效应细胞对照一 A低释放对照)/ (A高释放对照一 A低释放对照)]X 100%。
[0071]结果显示，效靶比为50:1时，VSV-VPl组脾脏和肠系膜淋巴结T细胞特异性杀伤率达50%和55%，远高于VSV-GFP组(图4C和D)，提示VSV-VPl病毒疫苗有效诱生了较强的CVB3特异性全身和粘膜局部T细胞CTL应答，有效的抵抗了 CVB3感染。
[0072]实施例6新型病毒疫苗VSV-VPl滴鼻免疫可显著减轻CVB3感染小鼠诱导的病毒性心肌炎病情
[0073]I) CVB3感染后免疫小鼠体重和心肌损伤血清学指标变化情况
[0074]末次免疫后2周，以诱导小鼠心肌炎的病毒剂量(3LD50CVB3)腹腔感染小鼠，称取第O天和第7天体重改变，初步评估心肌炎严重程度。结果显示:感染初期，各组小鼠体重基本相同，但至第7天，对照组小鼠体重下降最为显著，而VSV-VPl组均重为27.5g，显著高于其他组(图5C)。此外，于感染第7天取血清，于生化分析仪Modular P800上检测肌酸激酶CK和肌酸激酶同工酶CK-MB水平。结果显示:与其他组相比，VSV-VPl组血清CK和CK-MB水平较低(图5A5B)，提示其心肌损伤程度最轻。末次免疫后2周，以致死剂量的CVB3(3LD50)腹腔感染小鼠，观察小鼠在14天内的存活率，与其他组相比，VSV-VPl免疫组小鼠存活率高达70% (图OT)，上述结果提示VSV-VPl滴鼻免疫可提供高效的预防心肌炎的免疫保护效果。
[0075]2) CVB3感染后免疫小鼠心肌病理改变
[0076]末次免疫后2周，以诱导心肌炎病毒剂量(3LD50)腹腔感染小鼠，于第7天取心脏行石蜡切片和HE染色，具体方法如下:将心脏在PBS中洗净，4%多聚甲醛固定24小时、脱水、石蜡包埋后切片，行HE染色`，染色步骤:二甲苯I (IOmin) —二甲苯II (IOmin) —100% I的乙醇中(2min) —100% II的乙醇中(2min) — 95%的乙醇中(2min) — 90%的乙醇中(2min) —80%的乙醇中(2min) —自来水缸中浸泡5min—苏木素染核7min—水洗(2min) 一 1%的盐酸酒精分化(5s)—水洗一弱氨水返蓝一水洗一镜下观察一伊红染胞质(20s) 一水稍洗一80%的乙醇(3s) —95%的乙醇I (3s) — 95%的乙醇II (3s) —100% I的乙醇中(5s) —100% II的乙醇中(5s) —二甲苯I (5min) —二甲苯II(5min) —中性树胶封片。随后于显微镜下观察拍照。
[0077]结果显示:对照组心室内外壁均出现大量严重的灶性坏死，大量心肌细胞被破坏，而代之以成团的炎性淋巴细胞浸润，心肌坏死损伤比较严重；VSV-VP1组免疫组心肌损伤较轻，部分小鼠心肌除有细胞浊肿现象和少量的淋巴细胞浸润，无明显异常，近似于正常心肌细胞(图5E)。结果提示=VSV-VPl新型疫苗滴鼻免疫可有效预防病毒性心肌炎的发生。
[0078]实施例7新型病毒疫苗VSV-VPl滴鼻免疫可显著减轻CVB3感染小鼠心脏病毒载量
[0079]末次免疫后2周，以诱导心肌炎病毒剂量(3LD50的CVB3)腹腔感染小鼠，于第7天取心脏，匀浆后取上清，在Hela细胞中测定病毒的TCID50 (50%细胞培养物感染剂量)来确定器官中CVB3病毒载量，具体方法如下:病毒滴度测定前一天，铺2 X IO4/孔的Hela细胞入96孔板中作为被感染细胞。剪取3LD50CVB3攻击后7天小鼠心脏或胰腺组织，称重后重悬于完全培养基中。组织反复冻融后，匀浆离心取上清并作10倍倍比稀释。取各稀释度上清接种于各孔Hela细胞表面，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100 μ I。逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。按Reed-Muench两氏法计算结果。
[0080]结果显示:与对照组和VSV-GFP组相比，VSV-VPl组心脏和胰腺组织病毒载量显著降低(如图6所示)，提示该疫苗滴鼻免疫后机体可有效清除体内病毒，显著降低病毒性心肌炎的病情。`
【权利要求】
1.一种重组病毒，其特征在于:以水疱型口炎病毒为载体，在所述的水疱型口炎病毒的囊膜糖蛋白G和聚合酶蛋白L之间插入编码抗原CVB3结构蛋白VPl基因。
2.如权利要求1所述的一种重组病毒，其特征在于:所述的编码靶抗原CVB3结构蛋白VPl基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的一种重组病毒，其特征在于:所述CVB3结构蛋白来源于CVB3Nancy 株。
4.如权利要求1所述的一种重组病毒，其特征在于:所述的水疱型口炎病毒来源于水疱型口炎病毒印第安纳株。
5.如权利要求1所述的一种重组病毒，其特征在于:通过反向遗传重组质粒在BHK21细胞中包装出重组的水疱型口炎病毒。
6.权利要求1所述的一种重组病毒的制备方法，其特征在于通过如下方法制备: (1)选择靶抗原CVB3结构蛋白VPl基因，以质粒pXN2为载体，在所述的pXN2载体中插入编码靶抗原CVB3结构蛋白VPl基因，得到质粒PXN2-VPl ； (2)在培养皿中培养BHK细胞，待细胞长满40-70%的时候，收集BHK细胞； (3)用含有Τ7RNA聚合酶的痘病毒在无血清DMEM培养基中与BHK细胞共孵育，然后用脂质体将水疱型口炎病毒的反向遗传重组质粒pXN2-VPl、pP、pL、pN、和pVSVG的五质粒系统转染到BHK细胞中，36-60h后收集细胞上清，过滤膜后高速离心，所述的离心浓缩后的病毒分装溶解在PBS中备用。
7.一种疫苗，其特征在于:含有有效量的权利要求1所述的重组病毒。
8.权利 要求1所述的重组病毒或者权利要求7所述的疫苗在制备预防病毒性心肌炎药物中的应用。
【文档编号】C12N15/86GK103865890SQ201410125958
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】熊思东, 董春升, 徐薇, 吴飞 申请人:苏州大学