用于前列腺相关病症的诊断、预后和治疗的基于微rna的方法和组合物的制作方法

用于前列腺相关病症的诊断、预后和治疗的基于微rna的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本申请公开了用于前列腺相关病症的诊断、预后和/或治疗的方法和组合物。特别地，本申请公开了一种方法，所述方法诊断受试者是否患有前列腺相关病症或处于发生前列腺相关病症的风险中，确定患有前列腺相关病症的受试者的预后和/或治疗患有前列腺相关病症的受试者的前列腺相关病症，所述方法包括：测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平；其中相对于对照样品中相应的生物标志物的水平，测试样品中生物标志物的水平的改变表示受试者患有所述病症或处于发生所述病症的风险中。
【专利说明】用于前列腺相关病症的诊断、预后和治疗的基于微RNA的
方法和组合物
[0001]本申请是申请日为2009年2月27日、申请号为200980111708.1的同名申请的分
案申请。
[0002]交叉参考相关申请
[0003]本申请要求2009年2月27日提交的PCT申请PCT/US2009/035470 (其要求2008年2月28日提交的美国临时申请61/067，518的优先权)的权益，其全部公开内容明确地通过引用合并入本文。
[0004]关于联邦政府支助的研究的声明
[0005]本发明是在NIH, Nat1nal Cancer Institute, Center for Cancer Research 的内部研究项目下由政府支助并且由Nat1nal Institutes of Health基金CA081534和CA128609支助进行的。政府在本发明中具有某些权利。
[0006]本发明的【技术领域】和工业适用性
[0007]本发明总地说来涉及分子生物学领域。本发明的某些方面包括在前列腺相关病症的诊断、治疗和预后中的应用。
[0008]发明背景
[0009]不承认本部分中公开的【背景技术】在法律上构成了现有技术。
[0010]来源于基因微阵列的表达特征谱已为前列腺癌的生物学提供了新的认识。已使前列腺肿瘤中的mRNA表达模式与Gleason评分、侵袭性肿瘤亚型和疾病复发产生关联(I ；2)。此外，来源于原发性肿瘤的mRNA表达特征(signature)已导致用于前列腺癌的早期检测的新型候选诊断标志物例如a-甲基酰基-CoA消旋酶的发现(3)。此类发现证明，已切除的肿瘤的基因表达特征谱提供了鉴定前列腺癌的新型诊断和预后标志物的可能。
[0011 ] 最近，已描述了称为微RNA的新类型小RNA (4)，发现其通过调控mRNA的稳定性和mRNA至蛋白质的翻译来调控mRNA功能(5 ；6)。微RNA基因表达为称为pr1-mRNA的大前体RNA，其可编码以多顺反子排列的多个微RNA (7)。此类前体通过细胞核RNA酶III，Drosha以及细胞溶质RNA酶III,Dicer转变成19至25个核苷酸的成熟微RNA。这两种酶和它们的辅因子例如DGCR8/Pasha、TRBP和EIF2C2/argonaute_2是微RNA加工活性的至关重要的组分。改变它们的表达水平可改变细胞功能和诱导细胞转化(8)。
[0012]已证明微RNA在癌症中的决定性作用(9)。它们的表达在实体人肿瘤中通常发生改变(10-13)。微RNA表达特征谱还通过发育谱系和分化状态来分类肿瘤(10; 14)。已显示多个微RNA具有致癌性质(15-17)，或如肿瘤抑制基因一样起作用(18 ；19)。此类微RNA称为onComiR(20)。它们的表达的改变与癌症发生具有因果关联。
[0013]尽管对治疗此类疾病的疗法进行了相当多的研究，但仍然难以有效地诊断和治疗它们，并且在患者中观察到的死亡率表明，需要改进前列腺癌的诊断、治疗和预防。
[0014]概述
[0015]在第一个广泛的方面，本文中描述了诊断受试者是否具有前列腺相关病症或处于发展前列腺相关病症的风险中，确定患有前列腺相关病症的受试者的预后和/或治疗患有前列腺相关病症的受试者的前列腺相关病症的方法，其包括:测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平，其中相对于对照样品中相应的生物标志物的水平，测试样品中生物标志物的水平的改变表示受试者患有所述病症或处于发展所述病症的风险中。
[0016]在某些实施方案中，测试样品中至少一个生物标志物的水平低于对照样品中相应的生物标志物的水平。
[0017]在某些实施方案中，测试样品中至少一个生物标志物的水平高于对照样品中相应的生物标志物的水平。
[0018]在某些实施方案中，至少一个生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为图11-表2中所列的一个或多个miR或其功能性变体。
[0019]在某些实施方案中，至少一个生物标志物选自图11-表2中所列的在前列腺肿瘤中上调的一个或多个HiiR或其功能性变体:miR-32、miR-182、miR-31、miR-26a_l/2、miR-200c、miR-375、miR-196a_l/2、miR-370、miR-425、miR-194-1/2、miR-181a_l/2、miR-34b、let_71、miR-188、miR-25、miR_106b、miR-449、miR_99b、miR-93、miR-92-1/2、miR-125a。 [0020]在某些实施方案中，至少一个生物标志物选自图11-表2中所列的在前列腺癌中下调的一个或多个miR或其功能性变体:miR-520h、miR-494、miR-490、miR-133a_l、miR-1-2、miR-218-2、miR-220、miR_128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR_34a、miR-487、let_7b。
[0021]在某些实施方案中，至少一个生物标志物与前列腺外疾病相关，并且选自图12-表3中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR-101-l/2、miR_200a、miR_200b、miR-196a-l/2、miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186、miR-195、let_7f_2、miR_34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。
[0022]在某些实施方案中，至少一个生物标志物显示miR-1与前列腺肿瘤中靶基因转录物水平之间的负相关，并且选自图13A-表4A中所列的一个或多个基因或其功能性变体。
[0023]在某些实施方案中，至少一个生物标志物选自图13B-表4B中所列的一个或多个 miR 或其功能性变体:miR-l、miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、miR_181a、miR-182、miR-194、miR-196a、miR-200c、miR-218-2、miR-220、miR-329、miR-338、miR_369、miR-409-3p、miR-410、miR-448、miR-490、miR-494、miR-499、miR-520h 和 let_7i。
[0024]在某些实施方案中，所述方法包括显示与前列腺肿瘤中miR_181a呈负相关的探针组，其中探针组包括图14-表5中所列的一个或多个基因或其功能性变体。
[0025]在某些实施方案中，至少一个生物标志物是雄激素应答生物标志物，并且选自图15-表6中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR-338、miR-126-5p、mir-181b-l簇、miR181c 簇、miR-219_5p 和 miR221 簇。
[0026]在某些实施方案中，至少一个生物标志物选自图16-表7中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR-126、miR_146b、miR_146b、miR-181b_l、miR-181b_l、miR-181b_l、miR-181b-l、miR-181b_l、miR_181c、miR_181c、miR-219-1、miR-219-1、miR-219-1、miR-221、miR-221、miR-221、miR-221、miR-338、miR-338。
[0027]在某些实施方案中，至少一个生物标志物选自图23-表9中所列的在前列腺癌中在具有神经周浸润(perineural invas1n)的肿瘤中上调的一个或多个miR或其功能性变体:miR-224、miR-21、miR-?Ο (a/b)、miR_125b (-1/2)、miR-30a/b/c_2/d、miR-100、miR-24(-l/2)、miR-15a_2、miR-191、miR_99b、miR_27a/b、miR-26a (-1/2)、miR-126、miR-145、miR-195、miR-181a-l、miR-199b、miR-151、let_7g。
[0028]在某些实施方案中，至少一个生物标志物在PNT肿瘤组织与非PNT肿瘤组织之间差异表达，并且是图24-表12中所列的一个或多个基因或其功能性变体。
[0029]在某些实施方案中，所述方法包括:Dicer和DGCR8 (在前列腺肿瘤中)和/或编码argonuate-2的EIF2C2和Dicer (在具有高Gleason评分的肿瘤中)中的一个或多个的增加的表达。
[0030]在某些实施方案中，样品包括血液样品。
[0031]在某些实施方案中，样品包括血清或血浆血液样品的一种或多种。
[0032]在另一个方面，本文中描述了生物标志物，其包含至少一个在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达的生物标志物，并且是图11-表2中所列的一个或多个miR或其功能性变体。
[0033]在另一个方面，本文中描述了生物标志物，其包含至少一个选自下列的生物标志物:图11-表2中所列的在前列腺肿瘤中上调的一个或多个miR或其功能性变体:miR-32、miR-182、miR-31、miR-26a_l/2、miR_200c、miR-375、miR-196a_l/2、miR-370、miR-425、miR-194-1/2、miR-181a_l/2、miR_34b、let_71、miR-188、miR-25、miR_106b、miR-449、miR_99b、miR-93、miR-92-1/2、miR_125a。
[0034]在另一个方面，本文中描述了生物标志物，其包含至少一个选自下列的生物标志物:图11-表2中所列的在前列腺肿瘤中下调的一个或多个miR或其功能性变体:miR_520h、miR-494、miR-490、miR-133a_l、miR-1-2、miR-218-2、miR-220、miR_128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR_34a、miR-487、let_7b。
[0035]在另一个方面，本文中描述了生物标志物，其包含至少一个与前列腺外疾病相关且选自下列的生物标志物:图12-表3中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR-101-1/2、miR_200a、miR_200b、miR-196a_l/2、miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186、miR-195、let_7f_2、miR_34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。
[0036]在另一个方面，本文中描述了生物标志物，其包含图13A-表4A中所列的一个或多个基因或其功能性变体。
[0037]在另一个方面，本文中描述了生物标志物，其选自图13B-表4B中所列的一个或多个 miR 或其功能性变体miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、miR_181a、miR-182、miR-194、miR-196a、miR-200c、miR-218-2、miR-220、miR-329、miR-338、miR_369、miR-409-3p、miR-410、miR-448、miR-490、miR-494、miR-499、miR_520h 和 let_7i。
[0038]在另一个方面，本文中描述了生物标志物，其包含在前列腺肿瘤中显示与miR-181a呈负相关的探针组，其中所述探针组包括图14-表5中所列的一个或多个基因或其功能性变体。
[0039]在另一个方面，本文中描述了生物标志物，其包含至少一个为雄激素应答生物标志物并且选自下列的生物标志物:图15-表6中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR-338、miR-126-5p、mir-181b-l 簇、miR181c 簇、miR-219_5p 和 miR221 簇。[0040]在另一个方面，本文中描述了生物标志物，其包含至少一个选自下列的生物标志物:图16-表7中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR-126、miR_146b、miR_146b、miR-181b-l、 miR-181b_l、 miR-181b_l、 miR-181b_l、 miR-181b_l、 miR_181c、 miR_181c、miR-219-1、miR-219-1、miR-219-1、miR-221、miR-221、miR-221、miR-221、miR-338、miR-338o
[0041]在另一个方面，本文中描述了生物标志物，其包含至少一个选自下列的生物标志物:图23-表9中所列的在前列腺癌中在具有神经周浸润的肿瘤中上调的一个或多个miR 或其功能性变体:miR-224、miR-21、miR_10(a/b)、miR_125b (-1/2)、miR-30a/b/c_2/d、miR-100、miR-24(_l/2)、miR-15a_2、miR-191、miR_99b、miR_27a/b、miR_26a (-1/2)、miR-126、miR-145、miR-195、miR-181a-l、miR-199b、miR-151、let_7g。
[0042]在另一个方面，本文中描述了生物标志物,其包含至少一个在PNT肿瘤组织与非PNT肿瘤组织之间差异表达并且是图24-表12中所列的一个或多个基因或其功能性变体的生物标志物。
[0043]在另一个方面，本文中描述了生物标志物，其包括Dicer和DGCR8 (在前列腺肿瘤中)和/或编码argonuate-2的EIF2C2和Dicer (在具有高Gleason评分的肿瘤中)中的一个或多个的增加的表达。
[0044]在另一个方面，本文中描述了前列腺肿瘤中独特的微RNA表达特征，其包括一个或多个调控肿瘤微RNA加工的生物标志物的表达的改变。
[0045]在另一个方面，本文中描述了影响前列腺中靶mRNA的转录物丰度和/或蛋白质表达的方法，其包括使有此需要的受试者中一个或多个微RNA失调。
[0046]在某些实施方案中，所述方法括抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
[0047]在某些实施方案中，所述方法包括改变miR-32和miR_106b中的一个或多个的表达以抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
[0048]在另一个方面，本文中描述了微RNA和编码蛋白质的RNA的大规模基因表达特征谱分析用于鉴定在人前列腺肿瘤中发生的微RNA功能的改变的用途。
[0049]在另一个方面，本文中描述了前列腺相关病症的肿瘤基因特征，包括:下列中的一个或多个:上调的 miR-32,然后 miR-182，miR-31, miR_26a，miR_200c，miR_196a ;和miR-106b-25簇；和/或下列中的一个或多个:显著下调的miR_520h，miR-494, miR-490和miR-1-133a 簇。
[0050]在另一个方面,本文中描述了以低误差边际(margin of error)与前列腺外疾病扩展相关的肿瘤特征，其包括miR-ΙΟ?。
[0051]在某些实施方案中，生物标志物包括在前列腺肿瘤中增加的前列腺中的宿主基因表达。
[0052]在某些实施方案中，生物标志物包括下列中的一个或多个:被上调并且其表达分别与内含子微RNA，miR-32和miR-106b_25簇的表达相关的C9orf5和MCM7。
[0053]在另一个方面，本文中描述了 miR-106b靶向前列腺癌细胞中E2F1和/或⑶KNlA基因和/或用于抑制E2F1和/或CDKNlA基因的蛋白质表达的用途。
[0054] 在另一个方面，本文中描述了通过改变前列腺癌细胞中miR-Ι的表达进行的XP06和PTK9中的一个或多个的调控。[0055]在另一个方面，本文中描述了微RNA与3’ UTR序列的结合导致哺乳动物细胞中靶mRNA的降解和/或积累的用途。
[0056]在另一个方面，本文中描述了人组织中微RNA与mRNA之间的负相关和/或正相关用于预测微RNA的靶基因的用途。
[0057]在另一个方面，本文中描述了用于鉴定受微RNA调控的mRNA的方法，其包括进行人组织中的微RNA和mRNA表达的相关分析。
[0058]在另一个方面，本文中描述了包含miR-32和miR-106b中的一个或多个的miR表达反义抑制剂。
[0059]在另一个方面，本文中描述了前列腺病症或疾病的oncomiR生物标志物，其包括:miR-Ι、miR-32 和 mir-106b_25 簇中的一个或多个。
[0060]在另一个方面，本文中描述了用于调控前列腺癌细胞中蛋白质表达的方法，其包括调控前列腺癌细胞中的miR-Ι、miR-32和mir-106b_25簇中的一个或多个的表达。
[0061]在另一个方面，本文中描述了用于抑制前列腺癌细胞中输出蛋白-6(exportin_6)和PTK9中的一个或多个的表达的组合物，所述组合物包含miR-Ι或其功能性变体。
[0062]在另一个方面，本文中描述了用于调控有此需要的受试者中E2F1和p21/WAFl蛋白水平的一个或多个的方法，其包括使用miR-106b或其功能性变体。
[0063]在另一个方面，本文中描述了包含反义miR_106b的组合物，其用于增加有此需要的受试者中前列腺癌细胞中P21/WAF1和/或E2F1的蛋白水平。
[0064]在某些实施方案中，所述方法包括确定患有前列腺癌的受试者的预后，其包括测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平，其中:i)生物标志物与前列腺癌中不利的预后相关；和ii)相对于对照样品中相应的生物标志物的水平，前列腺测试样品中至少一个生物标志物的水平的改变表示不利的预后。
[0065]在某些实施方案中，所述方法包括诊断受试者是否患有前列腺癌或处于发生前列腺癌的风险中，包括:(1)从获自受试者的测试样品反转录RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；(2)将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和(3)将测试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，其中至少一个miRNA的信号的改变表示受试者患有前列腺癌或处于发生前列腺癌症的风险中。
[0066]在某些实施方案中，相对于从对照样品产生的信号，至少一个miRNA的信号下调，和/或其中相对于从对照样品产生的信号，至少一个miRNA的信号上调。
[0067]在某些实施方案中，选自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的组的至少一个生物标志物的信号的改变表示受试者患有具有不利预后的前列腺癌或处于发生所述癌症的风险中。
[0068]在另一个方面，本文中描述了治疗患有前列腺癌的受试者的前列腺癌的方法，在所述前列腺癌中至少一个生物标志物在受试者的癌细胞中相对于对照细胞下调或上调，所述方法包括:(I)当至少一个生物标志物在癌细胞中下调时，给受试者施用有效量的至少一个分离的生物标志物，或其分离的变体或生物学活性片段，以便受试者中癌细胞的增殖被抑制；或(2)当至少一个生物标志物在癌细胞中上调时，给受试者施用有效量的至少一种抑制至少一个生物标志物的表达的化合物，以便受试者中癌细胞的增殖被抑制。[0069]在另一个方面，本文中描述了治疗受试者的前列腺癌的方法，其包括:(1)测定相对于对照细胞，前列腺癌细胞中至少一个生物标志物的量；和(2)通过:(i)如果癌细胞中表达的生物标志物的量低于对照细胞中表达的生物标志物的量，给受试者施用有效量的至少一个分离的生物标志物；或Qi)如果癌细胞中表达的生物标志物的量高于对照细胞中表达的生物标志物的量，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一个生物标志物的表达的化合物来改变前列腺癌细胞中表达的生物标志物的量。
[0070]在另一个方面，本文中描述了用于治疗前列腺癌的药物组合物，其包含至少一个分离的生物标志物和可药用载体。
[0071]在某些实施方案中，药物组合物包括其中至少一个分离的生物标志物相应于相对于对照细胞在前列腺癌细胞中下调的生物标志物。
[0072]在某些实施方案中，药物组合物包含至少一个miR表达抑制剂化合物和可药用载体。
[0073]在另一个方面，本文中描述了鉴定抗前列腺癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂和测量与前列腺癌细胞中减少的表达水平相关的至少一个生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的增加表示测试试剂是抗前列腺癌试剂。
[0074]在另一个方面，本文中描述了鉴定抗前列腺癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂和测量与前列腺癌 细胞中增加的表达水平相关的至少一个生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的减少表示测试试剂是抗前列腺癌试剂。
[0075]在另一个方面，本文中描述了评估疗法预防、诊断和/或治疗前列腺癌相关疾病的有效性的方法，其包括:i)使动物经历其有效性有待评估的疗法，和ii)通过估计表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一个或多个中所列的至少一个生物标志物来测定测试的疗法在治疗或预防疾病中的有效性水平。
[0076]在某些实施方案中，候选治疗剂包括:药物组合物、营养组合物(nutraceuticalcomposit1n)和顺势疗法组合物中的一种或多种。
[0077]在某些实施方案中，待评估的疗法用于人受试者。
[0078]在另一个方面，本文中描述了制品，其包含:至少一个结合前列腺癌相关疾病的标志物的捕获试剂，所述标志物包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一个或多个中所列的至少一个生物标志物。
[0079]在另一个方面，本文中描述了用于筛选治疗前列腺癌相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中试剂盒包括:表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一个或多个中所列的至少一个生物标志物的一个或多个试剂和表达至少一个生物标志物的细胞。
[0080]在某些实施方案中，使用包含特异性结合至少一个生物标志物的抗体或抗体片段的试剂检测生物标志物的存在。
[0081]在另一个方面，本文中描述了干扰前列腺癌相关疾病应答信号转导途径的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体中疾病并发症的严重度，其中试剂包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一个或多个中所列的至少一个生物标志物。
[0082]在另一个方面，本文中描述了治疗、预防、逆转或限定有此需要的个体中前列腺癌相关疾病并发症的严重度的方法，其包括:给个体施用干扰至少前列腺癌相关疾病应答级联的试剂，其中试剂包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一个或多个中所列的至少一个生物标志物。
[0083]在另一个方面，本文中描述了干扰至少前列腺癌相关疾病应答级联的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限定个体中前列腺癌相关疾病并发症的严重度，其中试剂包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一个或多个中所列的至少一个生物标志物。
[0084]在另一个方面，本文中描述了包含miR-Ι、miR-32和miR-106b中的一个或多个的反义抑制剂的组合物。
[0085]在另一个方面，本文中描述了治疗有此需要的受试者的前列腺病症的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的组合物。
[0086]在某些实施方案中，预防性施用组合物。
[0087]在某些实施方案中，组合物的施用延迟病症的一个或多个症状的发作。
[0088]在某些实施方案中，肽的施用抑制前列腺癌的发生。
[0089]在某些实施 方案中，肽的施用抑制肿瘤生长。
[0090]在某些实施方案中，肽的施用抑制感染。
[0091 ] 在另一个方面，本文中描述了用于检测生物学样品中前列腺癌的存在的方法，该方法包括:a)将怀疑包含前列腺癌的生物学样品暴露于为此的标志物；和《如果有的话，检测样品中标志物的存在或不存在。
[0092]在某些实施方案中，标志物包括可检测标记。
[0093]在某些实施方案中，所述方法还包括将来自受试者的生物学样品中标志物的量与来自正常受试者的相应生物学样品中标志物的量相比。
[0094]在某些实施方案中，所述方法还包括在不同时间点从受试者收集多个生物学样品和比较各生物学样品中标志物的量以确定标志物的量在一段时间内在受试者中是增加还是减少。
[0095]在另一个方面，本文中描述了治疗受试者中的前列腺癌的方法，该方法包括:给有此需要的受试者施用治疗有效量的前列腺受体激动剂。
[0096]在某些实施方案中，受体激动剂是:miRl、miR-21和miR_106b中的一个或多个的反义抑制剂。
[0097]在另一个方面，本文中描述了制造用于治疗前列腺癌的药物的用途，其由选自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中显示的miR、来源于其的序列、来自此类miR的互补序列和来源于这样的互补序列的序列的核酸分子组成。
[0098]在某些实施方案中，所述用途包括其中药物包含存在选自:表2中所列的miR、来源于此类miR的序列、此类miR的互补序列和来源于这样的互补序列的序列的序列的核酸分子。
[0099]在另一个方面，本文中描述了鉴定诱导前列腺癌细胞的分化的有效治疗剂或治疗剂的组合的体外方法，该方法包括步骤:i)培养来源于前列腺肿瘤的细胞，ii)向细胞系的培养基中加入至少一种化合物，iii)分析步骤(i)与(ii)之间至少一个miR的表达水平的变化和iv)鉴定诱导步骤(i)与(ii)之间miR的表达水平的改变的化合物或化合物的组合。
[0100]在某些实施方案中，步骤(iii)包括分析至少一个miR的表达水平。
[0101]在某些实施方案中，步骤(iv)包括鉴定调控至少一个miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
[0102]在某些实施方案中，步骤(iv)包括鉴定减少至少一个miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
[0103]在某些实施方案中，化合物是治疗癌症的治疗剂。
[0104]在另一个方面，本文中描述了用于分类来自受试者的前列腺组织的方法，其包括:a)测量测试细胞群体中选自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的组的一个或多个核酸序列的表达，其中所述测试细胞群体中至少一个细胞能够表达选自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的组的一个或多个核酸序列；b)将核酸序列的表达与包含至少一个已知其前列腺癌分类的细胞的参照细胞群体中核酸序列的表达相比较；和c)如果存在，鉴定测试细胞群体和参照细胞群体中选自所述组的一个或多个核酸序列的表达水平的差异，从而分类受试者的前列腺癌。
[0105]在某些实施方案中，与参照细胞群体相比较，测试细胞群体中核酸的表达的差异表示测试细胞群体具有与来自参照细胞群体的细胞不同的分类。
[0106]在某些实施方案中，与参照细胞群体相比较，测试细胞群体中核酸的相似表达模式表示测试细胞群体具有与来自参照细胞群体的细胞相同的分类。
[0107]在某些实施方案中，参照细胞群体是多个细胞或数据库。
[0108]在某些实施方案中，参照细胞群体选自:分类为来自正常前列腺组织的细胞群体的参照细胞群体、分类为来自良性前列腺组织的细胞群体的参照细胞群体和分类为来自恶性前列腺组织的细胞群体的参照细胞群体。
[0109]当根据附图进行阅读时，根据下列优选实施方案的详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员将变得显然。
[0110]附图概述
[0111]本专利或申请文件可包括一个或多个以彩色制成的图和/或一个或多个照片。具有彩色附图和/或照片的本专利或专利申请公开案的拷贝将应请求且支付必要的费用后由专利局(Patent Office)提供。
[0112]图1A-1B:前列腺组织中微RNA与它们各自的靶mRNA的转录物丰度之间的关系的分析。显示了 mRNA与miR-106b之间(图1A)以及mRNA与miR_181a之间(图1B)的Pearson相关系数的全局分布。黑色曲线显示所有mRNA的相关系数的分布。红色曲线只显示为mi R-106b或miR-181a的预测的靶的mRNA的相关系数分布。红色曲线具有表示其转录物水平与微RNA的转录物水平呈负相关的靶mRNA的富集的额外的肩(箭头)。
[0113]图2A-2B:miR-l和miR-106b对蛋白质表达的抑制。用微RNA前体(miR-Ι和miR-106b)或反义微RNA (反义miR-Ι和反义miR_106b)或它们各自的载体对照、乱序的前体微RNA(乱序的-P)和乱序的反义微RNA(乱序的-A)转染LNCaP和PC-3人前列腺癌细胞。在转染后48小时制备蛋白质提取物,通过Western印迹分析检查蛋白质表达。上样:50 μ g蛋白质/泳道。
[0114]图3A-3B:miR-106b通过3’UTR介导的机制抑制E2F1蛋白质表达。[0115]图3A:用微RNA前体(miR-106b)或反义微RNA (反义miR_106b)或它们各自的载体对照、乱序的前体微RNA (乱序的-P)和乱序的反义微RNA (乱序的-A)转染LNCaP和PC-3人前列腺癌细胞。在转染后48小时制备蛋白质提取物，通过Western印迹分析检查蛋白质表达。为了获得相对强度值，将E2F1表达相对于β_肌动蛋白进行标准化。
[0116]图3Β:将包含E2F1基因中的miR-106b的野生型或突变体3’^1?靶序列的？61^3萤光素酶报告基因构建体与前体微RNA阴性对照或miR-106b前体共转染入LNCaP细胞(各自n=3)。为了比较，还用不包含3’UTR的pGL3对照载体转染细胞。24小时后，测定细胞提取物中萤光素酶的活性。在野生型E2F13’UTR存在的情况下，使用前体miR-106b的转染导致萤光素酶报告基因的显著抑制(与载体对照相比较)(P=0.045，双侧t检验)。
[0117]图3C-3D:miR-32通过3’UTR介导的机制抑制Bim蛋白的表达。
[0118]图3C:用微RNA前体(miR-32)或反义微RNA (反义miR-32)或它们各自的载体对照、乱序的前体微RNA (乱序的-P)和乱序的反义微RNA (乱序的-A)转染LNCaP和PC-3人前列腺癌细胞。在转染后48小时制备蛋白质提取物，通过Western印迹分析检查蛋白质表达。为了获得相对强度值，将Bim的表达相对于β_肌动蛋白进行标准化。
[0119]图3D:将包含BCL2L11 (Bim)基因中的miR-32的野生型或突变体3’UTR靶序列的PGL3萤光素酶报告基因构建体与前体微RNA阴性对照或miR-32前体共转染入LNCaP细胞(各自n=3)。为了比较，还用不包含3’UTR的pGL3对照载体转染细胞。24小时后，测定细胞提取物中萤光素酶的活性。在野生型BCL2L113’UTR存在的情况下，使用miR-32的转染导致萤光素酶报告基因的显著抑制(与载体对照相比较)(P=0.003，双侧t检验)。如果报告基因构建体包含miR的突变体3’ UTR靶序列，抑制被减弱。
[0120]图4A-4B =DICER(图 4A)和 DGCR8 (图 4B)的定量 RT-PCR 表达分析。
[0121]图5A-5D:来自前列腺癌患者的非肿瘤前列腺组织(正常)和肿瘤(肿瘤)中miR-32 (图 5A)、miR_106b (图1B)、miR_106a (图 5C)和 miR-1 (图 5D)的定量 RT-PCR 表达分析。将单个样品的相对微RNA表达值和样品组的平均值作图。MiR-32、miR-106b和miR_106a在肿瘤中的表达显著高于在非肿瘤组织中的表达:P=0.037(双侧t检验)(对于miR-32)；P=0.009 (双侧 t 检验)(对于 miR-106b) ；P=0.015 (双侧 t 检验)(对于 miR_106a)。
[0122]图6:前列腺肿瘤中XP06与miR-Ι转录物水平之间的关系。
[0123]图7:miR-106b通过CDKNlA(p21/WAFl)3’UTR-介导的机制抑制萤光素酶报告基因的活性。
[0124]图8A-8B:抗癌药物处理的细胞中miR簇对胱天蛋白酶-3/胱天蛋白酶_7活化的显著抑制。
[0125]图9A9B:成熟miR-338和miR-221的qRT-PCR分析显示它们的表达水平受雄激素调控。
[0126]图10:表1:研究群体的临床特征。
[0127]图11:表2:在肿瘤与非肿瘤组织之间差异表达的微RNA。
[0128]图12:表3:与前列腺外疾病相关的微RNA。
[0129]图13A:表4A:前列腺肿瘤中miR-Ι与靶基因转录物水平之间的负相关。
[0130]图13B:表4B:前列腺肿瘤的37-探针组PAM预测物。
[0131]图14:表5:在前列腺肿瘤中与miR_181a呈负相关的miR_181a的靶基因。[0132]图15:表6:雄激素应答性微RNA。
[0133]图16:表7 -M RNA的侧翼序列中假定的雄激素受体结合位点。
[0134]图17-17B:基于235个微RNA的表达的57个前列腺肿瘤的无监督层次聚类分析。
[0135]图17A:微RNA表达产生具有不同微RNA特征谱的两个主要簇，簇#1包含所有非PNI肿瘤。
[0136]图17B:根据两个簇间的PNI状态产生的肿瘤的非随机分布(P=0.002;双侧Fisher’s精确检验)。
[0137]图18:富集差异表达的基因(比较PNI肿瘤与非PNI肿瘤)的基因本体论生物过程(Gene Ontology B1logical Process)的聚类分析。聚类分析的结果显示于热图中，为了进行特定的比较例如PNI肿瘤对非PNI肿瘤(“神经周浸润”)，用红色标示生物过程例如类花生酸代谢中差异表达的基因的富集。热图还显示关于高(7-9)Gleason评分对低(5_6)Gleason评分比较(“Gleason总评分”)、pT3对pT2比较(“病理分期”)和阳性对阴性前列腺外扩展比较(“前列腺外扩展”)的聚类分析。分析显示，基因表达差异是非随机的并且产生关于4个比较的频繁受影响的生物过程的独特模式。放大的聚类显示，独特地富集差异表达的基因(比较PNI肿瘤与非PNI肿瘤)的生物过程。类花生酸代谢、脂质代谢和轴突生成也富集差异表达的基因(比较ΡΤ3与ρΤ2)。
[0138]图19A-19D:通过免疫组织化学显示的前列腺肿瘤中金属硫蛋白的表达。小图显示肿瘤上皮中金属硫蛋白表达的实例。相同肿瘤中，远离神经元的癌细胞中金属硫蛋白的细胞质表达显著(图19Α)，神经周围的癌细胞中该表达不存在(图19Β)。当肿瘤细胞靠近神经时，金属硫蛋白的表达减少(图19C，19D)。箭头和“N”标示褐色染色的神经干的位置。复染:甲基绿。
[0139] 图20A-20D:通过免疫组织化学显示的前列腺肿瘤中柯萨奇腺病毒受体的表达。小图显示肿瘤上皮中受体表达的实例。在相同肿瘤中，远离神经元的癌细胞中(图20A)和神经周围的癌细胞中(图20B)受体的细胞膜和细胞质染色。在神经周围的癌细胞中(图20C，20D)柯萨奇腺病毒受体的表达减少。N:神经干。复染:甲基绿。
[0140]图21A-21D:通过原位杂交显示的前列腺肿瘤中的miR-224。显示了肿瘤上皮中miR-224的细胞质表达的代表性实例。粒状褐色染色显示miR-224的存在。大多数肿瘤对于miR-224显示微弱的标记(图21A)。在肿瘤的亚组中，在神经周围癌细胞中观察到中等至强的miR-224标记(图21B，21C，21D)。N=神经干。复染:苏木精。
[0141]图22:表8:神经周浸润(PNI)研究群体的临床特征。
[0142]图23-表9:在具有PNI的肿瘤中上调的微RNA(FDR ( 10%)。
[0143]图24-表10:在PNI与非PNI肿瘤之间具有差异表达的编码蛋白质的RNA。
[0144]图25-表11:通过qRT-PCR进行的对选择的基因的微阵列结果的验证。
[0145]图26-表12:最显著富集差异表达的基因(比较PNI肿瘤与非PNI肿瘤)的生物过程。
[0146]发明详述
[0147]在整个本公开内容中，通过标识引用来引用各种公开物、专利和公开的专利说明书。这些公开物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用合并入本公开内容以更全面地描述本发明涉及的现有技术。[0148]在详细地描述本发明之前，应理解本发明不限定于特定的制剂或过程参数，因为它们当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语只是为了描述本发明的特定实施方案，而不期望是限定性的。
[0149]虽然在本发明的实施中可使用与本文中描述的方法和材料相似或等价的许多方法和材料，但优选的材料和方法描述于本文中。
[0150]微RNA是调控蛋白质编码基因的表达的小非编码RNA。为了估计前列腺癌中微RNA的参与，我们测定60个原发性前列腺肿瘤和16个非肿瘤前列腺组织中微RNA和mRNA的基因组范围的表达。
[0151]微RNA表达随前列腺癌的发生和进展而变化。一些此类微RNA在前列腺癌细胞中调控癌症相关基因的表达。
[0152]如在本文中可互换使用的，“miR基因产物”、“微RNA”、“miR”或“miRNA”是指来自miR基因的未加工的或已加工的RNA转录物。
[0153]如本文中所使用的，“生物标志物”可包括一个或多个“miR基因产物”、“微RNA”、“miR”或“miRNA”或编码蛋白质的RNA。
[0154]可通过天然加工途径(例如使用完整的细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如使用分离的加工酶，例如分离的Dicer、Argonaut或RNA酶III)从miR前体获得具有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。应理解，还可通过生物或化学合成(而不用从miR前体加工)直接产生具有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。当在本文中通过名称提及微RNA时，除非另外指出，否则所 述名称相应于前体和成熟形式。
[0155]本发明包括诊断受试者是否患有前列腺相关病症或处于发生前列腺相关病症的风险中的方法。如本文中使用的，“受试者”可以是患有或怀疑患有前列腺癌的任何哺乳动物。
[0156]mRNA分析显示，微RNA加工的至关重要的组分和数个微RNA宿主基因例如MCM7和C9orf5在前列腺肿瘤中显著上调。与这些发现一致，肿瘤以比非肿瘤前列腺显著更高的水平表达定位至MCM7的内含子13的miR-106b-25簇和定位至C9orf5的内含子14的miR-32。
[0157]其他微RNA包括miR-106b_25簇同源物和miR-l_133a簇的表达水平在前列腺肿瘤中也发生改变。
[0158]在器官局限性肿瘤与具有前列腺外疾病扩展的肿瘤之间发现另外的微RNA丰度的差异。
[0159]此外，我们还发现，微RNA的失调影响前列腺中编码蛋白质的靶基因的转录物丰度。
[0160]在细胞培养物中，E2F1和p21/WAFl被鉴定为miR_106b的靶，Bim为miR-32的靶，以及输出蛋白-6和PTK9为miR-Ι的靶。
[0161]基于基因的分类器是提高疾病诊断和用于预测临床行为的强有力的诊断和预后工具。我们使用PAM应用来鉴定区分肿瘤与非肿瘤组织的微RNA特征。PAM鉴定了由7-探针组和37-探针组组成的两个微RNA特征，其最佳地区分肿瘤与非肿瘤组织(图13B-表4B,其中7-探针组特征用*标示)。
[0162]7-探针组特征获得了 16个非肿瘤组织中的14个(88%)和60个肿瘤中的49个(82%)的正确分类。该特征仅基于4个微RNA，miR-32、miR-218-2、miR-490和miR-520h的表达模式。
[0163]使用代表23个微RNA的37-探针组特征(图11 [表5])获得了总体预测准确度的进一步提高。该特征与7-探针组特征完全重叠。通过使用37-探针组特征，PAM获得了16个非肿瘤组织中的16个(100%)和60个肿瘤中的48个(80%)的正确分类.[0164]在下列实施例中进一步解释本发明，其中，除非另有说明，所有部分和百分比以重量计并且温度是摄氏度。应理解，表示本发明的优选实施方案的这些实施例仅通过举例说明的方式给出。根据上述讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，并且无需背离其精神和范围，可以对本发明进行多种变化和改进以使其适应不同的用法和条件。本说明书中涉及的所有公开物，包括专利和非专利文献明确地通过引用并入本文。
[0165]实施例1
[0166]临床样品
[0167]从NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource (CPCTR)和 University ofMaryland(UMD)的病理系接收60个新鲜冷冻的前列腺肿瘤。从所有供体获得书面知情同意。肿瘤是在前列腺切除术前未接受任何治疗的切除的腺癌。由病理学家再检查宏观解剖的(macro-dissected)肿瘤样品，其确认肿瘤存在于冷冻样品中。从16个前列腺癌患者收集周围非肿 瘤前列腺组织。所有组织在2002至2004年收集。根据医疗记录(CPCTR)取得或通过流行病学问卷调查(UMD)获得关于人种/族裔的信息。从CPCTR获得患者的临床病理学特征，包括前列腺切除术时的年龄、组织学、Gleason评分、病理分期、诊断时的PSA、肿瘤大小、前列腺外扩展、边缘受累(margin involvement)和精囊浸润。对于UMD病例,该信息获自医疗和病理记录，如果可获得的话。研究由参与单位的制度评审委员会(institut1nalreview boards)批准。
[0168]RNA 提取
[0169]按照制造商的说明书(Invitrogen, Carlsbad, CA)使用TRIZOL试剂分离总RNA。用 Agilent2100B1analyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)确认各样品的 RNA 完整性。然后将各RNA样品分成两等分，其经处理用于微RNA微阵列或mRNA微阵列。
[0170]基因微阵列
[0171]定制微RNA寡核苷酸芯片。如之前所述(21)进行微RNA标记和杂交。微RNA微阵列(Oh1 State University Comprehensive Cancer Center, Vers1n3.0)含有以一式四份点印的针对329个人微RNA和249个小鼠微RNA的探针。关于阵列平台的更多信息可见于登录号分别为A-MEXP-620和GSE8126的ArrayExpress和GEO数据库。
[0172]Affymetrix GeneChip?
[0173]按照Affymetrix标准方案(Santa Clara, CA)进行RNA标记和杂交。简而言之,用在5’末端具有T7RNA聚合酶启动子的寡(dT)引物逆转录5yg总RNA。第二链合成后，通过使用来自 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)的B1Array High Yield RNA TranscriptLabeling Kit T3整合生物素化的核糖核苷酸来产生cRNA。将标记的cRNA片段化，然后与Affymetrix GeneChip HG-U133A2.0阵列杂交。该阵列包含代表大约13，000个人蛋白质编码基因的22，283个探针组。用藻红蛋白缀合的链霉抗生物素蛋白(Invit1gen)显现杂交信号，并且使用GeneChip Scanner30007G(Affymetrix)进行扫描。根据关于微阵列实验的最小信息(Minimum Informat1n About a Microarray Experiment) (MIAME)指南，我们将额外的患者信息和微阵列数据的CEL文件保存在GEO库(ncb1.nlm.nih.zov/aeo/)。微RNA和mRNA特征谱数据的GEO提交登录号分别是GSE8126和GSE6956。
[0174]微阵列的数据标准化和统计分析
[0175]使用鲁棒多芯片分析(robust multichip analysis, RMA)方法(22)标准化Affymetrix芯片。将中值-中心标准化(Median-centric normalizat1n)用于定制的微RNA寡核苷酸芯片。为了产生显著差异表达的基因的清单，将所得的数据组经历微阵列显著性分析(significance analysis of microarray, SAM)方法(23)。我们基于来自双侧t检验的P值和期望的错误发现率(FDR)产生基因清单。FDR计算遵从Storey和Tibshirani描述的方法(24)。微阵列预测分析(Predict1n analysis for microarray,PAM) (25)用于将组织分类为期望的分类，例如肿瘤或非肿瘤组织。在该分析中，基于训练误差率和变异系数(CV)误差率的最佳补偿选择阈值δ。通过遗漏10%的样品进行交叉验证，以确定PAM中合适的阈值参数。
[0176]微RNA的靶的预测
[0177]我们使用TargetScanS(http://genes, mit.edu/tscan/taraetscanS.html)进行微RNA的靶的预测。在我们的研究中只考虑位于3’ UTR内并且在种间保守的微RNA的预测的结合部位。为了分析和数据输出，将数据格式化入WholePathwayScope数据库(26)。为了鉴定在人前列腺组织中调控它们的靶mRNA的转录物丰度的微RNA，进行关联分析。为此，计算Pearson相关系数。利用双侧t检验确定Pearson相关系数的统计学显著性。
[0178]定量实时PCR
[0179]按照公开的方案(27)使用莖环丁压(1蘭玨11? MicroRNA Assays试剂盒(AppliedB1systems, Foster City, CA)测量成熟微RNA的丰度。简而言之，使用来自TaqMan?MicroRNA Assays试剂盒的特异性微RNA引物和来自TaqMan? MicroRNA Reverse
Transcript1n试剂盒(Applied B1systems)的试剂，按照制造商的指导从1ng总RNA逆转录 cDNA。使用 Applied B1systems Tagman2X Universal PCR Master Mix 和合适
的5X Taqman? MicroRNA Assay Mix就各目的微RNA对cDNA进行实时PCR。在96孔板中，将一式三份反应物在Applied B1systems 7500Real_Time PCR系统中于95°C下温育10分钟，然后进行40个循环的在95°C下15秒和在60°C下I分钟。对于各样品，利用ABI7500Sequence Detect1n System软件计算循环阈值(CO。使用标准曲线测定样品中微RNA的浓度，然后将其相对于U6RNA进行标准化。
[0180]微RNA对蛋白质表达的调控
[0181]将LNCaP和PC3人前列腺癌细胞(ATCC，Manassas, VA)培养至50%汇合，然后使用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen),用10nM终浓度的微RNA前体或反义微RNA抑制剂(两者都来自Amb1n，Austin, TX)进行转染。在48小时后，通过刮取收获细胞，然后使用 RIPA 缓冲液(Pierce B1technology, Rockford, IL)提取蛋白质。进行 Bradford 测定(B1Rad Laboratories,Hercules,CA:#500-0006)以测定蛋白质的浓度，将 50ug 蛋白质装载在凝胶上以进行Western印迹分析。使用下列微RNA前体:前-微RNA阴性对照(AM17110);hsa-miR-l(cat#AM1710Product ID:PM10617);hsa-miR-32(cat#AM17100ProductID:PM12584);和 hsa-miR-106b (cat#AM17100Product ID:PM10067)。使用下列微 RNA 抑制剂(反义):反义微 RNA 阴性对照(AM17010) ;hsa-miR-l (cat#AM17000Product ID:AM10617);hsa-miR-32 (cat#AMI7000Product ID:AM12584);和 hsa_miR-106b (cat#AM17000ProductID:AM10067)。使用下列一抗通过Western印迹分析显现蛋白质表达:多克隆免抗输出蛋白-6 抗体，1:200 (ProteinTech Group, Chicago, IL: 11408-1-AP);单克隆鼠抗 PTK9 抗体，1:500 (Abnova Corp.，Taipei, Taiwan: clonelE2);单克隆鼠抗 E2F1 抗体，1:200 (SantaCruz B1technology, Santa Cruz, CA: sc-251);单克隆鼠抗 p21/WAFl 抗体，1:200 (SantaCruzB1technology:sc-6246);和多克隆兔抗 BIM 抗体，1:1000 (CellSignaling/Santa Cruz B1technology: #2819)。用 AIDA B1package, 2D-光密度测定法(raytestIsotopenmessgeraete GmbH, Straubenhardt, Germany)获得蛋白质表达的定量。
[0182]包含E2FI和BCL2L11的3’ UTR的报告基因构建体的萤光素酶测定
[0183]从基因组DNA(293T细胞)克隆分别包含预测的miR_106b和miR-32的靶序列的E2FI和BCL2L11 (编码Bim)的3’UTR，然后将其在紧接萤光素酶报告基因下游的Xbal限制性位点克隆入PGL3萤火虫萤光素酶对照载体(Promega，Madison, WI)。为了产生具有突变体祀序列的3’UTR,使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene, La Jolla,CA)将前3个核苷酸的缺失插入miR-106b和miR-32的种子区域互补位点。在LNCaP细胞中测定miR-106b或miR-32对萤光素酶报告基因的翻译抑制。简而言之，将1.2xl05个LNCaP细胞/孔接种在24孔板中。第二天,按照制造商的说明书(Invitrogen)使用lipofectamine2000试剂用500ng报告基因质粒、2ng Renilla报告基因和10nM终浓度的微RNA阴性对照或前体微RNA转染细胞。以一式三份重复进行转染。用前-微RNA阴性对照(AM17110)、hsa-miR-106b(cat#AM17100Product ID:PM10067)或 hsa-miR-32 前体(cat#AM17100Product ID:PM12584)转染细胞。24小时后，按照Promega标准方案裂解细胞，并且使用DYNEX Technologies MLX光度计测定相对萤光素酶活性。将报告基因活性相对于细胞提取物中蛋白质的浓度进行标准化。
[0184]用雄激素受体激动剂处理前列腺癌细胞
[0185] 将DU-145 (IxlO6)和LNCaP (2xl06)人前列腺癌细胞(ATCC)涂板在75cm2培养瓶中，用补充有10%PBS、100 μ g/ml链霉素、100单位/ml青霉素和0.25 μ g/ml两性霉素B的RPMI1640培养24小时。然后，将细胞置于不含酚红的、具有5%的葡聚糖包被的炭处理的PBS(Invitrogen)的RPMI1640中，进行48小时以耗尽激素。然后，用1nM R1881 (甲基三烯甘油酯酮，PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA)或溶剂(乙醇)处理细胞。24小时后，收获细胞，使用mirVana PARIS试剂盒(Amb1n, Inc.)分离总RNA。重复本实验5次。如之前所述(21)进行微RNA标记和杂交,在 Oh1 State University Comprehensive CancerCenter微阵列(版本4.0)上测定微RNA的全局表达。
[0186]实施例1的结果
[0187]前列腺肿瘤中Dicer的上调
[0188]从患有局部疾病(1calizeddisease)的非洲裔美国患者和欧洲裔美国患者收集前列腺肿瘤(图10-表1)。
[0189]在从这些肿瘤和16个非肿瘤组织分离总RNA后，使用微阵列测定大约13，000个蛋白质编码基因和329个独特的人微RNA的表达。
[0190]首先，就已显示调控微RNA的加工的mRNA (例如编码，特别地，Drosha或Dicer的mRNA)的表达的癌症相关的变化搜索这些样品的基因表达特征谱。我们的分析显示，当与非肿瘤组织相比较时Dicer在前列腺肿瘤中的表达显著更高(1.6-倍；FDR〈1%)。编码Drosha的基本辅因子的DGCR8在肿瘤中也上调，但当与非肿瘤组织相比较时程度低于DiceHl.2倍；FDR〈1%)。编码Drosha的基本辅因子的DGCR8也在肿瘤中上调(1.2倍，FDR〈1%)。通过qRT-PCR来验证肿瘤中Dicer和DGCR8的增加的表达，结果显示更大的倍数差异(与微阵列显示的结果相比较)(图4A-4B)。
[0191]进一步的分析显示，Dicer和EIF2C2 (两者都为RISC复合物的组分)在具有高Gleason总评分(评分7-9)的肿瘤中比在具有低Gleason总评分(评分5-6)的肿瘤中更高地表达。然而，这些表达差异相当适度(Dicer:1.2倍；EIF2C2:1.3倍)。因为在人细胞中已发现宿主基因和内含子微RNA的频繁共表达(28)，因此我们还研究了前列腺肿瘤中微RNA宿主基因的表达。
[0192]在微RNA的宿主基因当中(28;29)，发现5个的表达在前列腺癌中发生改变(所有FDR〈1%)。在这些基因当中，作为miR-32的宿主的C9orf 5 (2.1倍上调)和作为miR-25簇(miR-25/miR-93/miR-106b)的宿主的MCM7 (1.7倍上调)在肿瘤中最高地过表达。NFYC (miR-30c-l 的宿主)、SMC4L1 (miR-15b 和 miR-16-2 的宿主)和 PTPRN2 (miR-153-2 的宿主)，当与非肿瘤组织相比较时，在肿瘤中显示更适度的30%至40%的增加的表达。
[0193]前列腺癌的微RNA基因特征
[0194]我们首先搜索在肿瘤与非肿瘤组织之间显示差异表达的微RNA。如图11-表2中所示的，多个微RNA的表达在前列腺肿瘤中发生改变。
[0195]在肿瘤中具有比非 肿瘤组织更低的转录物水平的微RNA当中，miR_520h、miR-494和miR-490减少最多。该清单中两个值得注意的其他的微RNA是miR-Ι (-2)和miR-133a (-1)。这两个微RNA由相同的pr1-mRNA编码。miR-32是最显著上调的肿瘤微RNA，其次是miR-182、miR-31和miR_26a。最高表达的肿瘤微RNA的清单还包括miR-106b_25簇(miR-106b/miR-93/miR-25)的所有成员和 miR_99b 簇的两个成员 miR_99b 和 miR_125a。miR-32和miR-106b-25簇的上调与它们各自的宿主基因C9orf5和MCM7在前列腺肿瘤中的增加的表达相一致。
[0196]微阵列数据的统计学分析确认，C9orf5与miR-32的组织转录物水平在统计学上显著相关(P=0.0003)。Pearson系数表明，该关联在所有样品间是适度强的(0.39;95%置信区间:0.18至0.57;n=76)。对于MCM7与miR-106b_25簇转录物水平之间的关联获得相似的数据(miR-106b:0.37 (Pearson 系数),P=0.001;miR-93:0.35, P=0.002;miR-25:0.23，P=0.04)。
[0197]我们通过在肿瘤和非肿瘤组织的随机亚组中选择的微RNA的qRT-PCR分析确证了微阵列数据。与微阵列相一致，我们发现，成熟miR-32 (3.2倍)和miR_106b (3.0倍)在肿瘤中比在非肿瘤组织中更高地表达(图5A-5D)。我们还发现，当与非肿瘤组织相比较时，在肿瘤中成熟miR-Ι下调(平均:0.44倍)以及miR_106a (miR_106b同源物)过表达(平均:3.7倍)。
[0198]我们还在我们的研究中进行10个肿瘤(其周围的非肿瘤组织是可获得的)的微阵列数据的成对分析。成对分析确证了我们之前的发现。在FDR〈10%的情况下，发现miR-26a、miR-30c-l、miR-32、miR-146b、miR181a、fiR-182、miR-196a、miR-200c、miR-375 和miR-106b-25簇的所有微RNA在肿瘤中上调(1.5倍至2.5倍)。最显著下调的肿瘤微RNA是miR-494 (0.4倍)和miR-126 (0.6倍)。然而，未发现miR_133a簇在该肿瘤亚组中显著地差异地表达。
[0199]微RNA与前列腺外扩展和Gleason评分的关联
[0200]我们接着就与肿瘤的前列腺外扩展相关的微RNA表达的差异分析我们的数据组。前列腺外扩展是前列腺癌患者的不利预后因素。在FDR〈20%的情况下，我们发现15个在显示疾病的前列腺外扩展的肿瘤(n=17)与不显示疾病的前列腺外扩展的肿瘤(n=35)之间的表达上具有差异的微RNA (图12-表3)。
[0201]miR-ΙΟ?是扩散出前列腺的局限性前列腺肿瘤中最始终如一地过表达的微RNA(FDR〈1%)。前列腺外扩展与肿瘤特征共有一部分其微RNA特征(图11-表2)。
[0202]两个微RNA，miR_99b和miR_196a对于两个特征是共同的。前列腺外扩展特征的两个其他的微RNA，miR-200a和miR_200b，与肿瘤特征中的miR_200c具有充分的同源性。我们还研究了微RNA与精囊浸润的关联，虽然本研究中少数肿瘤经诊断具有该特征。在FDR〈20%的情况下，只有一个微RNA在具有精囊浸润的肿瘤(n=9)与不具有浸润的肿瘤(n=43)之间差异表达。该微RNA是miR-199a-l，当与其他肿瘤相比较时，其在具有精囊浸润的肿瘤中增加2.3倍。
[0203]微RNA表达特征谱对于Gleason评分未显示鲁棒特征。在FDR〈20%的情况下只发现极少数微RNA差异表达。当与具有低Gleason总评分(评分5-6, n=15)的肿瘤相比较时，在具有高Gleason总评分(评分7_9，n=45)的肿瘤中显著上调的微RNA(P〈0.01)是miR-92-2(l.3倍)(miR-25和miR -32的同源物)以及miR-335 (1.2倍)，显著下调的微RNA (P<0.01)是 miR-1-133a 簇(0.7 倍)和 miR-130 (0.8 倍)。
[0204]因为我们的研究中的肿瘤是从在临床病理学参数上良好匹配的非洲裔美国患者和欧洲裔美国患者收集的(图10-表1)，所以我们比较非洲裔美国患者(n=30)和欧洲裔美国患者(n=30)之间的肿瘤微RNA特征。少数微RNA差异表达(P〈0.01)。在FDR〈20%的情况下，发现miR-129、miR-196b和miR-342在非洲裔美国人的肿瘤中的丰度比在欧洲裔美国人的肿瘤中的更低(低20%至30%)。根据该分析，肿瘤微RNA似乎不因人种/族裔而极差异地表达。
[0205]使用微RNA进行的肿瘤和非肿瘤组织的分类。
[0206]基于基因的分类器是提高疾病诊断和用于预测临床行为的强有力的诊断和预后工具。我们使用PAM应用来鉴定区分肿瘤与非肿瘤组织、区分器官局限性肿瘤与具有前列腺外扩展的肿瘤以及区分具有高Gleason总评分的肿瘤与具有低Gleason总评分的肿瘤的微RNA特征。PAM鉴定了由7-探针组和37-探针组组成的两个微RNA特征，其最佳地区分肿瘤与非肿瘤组织。7-探针组特征获得了 16个非肿瘤组织中的14个(88%)和60个肿瘤中的49个(82%)的正确分类。该特征仅基于4个微RNA，miR-32、miR-218-2、miR-490和miR-520h的表达模式(图13B-表4B)，所述微RNA全都是最显著上调或下调的肿瘤微RNA (图11-表2)。使用代表23个微RNA的37-探针组特征(图14-表5)获得了总体预测准确度的进一步提高。
[0207]该特征与7-探针组特征完全重叠。通过使用37-探针组特征，PAM获得16个非肿瘤组织中的16个(100%和60个肿瘤中的48个(80%)的正确分类。PAM不能鉴定用于前列腺外扩展和Gleason评分的良好分类器。对于Gleason评分，弱至适度的分类器需要149个探针组(数据未显示)。
[0208]前列腺组织中微RNA与它们的靶mRNA的转录物丰度之间的关系
[0209]微RNA利用靶特异性翻译抑制(4)来调控蛋白质编码基因的表达。然而，最近显示，一些微RNA例如miR-Ι可在哺乳动物细胞中下调许多靶基因的转录物水平。因为miR-Ι是前列腺肿瘤中最显著下调的微RNA，因此我们在这些肿瘤中进行miR-Ι的表达水平与预测的miR-Ι的靶基因的表达水平之间的关联分析。进行该测试以鉴定由于减少的miR-Ι表达而在前列腺肿瘤中变得过表达的候选miR-Ι的靶基因。分析产生假定的靶mRNA，发现其在前列腺肿瘤中上调(FDR〈1%)并且与miR-Ι表达负相关(图13-表4))。
[0210]其中，WDR6、XP06和SMARCA4的转录物显示与肿瘤miR-Ι的表达呈最显著的负相关(各P〈lxl0_lcl)。前列腺肿瘤中XP06与miR-Ι转录物水平之间的关系描绘于图6中。
[0211]我们还发现,肿瘤中XP06蛋白水平与miR-Ι呈负相关(-0.29, Spearman相关系数；n=8)。然而，并非所有预测的miR-Ι的靶都显示与肿瘤中miR-Ι转录物水平呈负相关。例如，TWFl (也称为PTK9)与miR-Ι呈正相关，这表明微RNA与其靶序列的结合有时可导致mRNA扣留(sequestrat1n)和被抑制的mRNA的细胞积累(30)。
[0212]将我们的分析扩展至在前列腺肿瘤中显著上调或下调的其他微RNA。此处，我们首先确定目的微RNA与通过HG-U133A2.0阵列探测的所有mRNA或仅为微RNA的预测的靶的mRNA之间的Pearson相关系数的全局分布。对于两个微RNA, miR-106b和miR_181a,相关系数的分布在所有mRNA与为miR_106b和miR_181a的预测的祀的mRNA之间显著不同(图1A-1B)。
[0213]miR-106b和miR_181a的预测的革巴mRNA的分布曲线显示向负Pearson相关系数延伸的显著的肩。该模式偏离正态分布，表明miR-106b和miR-181a降低在3’ UTR中具有预测的微RNA的靶序列的mRNA的亚组的组织转录物水平。在肿瘤中显著下调(FDR〈1%)并且其转录物水平与miR-181a表达呈负相关的靶基因的清单示于图14-表5中。
[0214]此类靶基因与白血病样品(31)中一列和mir_181a转录物水平相关的基因的比较显示，几个基因例如SLC9A6、RIN2、KLHL2和GHITM在两个清单中都与mir_181a呈负相关。
[0215]前列腺癌细胞中候选oncomiR对蛋白质表达的抑制
[0216]我们的来自肿瘤研究的结果表明，miR-Ι、miR-32和mir-106b_25簇在前列腺癌中是oncomiR，miR-32和miR-25共有高度的同源性，并且它们的预测的靶基因相同(targetscan.0rg)。此外，mir-106b-25 族与已知的 oncomiR, miR-17-92 族(15; 32)高度同源，并且miR-17-5p和miR-106b的预测的靶相同。miR-17-92簇的靶是E2F1 (32)。
[0217]我们用前体和反义微RNA转染人前列腺癌细胞系以检查miR-Ι、miR-32和mir-106b是否调节癌相关基因在此类细胞中的蛋白质表达。
[0218]通过qRT-PCR，此类微RNA在细胞系中的内源性表达是miR-106>miR-32>miR-l。miR-Ι处于检测极限。对于miR-Ι，我们测试肿瘤组织中微RNA与它们的靶mRNA的转录物丰度之间的关系是否可用于鉴定微RNA靶，检查输出蛋白-6(XP06)和蛋白质酪氨酸激酶9 (TffFl)的蛋白质表达是否受miR-Ι调控。使用miR-Ι对前列腺癌细胞的转染确认，其在两个前列腺癌细胞系中在蛋白质水平上抑制输出蛋白-6和PTK9(图2Α)。miR-32和mir-106b都不改变这些蛋白质的表达(数据未显示)。[0219]我们接着研究miR_106b对E2F1和p21/WAFl蛋白水平的调控。两种蛋白质都由在它们的3’ UTR中具有miR-106b的预测的靶序列的mRNA编码。虽然在前列腺肿瘤中E2F1在转录物水平上与miR-106b不相关，但在这些肿瘤中在⑶KNlA (编码p21/WAFl)与miR_106b的表达之间存在显著的负相关(-0.34;95%CI;-0.9至-0.55;P=0.003)。
[0220]如图2B中所示，在两种细胞系中，转染的前体miR_106b降低p21/WAFl蛋白水平，反义miR-106b增加p21/WAFl蛋白水平。在用前体和反义miR_106b转染前列腺癌细胞后，对于E2F1，我们获得相同的结果(图3A)。
[0221]我们还研究了 miR-32对Bim蛋白表达的影响。Bim由BCL2L11编码并且是miR-32的预测的靶。用前体miR-32转染前列腺癌细胞降低了 Bim蛋白水平，然而反义miR-32增加Bim蛋白水平(图3C)。Bim由BCL2L11编码并且是miR-32的预测的靶。BCL2L11和miR-32转录物水平在组织样品中不相关，这表明miR-32可能主要通过翻译抑制调控该靶。
[0222]在此类细胞系中，E2F1和p21/WAFl的蛋白质表达不受miR-32影响，Bim的蛋白质表达也不受miR-106b影响(数据未显示)。
[0223]E2FI 和 Bim 是 miR_106b 和 miR-32 的直接靶
[0224]为了进一步确证我们的发现和提供此类蛋白质是miR_106b和miR-32的直接靶的证据，用前体微RNA和pGL3萤光素酶报告基因构建体(分别含有两个基因E2F1和BCL2L11 (编码Bim)的野生型或突变体3’UTR)共转染LNCaP细胞。突变体3’UTR包含miR-106b和miR-32种子区域互补位点中的前3个核苷酸的缺失。将3’ UTR置于当微RNA结合靶序列时可导致萤光素酶报告基因的翻译抑制的位点。
[0225] 如图3B和图3D中所示，当与前体微RNA阴性对照相比较时，miR_106b与包含E2F1的野生型3’ UTR的报告基因构建体或miR-32与包含BCL2L11的野生型3’ UTR的报告基因构建体的共转染导致萤光素酶报告基因的显著抑制。在3’ UTR不存在的情况下，微RNA对报告基因的抑制不存在。突变体3’UTR的存在消除或减弱微RNA的作用。结果与微RNA通过结合它们的3’UTR靶序列产生的对蛋白质翻译的直接作用相一致。已建立了 miR-106b在人结肠癌和胃癌细胞中对P21/WAF1进行调控的这样的机制(13，14)。因此，我们观察到，miR-106b在LNCaP细胞中通过⑶KN1A3S UTR介导的机制抑制萤光素酶报告基因(图7)。
[0226]miR-106b-25簇在22Rvl人前列腺癌细胞中对胱天蛋白酶活化的抑制。
[0227]我们之前的数据表明，miR-32、miR_106b和它们的同源物(例如，miR-25)可用作癌基因，因为它们靶向Bim和E2F1的促凋亡功能。为了估计miR-106b_25簇对由多柔比星和依托泊苷诱导的细胞凋亡的作用，我们用编码miR-106b-25簇的慢病毒表达载体感染22Rvl细胞(非转移性人前列腺癌细胞系)。通过使用胱天蛋白酶-Glo细胞凋亡测定，我们观察到抗癌药物处理的细胞中该簇对胱天蛋白酶-3/胱天蛋白酶-7活化的显著抑制(图8A-8B)。该数据与miR-106b-25簇在前列腺癌细胞中的抗细胞凋亡功能一致。
[0228]受雄激素调控的微RNA的鉴定
[0229]雄激素在前列腺的生理和肿瘤生物学中起着至关重要的作用。我们检查DU145和LNCaP细胞中雄激素对微RNA的调控。使用R1881对DU145细胞的处理不产生任何显著的微RNA表达的变化。相反地，许多微RNA的表达在R1881处理后在LNCaP细胞中显著改变(FDR<5%)(图 15-表 6)。
[0230]一个微 RNA，miR-338,显著上调。其他微 RNA 下调，包括 miR-126_5、miR_146b、miR-219-5p 以及 miR181b_l、miR_181c 和 miR-221 簇的所有成员。培养的 DU145 和 LNCaP细胞中基线微RNA表达的分析显示，这三个微RNA簇的所有成员在雄激素不敏感性DU145细胞中比在雄激素应答性LNCaP细胞中具有显著更高的表达(FDR〈5%)。
[0231]通过使用Genomatix转录因子结合位点数据库中的基序搜索，我们发现，前面提及的微RNA在它们的侧翼区域具有假定的雄激素受体结合位点(图16-表7)。我们进一步用LNCaP细胞(其用I或10nmol/LR1881处理12、24和48小时)在实验中确证了微阵列结果。成熟miR-338和miR-221的qRT-PCR分析显示，它们的表达水平受雄激素调控(图9A-9B)。
[0232]实施例1的讨论
[0233]我们现已发现前列腺肿瘤中独特的微RNA表达特征和调控肿瘤微RNA加工的基因表达的变化。此外，我们还发现，微RNA的失调影响前列腺中靶mRNA的转录物丰度和蛋白质表达。在细胞培养物中，我们显示，前列腺癌中的候选oncomiR例如miR-32和miR_106b抑制癌症相关基因的蛋白质表达。该结果与改变的微RNA表达在人前列腺癌发生中的致病性作用一致。
[0234]这是使用微RNA和编码蛋白质的RNA的大规模基因表达特征谱分析鉴定在人前列腺肿瘤中发生的微RNA功能的改变的首个研究。本研究的其他有力方面是，样品数量大，并且包括非洲裔美国患者和欧洲裔美国患者。因此，该发现代表在美国具有最高前列腺癌负荷的两个人种/族裔群体(34)。
[0235]我们发现Dicer和DGCR8在前列腺肿瘤中的增加的表达，以及Dicer和编码argonuate-2的EIF2C2在具有高Gleason评分的肿瘤中的增加的表达。Dicer在前列腺癌中上调的观察结果与最近的报导(35)相符并且表明前列腺肿瘤在将微RNA前体加工成成熟微RNA中比正常前列腺组织更有效。最近已显示受损的微RNA加工增加小鼠的肿瘤发生
(8)，其他研究人员已假设微RNA加工在癌细胞中普遍下调(36)。
[0236]然而，在前列腺肿瘤中，增强的微RNA加工的相反作用可能发生，如由我们的数据和前面提及的研究所描述的，所述数据和研究显示前列腺癌细胞中Dicer的增加的蛋白质表达和转移性疾病中Dicer和EIF2C2的过表达(35)。
[0237]微RNA表达特征谱分类人癌症(10; 14)。已报导了几种上皮癌包括乳腺、结肠、肺和胰腺癌的独特特征(11;12;37;38)。两个其他研究调查了前列腺癌中的微RNA表达(39;40) ο与Baylor前列腺数据(40) —致，我们还观察到，miR-145在前列腺肿瘤中显著下调。然而，当与我们的研究相比较时，这两个公开的研究规模相当小并且只检查了少数几个肿瘤。
[0238]我们鉴定了包括上调和下调的微RNA的肿瘤基因特征。
[0239]最高上调的微RNA 是 miR-32，其次是 miR-182、miR-31、miR_26a、miR-200c 和miR_196a。过表达的肿瘤微RNA的清单也包括miR-106b_25簇，这与观察到的mir_25,mir-93和mir_106b的拷贝数在数个人恶性肿瘤中增加一致(41)。
[0240]最显著下调的微RNA 包括 miR-520h、miR-494、miR-490 和 miR-l_133a 簇。
[0241]已在许多研究中观察到人癌症中微RNA的改变的表达。肿瘤中微RNA的上调是很常见的(5，6，8)，并且其与许多微RNA的已知的致癌活性一致(22-25)。上调的机制包括转录激活和基因拷贝数目的增加。成熟微RNA的丰度的减少可由改变的加工引起，如最近所显示的(26)，所述改变的加工可导致成熟微RNA的无差别的更低的表达。我们在本研究中未观察到该现象。备选地，微RNA的表达可以由于突变或基因组改变(21)或微RNA基因座的表观遗传沉默(27，28)而丧失。表观遗传沉默是前列腺癌的重要机制(29)，必须进行另外的研究来阐明该机制是否阻碍微RNA在前列腺肿瘤中的表达。
[0242]关于大多数此类微RNA的功能知之甚少。miR-32是miR-25，miR-92、miR-363和miR-367的同源物。几个此类微RNA在前列腺肿瘤中也上调。miR-32在结肠和前列腺癌中增加(10)，并且是人细胞的抗病毒防御的介体(mediator) (42)。miR-32的该功能可能是其改变的表达与前列腺癌发生之间的联系，因为几个已知的前列腺癌易感基因(susceptibility gene)也参与宿主防御(43)。如对于其他微RNA所显示的，miR-32应当调控革巴基因的蛋白质表达。
[0243]我们获得了新观察结果，miR-32抑制Bim(BCL_2家族的促凋亡成员)的表达(44)。Bim是单倍不足的(haploinsufficient), —个等位基因的失活足以加速Myc诱导的肿瘤发生(45)。Bim在上皮肿瘤的细胞凋亡中具有至关重要的作用并且介导化学疗法的抗肿瘤效应(46)。因此，miR-32对Bim的下调可在肿瘤环境中促成肿瘤细胞对细胞凋亡刺激的抗性。
[0244]其他值得注意的具有已知功能的微RNA包括miR-1、miR-133a和mirR_196a。miR-1-133a簇优先在肌细胞中表达并且经显示调控细胞分化(47; 48)。miR-Ι是miR-206的同源物，其在乳腺癌中为转移的抑制剂(34)。本
【发明者】发现miR-Ι在前列腺肿瘤中下调，这与其同源物的肿瘤抑制剂功能一致。
[0245]我们检查miR-Ι并且观察到，在前列腺肿瘤和培养的前列腺癌细胞中该微RNA的表达与输出蛋白-6和 蛋白质酪氨酸激酶9(也称为A6/twinfilin)的表达呈负相关。关于这两个基因的功能知之甚少，但最近的数据显示，两者都调控细胞肌动蛋白动力学(49-51)。MiR-196a被鉴定为H0XB8的抑制物(52)，并且miR_196a的提高的表达预示胰腺癌的较低的存活(38)。在我们的研究中，该微RNA对于肿瘤特征和前列腺外扩展特征是共同的，这表明前列腺癌中miR-196a的上调可以是疾病进展的因素。
[0246]已显示微RNA特征在人癌症中具有诊断和预后价值(13 ;38;53; 54)。
[0247]我们通过研究微RNA与肿瘤诊断、前列腺外扩展、Gleason评分和患者的人种/族裔的关联确定了前列腺癌中微RNA表达的诊断和预后意义。比较非洲裔美国患者与欧洲裔美国患者的肿瘤微RNA特征，因为最新证据表明，这两个患者群体之间可能存在肿瘤生物学中的差异(55)。虽然在前列腺的肿瘤与非肿瘤组织之间发现微RNA表达的巨大差异，但相对少数的微RNA在扩散出前列腺的肿瘤与未扩散出前列腺的肿瘤之间，在Gleason评分大于7的肿瘤与评分小于7的肿瘤之间以及在来自非洲裔美国患者与欧洲裔美国患者的肿瘤之间差异表达。
[0248]此外，利用PAM鉴定了可区分肿瘤与非肿瘤前列腺组织的由四(4)个微RNA组成的七(7)探针组特征。然而，PAM分析不能产生用于前列腺外扩展、Gleason评分或人种/族裔的良好分类器。
[0249]我们鉴定了以低边际误差与前列腺外疾病扩展相关的一个微RNA，miR_101。该微RNA的功能未知。我们认为，前列腺肿瘤的内在异质性妨碍我们发现更多的与前列腺癌中不利的预后因素相关的微RNA。[0250]微RNA的基因组定位的分析可提供关于它们的假定的功能和在肿瘤中引起改变的微RNA表达的机制的线索(56)。最近的研究已显示，微RNA通常位于蛋白质编码基因的内含子中并且与此类宿主基因共表达(28;29)。我们研究前列腺肿瘤中宿主基因的表达并且发现它们中的几个在前列腺肿瘤中增加。C9orf5和MCM7是两个最高上调的宿主基因，并且它们的表达分别与内含子微RNA，miR-32和miR-106b_25簇的表达相关。该数据暗示了导致前列腺肿瘤中宿主基因和共转录的微RNA的上调的共同机制。
[0251]虽然C9orf5在癌症中的作用未知，但之前发现MCM7扩增与前列腺癌相关联。发现MCM7基因座在88%的癌症复发的病例中扩增(57)。MCM7过表达不限于前列腺癌，已在其他恶性肿瘤包括宫颈癌中观察到MCM7过表达(58)。
[0252]我们检查miR-106b在前列腺癌细胞中是否靶向E2F1和CDKNlA(编码p21/WAFl)并且发现此类基因的蛋白质表达被miR-106b抑制。miR-106b-25簇与两个其他的微RNA簇广泛同源，所述两个其他的微RNA簇是候选人癌基因miR-17-92簇和miR-106a_363簇(15; 59; 60)。E2F1 也是 miR-17-92 簇中的 miR-17_5p 和 miR_20a 的靶(32)，并且其具有癌基因和肿瘤抑制功能(61;62)。与Bim—样，翻译的E2F1是促细胞凋亡的并且与肿瘤抑制基因P53协作以介导细胞凋亡(63)。其过表达诱导LNCaP细胞的细胞凋亡(64)，这表明miR-106b对E2F1翻译的抑制可在肿瘤环境中保护前列腺癌细胞免受细胞凋亡。
[0253]p21/ WAFl是p53肿瘤抑制的介体(65)。已显示p21/WAFl在前列腺癌中的生长抑制作用(66)，其在前列腺癌细胞中响应抗癌剂而介导细胞周期停滞出7;68)。我们检测miR-106b-25簇是否具有抗细胞凋亡活性并且发现其在22Rvl细胞中抑制由多柔比星和依托泊苷产生的胱天蛋白酶活化。
[0254]这些数据与前列腺癌中miR_106b的致癌功能一致，部分因为其抑制E2F1和p21/WAFl蛋白表达的能力。
[0255]miR-1 ,miR-32和miR-106b_25簇都不受LNCaP细胞的雄激素刺激调控。然而，我们鉴定了受雄激素处理而上调或下调的几个其他的微RNA。此类微RNA包括，特别地，miR-338和miR-126以及miR-181b-l、miR-181c、miR-221簇。基序搜索显示，此类微RNA在它们的侧翼区域具有假定的雄激素受体结合位点。
[0256]MiR-338是唯一显著上调的微RNA。没有关于该微RNA的功能的报导，但其在三种上皮癌中位于拷贝数目频繁增加的区域。
[0257]MiR-181家族成员影响造血谱系分化(69)，并且它们的表达在白血病和几种实体瘤中发生改变(10;31)。已发现miR-221簇调控p27Kipl肿瘤抑制基因并且在前列腺癌中可能具有致癌特性(70;71)。然而，该簇也抑制癌基因c-Kit和血管生成(72)。
[0258]已证明受特定微RNA调控的蛋白质编码基因的鉴定非常困难，尽管预测微RNA的靶的计算机方法获得了发展(73; 74)。发现靶mRNA的能力还牵涉微RNA的靶选择性可能依赖于细胞微环境的事实。
[0259]我们使用探测方法和进行前列腺组织中微RNA表达与mRNA表达之间的关联分析。然而不希望受理论束缚，在本文中本
【发明者】现相信，如果目的微RNA影响靶mRNA的转录物丰度，则该方法是成功的，但如果靶基因只受翻译抑制调控，则其是失败的。
[0260]我们发现，在前列腺肿瘤中miR-Ι的表达与许多计算机预测的靶基因例如XP06呈负相关。然而，我们还发现，肿瘤miR-Ι的表达与预测的靶例如PTK9的转录物水平呈正相关。在细胞培养物中对这些观察结果的随后验证确认，XP06和PTK9在前列腺癌细胞中受miR-1调控。
[0261]该数据提供了微RNA与3’ UTR序列的结合可导致哺乳动物细胞中被靶向的mRNA的降解和积累以及人组织中微RNA与mRNA之间的负相关和正相关可预示微RNA的靶基因的新证据。因此，可证明人组织中微RNA和mRNA表达的关联分析在鉴定受微RNA调控的mRNA中是有用的。
[0262]我们现已鉴定了在人前列腺肿瘤中发生并且与这些组织中蛋白质编码基因的表达变化相关的微RNA表达的变化。细胞培养物中的实验显示，肿瘤微RNA可在人前列腺癌细胞中调控癌症相关基因的表达。这些结果显示微RNA在前列腺癌生物学中的致病性作用。
[0263]实施例1I
[0264]引言
[0265]前列腺癌是最频繁诊断的恶性肿瘤并且是美国男性癌症死亡率的第二大原因[I]。死亡率可归因于癌细胞在前列腺外的扩散。神经周浸润(PNI)是前列腺癌中局部浸润的主要途径并且也是疾病的前列腺外扩散的机制[2]。然而，PNI的预后意义仍然存在争议[3-5]。几个研究已观察到PNI与不良结果的标志物的关联[2，6-8]，但其他研究未发现其为前列腺癌的预后因素[9-12]。 [0266]PNI的发生是临床疾病的发展中相对早期的事件，并且大多数来自根治性前列腺切除术的肿瘤样品是PNI阳性的[2]。正是临床样品中PNI的高发生率(85%至100%)和其生物学知识的不足限制了我们对PNI在前列腺癌进展和疾病结果中的作用的理解。
[0267]PNI是其中癌细胞附着至和环绕神经的过程[13，14]。其在许多其他类型的癌症包括胰腺癌和头颈癌中发生[15，16]。具有神经周围定位的前列腺癌细胞获得了存活和生长优势并且当与远离神经的细胞相比较时，展示减少的细胞凋亡和增加的增殖[17，18]。已在PNI中观察到粘着分子在前列腺癌细胞和相邻神经中的表达发生改变，已假设此类分子的改变的表达允许癌细胞在神经的附近旺盛生长[14，19]。
[0268]然而，导致PNI的分子机制仍然知之甚少。
[0269]在实施例1I中，本
【发明者】将微RNA和蛋白质编码基因的基因表达特征谱分析用于鉴定在人前列腺癌中与PNI相关的基因表达的变化。本
【发明者】研究，区别PNI与非PNI肿瘤的基因表达特征是否将显示在从非侵袭性肿瘤转变成具有PNI的肿瘤时发生的分子改变。我们测定了微RNA，因为已证明它们在癌症中的至关重要的作用[20，21]。已显示它们的表达特征谱根据发育谱系和分化状态分类肿瘤[22，23]。
[0270]用于实施例1I的材料和方法
[0271]组织样品。
[0272]从NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource (CPCTR)获得冷冻的肿瘤样品。肿瘤是在前列腺切除术前未接受任何治疗的切除的腺癌。由病理学家再检查宏观解剖的肿瘤样品，其确认冷冻样品中存在肿瘤。在2002至2004年收集所有组织。组织收集由参与单位的制度评审委员会批准。
[0273]RNA 提取。
[0274]按照制造商的说明书(Invitrogen, Carlsbad, CA)使用TRIZOL试剂分离总RNA。使用 Agilent2100B1analyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)验证各样品的 RNA完整性。然后将各RNA样品分成两等分，其经处理用于微RNA微阵列或mRNA微阵列。
[0275]基因微阵列
[0276]如之前所述[24]进行微RNA的标记和杂交。微RNA微阵列(Oh1 StateUniversity Comprehensive Cancer Center, Vers1n2.0)含有以一式四份点印的针对 235个人和222个小鼠微RNA的探针[24]。按照Affymetrix标准方案(Santa Clara, CA)进行mRNA标记和杂交。简而言之，用在5’末端具有T7RNA聚合酶启动子的寡聚(dT)引物反转录5yg总RNA。在第二链合成后，通过使用来自Enzo Life Sciences (Farmingdale,NY)的 B1Array High Yield RNA Transcript Labeling Kit T3 整合生物素化的核糖核苷酸来产生cRNA。将标记的cRNA片段化，然后与Affymetrix GeneChip HG-U133A2.0阵列杂交。该阵列包含代表大约13，000个人蛋白质编码基因的22，283个探针组。使用藻红蛋白缀合的链霉抗生物素蛋白(Invitrogen)显现杂交信号，并且使用GeneChipScanner30007G(Affymetrix)进行扫描。根据关于微阵列实验的最小信息(MIAME)指南，我们将额外的患者信息和微阵列数据的CEL文件保存在GEO库(.ncb1.nlm.nih.gov/geo/)。微RNA和mRNA特征谱数据的GEO提交登录号都是GSE7055。可在ArrayExpress登录号:A-MEXP-258下找到关于定制的微RNA微阵列(版本2.0)的其他信息。
[0277]数据的标准化和统计分析。
[0278]将中值-中心标准化用于定制的微RNA寡核苷酸芯片。使用鲁棒多芯片分析(RMA)方法[25]标准化Affymetrix芯片。为了产生显著差异表达的基因的清单，将所得的数据组经历微阵列显著性分析(SAM)方法[26]。我们基于来自双侧t检验的P值和期望的错误发现率(FDR)产生基因清单。FDR计算按照Storey和Tibshirani描述的方法[27]进行。按照Eisen等人描述的原理[28]进行无监督层次聚类。
[0279]微RNA和mRNA的定量实时PCR分析。
[0280] 按照公开的方案[29]使用MicroRNA Assays试剂盒(Applied
B1systems, Foster City, CA)测量成熟微 RNA 的丰度。使用来自 TaqMan? MicroRNA
Assays试剂盒的成熟微RNA特异性环状RT引物和来自TaqMan? MicroRNA ReverseTranscript1n试剂盒(Applied B1systems)的试剂，按照制造商的指导使用1ng总RNA,将成熟微 RNA 逆转录成 5’ -延伸的 cDNA。使用 Applied B1systems Taqman? 2X
Universal PCR Master Mix 和合适的 5X TaqiMIl? MicroRNAAssay Mix 就各目的微 RNA对
cDNA进行实时PCR。在96孔板中，将一式三份反应物在Applied B1systems7500Real-TimePCR系统中于95°C下温育10分钟，然后进行40个循环的在95°C下15秒和在60°C下I分钟。对于各样品，利用ABI7500Sequence Detect1nSystem软件计算循环阈值(Ct)。使用标准曲线测定样品中微RNA的浓度，然后将其相对于U6RNA进行标准化。按照之前描述的定量实时(qRT)PCR法[30]测定mRNA的丰度。因此，使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied B1systems,Foster City, CA)逆转录 10ng 总 RNA。然后使用 TaqMan GeneExpress1n Assays (Applied B1systems)(其包括特异于待验证的基因的预先最优化的探针和引物组)以一式三份进行qRT-PCR。验证的基因的测定ID号如下:Hs00744661_sH(对于
金属硫蛋白1F)和Hs00828387_gl(对于金属硫蛋白1M)。使用ABI PRISM? 7500SequenceDetect1n System收集数据。将18s RNA用作内部标准参照。使用如所描述的比较Ct法计算标准化的表达，倍数变化来源于各基因的值[30]。
[0281]免疫组织化学
[0282]在福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤切片上对神经周围和非神经周围癌细胞中的蛋白质表达进行免疫组织化学评估。肿瘤(n=30)来自Baltimore VA Hospital和University of Maryland Medical Center的通过根治性前列腺切除术治疗的前列腺患者。就SlOO (神经干的标志物)对5微米切片进行免疫组织化学染色以显现具有PNI的区域。发现来自14个肿瘤的切片包含具有神经周围和非神经周围癌细胞的代表性区域。为了进行抗原恢复，将脱腊的切片在Ix Citra缓冲液(B1genex, San Ramon, CA)中进行微波处理。用Dako Envis1n系统(DakoCytomat1n,Carpinteria,CA)进行免疫组织化学染色。使用下列一抗:1:500稀释的兔多克隆抗体(对于S100) (Ventana, Tucson, AR) ; 1:1000稀释的小鼠单克隆抗体(对于柯萨奇腺病毒受体(CXADR)) (Atlas Antibodies, Stockholm, Sweden);和1:500稀释的小鼠单克隆抗体(对于金属硫蛋白)(DakoCytomat1n)。该抗体(E9)识别金属硫蛋白-1和-2家族成员(#M0639)。阳性对照:肠(CXADR)和肝(金属硫蛋白)。一抗的省略用作阴性对照。对微阵列结果不知情的病理学家评估神经周围和非神经周围癌细胞的免疫染色的强度，将神经周围癌细胞中的免疫染色分类为更低的强度、相同强度或更高的强度(与非神经周围癌细胞相比较)。获取代表性区域的图像以记录表达差异。
[0283]原位杂交。
[0284]按照制造商的方案，使用GenPoint? Catalyzed Signal Amplificat1nSystem (DakoCytomat1n)进行原位杂交(ISH)。简而言之,将载玻片在60°C下温育30分钟，并且如所描述的进行脱腊。切片用蛋白酶K(DakoCytomat1n)在室温下处理30分钟，用dH20漂洗数次，然后在风干前于95%乙醇中浸溃10秒钟。在以50nM的终浓度含有5’ -生物素标记的miR-224miRCURY? LNA检测探针(Exiqon，Woburn, MA)或乱序的阴性对照探针(Exiqon)的缓冲液中于54°C下温育过夜之前，将载玻片在54°C下用原位杂交缓冲液(Enzo Life Sciences, Inc.Farmingdale, NY)预杂交 I 小时。将载玻片在 TBST 和GenPoint?严格清洗液中进行清洗(在54°C下进行30分钟)。然后将载玻片暴露于H2O2封闭溶液(DakoCytomat1n) 20分钟，然后在封闭缓冲液(DakoCytomat1n, X0909)中进一步封闭30分钟，然后按照制造商的方案将其暴露于第一链霉抗生物素-HRP抗体、生物素基酪胺(b1tinyl tyramide)、第二链霉抗生物素-HRP抗体和DAB色原体溶液。然后将载玻片于苏木精中进行短暂复染，在封片之前用TBST和水漂洗。病理学家使用相同的用于免疫组织化学的标准评估神经周围和非神经周围癌细胞中的miR-224的ISH强度。
[0285]途径分析。
[0286]使用内部WPS软件[31]进行该分析。按照基因本体论生物过程(GOBP) (GeneOntology Consortium: geneontology.0rg)注释途径。我们的数据库具有16，762个针对GOBP进行注释的人基因。基于微阵列上它们的相应探针组的FDR( ( 30%)将基因包括入途径分析。如果几个探针组编码相同基因，那么软件可识别该现象并且确保在途径水平上只对该基因进行一次显著性测试。将单侧Fisher’s精确检验用于确定具有统计学上显著的差异表达的基因的富集(P〈0.05)的生物过程。我们汇集Fisher’s精确检验的结果以进行聚类分析，并且以颜色编码的热图展示结果以揭示显著改变的生物过程的模式。热图的颜色编码与生物过程中基因的富集相关(基于-Log(P值))，红色表示更高的富集。
[0287]实施例1I的结果
[0288]临床样品和基因表达分析。
[0289]我们从57位前列腺癌患者的根除性前列腺切除术收集了宏观解剖的肿瘤样品(图22-表8)。7个肿瘤(12%)对于PNI是阴性的。与文献一致，这些肿瘤与PNI阳性肿瘤相比具有更小的大小和更低的Gleason评分。此外，所有PNI阴性肿瘤局限于前列腺。我们研究了具有PNI的肿瘤与对于PNI是阴性的肿瘤之间的基因表达差异。使用代表235个人微RNA的定制的微RNA微阵列和代表大约13，000个人蛋白质编码基因的AffymetrixGeneChip HG-U133A2.0阵列产生来自这些肿瘤的基因表达特征谱。
[0290]在我们的数据组的初步分析中，我们将无监督层次聚类用于检查微RNA和mRNA的表达是否可区分具有PNI的肿瘤和不具有PNI的肿瘤。基于mRNA的全局性表达的层次聚类不能区分PNI病例与非PNI病例(数据未显示)。然而，这些样品的微RNA的表达模式产生了具有不同微RNA特征谱的两个主要簇(图17A-17B)。簇#1包括所有非PNI肿瘤和具有PNI的肿瘤的亚组。簇#2包括比簇#1中的肿瘤明显更可能具有高Gleason评分(> 7)和前列腺外疾病扩展的PNI肿瘤(分别地，P〈0.05;双侧Fisher’s精确检验)。
[0291]微阵列数据的显著性分析显示，在FDR ( 10%的情况下，19个微RNA和34个蛋白质编码基因在PNI与非PNI肿瘤之间显著地差异表达。在该阈值上，所有微RNA在具有PNI的肿瘤中上调(图23-表9) ，而所有mRNA在PNI肿瘤中具有比在非PNI肿瘤中更低的表达(图 24-表 10)。
[0292]差异表达的微RNA的该清单在我们的数据组中对于PNI与非PNI肿瘤之间的比较是独特的。此类微RNA中没有一个因肿瘤分级或分期而显著地差异表达(FDR〈30%)。与PNI对非PNI的比较相反，只有极少数微RNA在高(总评分7-9)和低(总评分5_6) Gleason评分之间(例如，miR-Ι在具有高Gleason评分的肿瘤中下调)以及在器官局限性肿瘤与具有前列腺外扩展的肿瘤之间显著地差异表达。在PNI与非PNI肿瘤之间差异表达的蛋白质编码基因中，许多基因编码金属硫蛋白(金属硫蛋白1F、1G、1H、1M、1X、2A)或具有线粒体定位的蛋白质(4-氨基丁酸转氨酶、亚铁螯合酶和长链酰基辅酶A脱氢酶、线粒体核糖体蛋白L39/S1)。当与低Gleason评分肿瘤相比较时,此类基因的亚组也在具有高Gleason评分的肿瘤中下调(图19A-19D)。与因肿瘤分期而差异表达的基因不存在重叠。
[0293]通过qRT-PCR进行的对微阵列数据的验证。
[0294]选择5个微RNA和2个mRNA用于通过qRT-PCR进行验证(图25-表11)。与微阵列数据一致，我们发现，当与非PNI肿瘤相比较时，成熟miR-224、miR-?Ο、miR_125b、miR-30c和miR-100在PNI肿瘤中的表达显著更高。当与非PNI肿瘤相比较时，金属硫蛋白IM和IF的转录物水平在PNI肿瘤中显著更低，这也与我们的微阵列数据一致。
[0295]因PNI状态而差异表达的蛋白质编码基因的途径关联。
[0296]我们基于GOBP注释的基因(n=62)进行途径分析，所述基因的mRNA在FDR ( 30%时在PNI与非PNI肿瘤之间差异表达。分析显示了富集差异表达的基因(比较PNI肿瘤与非PNI肿瘤)的许多生物过程。最显著改变的生物过程包括有机酸(羧酸)/脂肪酸、氨基酸和(聚)胺的转运和代谢(图26-表12)。它们还包括“神经发生”的生物过程，这与PNI中肿瘤细胞与神经之间的已知的相互作用一致。[0297]进行聚类分析以鉴定富集因肿瘤PNI状态(PNI阳性对PNI阴性)而非因Gleason评分(高对低Gleason评分)、病理分期(pT3对ρΤ2)、或因前列腺外扩展的存在(存在对不存在)而差异表达的基因的生物过程。如通过热图显示的，分析鉴定了独特地富集比较PNI阳性与PNI阴性肿瘤而产生的差异表达的基因的许多生物过程(图18)。这些生物过程包括有机酸(羧酸)/脂肪酸、氨基酸和(聚)胺的代谢和转运，如之前所描述的，还包括与程序化细胞死亡的负调控相关的过程。
[0298]神经周围癌细胞中金属硫蛋白、柯萨奇腺病毒受体和miR-224的表达。
[0299]尽管我们的基于微阵列的分析表明，PNI与非PNI肿瘤在它们的基因表达模式上不同，但该方法未提供关于此类基因在神经周围和非神经周围癌细胞中的表达的信息。我们使用免疫组织化学和原位杂交来研究两种蛋白质编码基因，金属硫蛋白(金属硫蛋白-1和-2)和柯萨奇腺病毒受体(CXADR)以及miR-224在神经周围和非神经周围癌细胞中的相对表达。对来自14个肿瘤的切片进行免疫组织化学，所述切片包含神经周围和非神经周围癌细胞的代表性区域。对来自11个肿瘤的切片进行原位杂交。
[0300]已发现金属硫蛋白、CXADR和miR-224在肿瘤上皮中表达(图19A-19D，图20A-20D和图21A-21D)。金属硫蛋白(上皮、细胞质、细胞核)和CXADR(上皮、膜、细胞质)的标记模式与其他研究人员描述的一致[32，33]。当与相同组织中的非神经周围癌细胞相比较时，分别在6个肿瘤(43%)和7个肿瘤(50%)的神经周围癌细胞中观察到金属硫蛋白和CXADR的更低的表达(图19A-19D，图20A-20D)。除了一个肿瘤(7%)外(其中金属硫蛋白的表达在神经周围癌细胞中的评分比非神经周围癌细胞更高)，在其他肿瘤中未检测到差异。在4个肿瘤(36%)中观察到，miR-224在神经周围癌细胞中的表达显著增加(图21A-21D)。在其他7个肿瘤(其中miR-224的表达在肿瘤上皮中大部分低至不可检测)中未看到这样的差异。
[0301]实施例1I的讨论
[0302]我们研究了 PNI与非PNI肿瘤的基因表达特征谱并且发现它们之间的微RNA与mRNA的表达的显著差异。最令人惊讶的是，基于235个微RNA的表达的无监督层次聚类分析产生两个主要的肿瘤簇，其中一个包括所有非PNI肿瘤。基于13，000个蛋白质编码转录物的表达，我们不能获得这样的分类，这与不能发现前列腺癌中与局部侵袭相关的mRNA表达特征的其他研究一致[34]。
[0303]我们的发现显示，当与非PNI肿瘤相比较时，微RNA的表达可以是比mRNA表达更独特的PNI肿瘤特征。这些发现与之前的报导一致，所述报导显示微RNA表达特征谱在根据发育谱系和分化状态分类肿瘤中可优于mRNA表达特征谱[22，23]。
[0304]发现19个微RNA在PNI肿瘤中比在非PNI肿瘤中更高地表达。其中，miR-10、miR-21和miR-125b是候选癌基因[35-37]。此外，miR-21和miR-224位于恶性肿瘤相关染色体区域，已发现该区域在人前列腺癌中具有增加的基因表达[38]。已描述了对于几种人实体癌包括前列腺癌是共同的微RNA表达特征[23]。该研究与我们的PNI特征之间的共有微RNA是miR-21、miR-24和miR-30c。然而，最值得注意的是，PNI特征与在实验条件下发现的其他微RNA特征的重叠。
[0305]已发现缺氧诱导miR-24、miR_26、miR-27 和 miR-181 [39]。此类微 RNA 也在 PNI肿瘤中上调。甚至更显著的是PNI特征与LPS处理的小鼠的肺中炎症诱导的微RNA特征之间的相似性。此处，LPS诱导，除几种其他的微RNA以外，miR-21, miR-27b, miR-100和miR-224 [40]。因此，观察到的PNI微RNA特征可能部分地是癌性前列腺中促炎环境和缺氧的结果。
[0306]为了估计PNI特征中由肿瘤分级和分期产生混杂效应的可能性，我们将在PNI与非PNI肿瘤之间差异表达的微RNA的清单与比较高Gleason评分的肿瘤与低Gleason评分的肿瘤以及比较器官局限性肿瘤与显示前列腺外扩展的肿瘤得到的相同清单相比较。该额外的分析显示，这两个对比不共有PNI特征。相反地，只发现极少数微RNA因肿瘤分级和分期而显著差异地表达。前列腺肿瘤的异质性可能已限制我们发现与这两个预后因素相关的微RNA特征的能力。备选地，PNI特征对于非PNI至PNI的转换可以是显著不同和独特的并且可能特异性地参与神经与癌细胞之间的相互作用。该特征还可以是癌细胞的瞬时现象，当这些细胞从它们的神经周围定位扩散时，该特征消失。我们分析miR-224(因PNI状态而最差异地表达的微RNA)在神经周围和非神经周围癌细胞中的表达并且发现其在肿瘤亚组的神经周围癌细胞中表达增加。虽然并非所有肿瘤都显示miR-224在神经周围癌细胞中上调，但观察显示，癌细胞籍以附着至神经的机制可牵涉miR-224的诱导。
[0307]mRNA表达特征谱的分析显示，在FDR阈值≤ 10%时34个基因在PNI肿瘤中下调。即使我们观察到在PNI肿瘤中比在非PNI肿瘤中更高表达的基因例如CRISP3，PSCA, BMP7或BCL2，它们的高FDR也将它们排除出我们的显著差异表达的基因的清单。只有两个其他的研究(使用DU-145前列腺癌细胞与神经元细胞的共培养模型)检查了与PNI相关的mRNA的表达特征谱[18，19]。这些研究发现编码bystin和Pim_2的基因在PNI中上调。我们在PNI肿瘤中未检测到相应的mRNA的增加。不同的方法可解释不同研究中产生的基因清单之间的一些差异。此外，我们的芯片不包括针对编码bystin的基因的探针组。
[0308] 34个差异表达的基因中的几个基因是金属硫蛋白基因家族的成员。这些基因位于染色体16ql3上的基因簇中[41]并且已发现这些基因通过启动子超甲基化和减少的锌可用性在前列腺癌中下调[32，42，43]。通过免疫组织化学，我们确认，当与前列腺肿瘤亚组中非神经周围癌细胞相比较时，金属硫蛋白的表达在神经周围癌细胞中显著更低。在从非PNI肿瘤至pNI肿瘤的转换时的下调可显示在该疾病期发生的癌细胞金属代谢的重要变化。我们的差异表达的基因的清单中几个其他基因编码具有线粒体定位的蛋白质，例如，特别地，4-氨基丁酸转氨酶、亚铁螯合酶和长链酰基辅酶A脱氢酶。氨基丁酸转氨酶和长链酰基辅酶A脱氢酶是细胞的有机酸(羧酸)代谢(例如酮体，脂肪酸)中的至关重要的基因，而亚铁螯合酶参与血红素的生物合成[44]。线粒体的代谢和基因组的改变是前列腺癌发生中的常见事件[45-47]。我们的数据显示，一些此类改变可在至PN1-阳性肿瘤的转换中发生。
[0309]发现其在PNI肿瘤中下调的其他基因是编码精胺合酶、v-MAF癌基因同源物(MAF)和CXADR的基因。精胺合酶是催化亚精胺转化为精胺的多胺合成途径的至关重要的酶。已观察到多胺合成途径在前列腺癌中转录失调[48]。精胺是前列腺癌细胞生长的内源抑制剂
[49]。因此，精胺合酶的下调可允许前列腺癌细胞在神经周围环境中增加生长和存活。MAF是淋巴瘤和骨髓瘤的癌基因，但发现其为前列腺癌的候选肿瘤抑制基因[50]。CXADR在腺病毒至人细胞内的摄取中具有至关重要的功能[51]。已发现当与正常前列腺相比较时，该受体在局部晚期前列腺癌中下调[33]。
[0310]因为单基因效应不可能引起PNI，所以我们进行在PNI肿瘤与非PNI肿瘤之间差异表达的蛋白质编码基因的途径分析。该分析显示，当与非PNI肿瘤相比较时，PNI肿瘤中最显著改变的生物过程是调控细胞和能量代谢的生物过程。其他改变的生物过程与神经元功能例如神经发生和神经冲动的传递以及与细胞死亡的负调控相关。后者与之前的发现(即，神经周围定位的前列腺癌细胞显示减少的细胞凋亡和增加的存活)[17，18] 一致。
[0311]我们观察到在从非PNI肿瘤转换成PNI肿瘤时微RNA和mRNA表达发生显著改变。无监督层次聚类显示，非PNI肿瘤与PNI肿瘤在它们的微RNA表达特征谱上的差异大于在它们的mRNA表达特征谱上的差异。我们还鉴定了与线粒体功能和细胞代谢相关的许多基因和生物过程，其在PNI中可以是功能上显著的。
[0312]其用途和定义的实例
[0313]除非另外指出，否则本发明的实施将使用在本领域技术人员的能力之内的药物学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。此类技术在文献中得到详尽的解释。参见，例如，Handbook of Experimental Immunology,第 1-1V 卷(D.M.Weir和 C.C.Blackwell eds., BlackwelI Scientific Publicat1ns) ;A.L.Lehninger,B1chemistry (Worth Publishers, Inc., current addit1n);Sambrook 等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual (第 2 版，1989) ;Methods In Enzymology (S.Colowick 和N.Kaplan eds., Academic Press, Inc.)。
[0314]因此，本文中提供了用于进一步解释的定义，所述定义不应解释为限定性的。 [0315]冠词“a”和“an”在本文中是指一个或多于一个(即，至少一个)冠词的语法对象。例如，“an element”是指一个元素或多于一个的元素。
[0316]“标志物”和“生物标志物”是与其在正常或健康组织或细胞中的表达水平相比，其在组织或细胞中改变的表达水平与病症和/或疾病状态相关的基因和/或蛋白质和/或其功能性变体。
[0317]标志物的“正常”的表达水平是标志物在未患病症和/或疾病状态的人受试者或患者的细胞中的表达水平。
[0318]标志物的“过表达”或“显著更高的表达水平”是指测试样品中的表达水平，所述表达水平高于用于估量表达的测定的标准误，在某些实施方案中，至少2倍，在其他实施方案中，3、4、5或10倍于对照样品(例如，来自未患有标志物相关病症和/或疾病状态的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和在某些实施方案中几个对照样品中的标志物的平均表达水平。
[0319]标志物的“显著更低的表达水平”是指测试样品中的表达水平，所述表达水平比对照样品(例如，来自未患有标志物相关病症和/或疾病状态的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和在某些实施方案中几个对照样品中的标志物的平均表达水平低至少2倍，在其他实施方案中低3、4、5或10倍。
[0320]试剂盒是包含至少一种试剂，例如用于特异性检测标志物的表达的探针的任何产品(例如，包装或容器)。可以以用于进行本发明的方法的单位的形式推销(promote)、分配或销售试剂盒。
[0321]“蛋白质”包括标志物蛋白和它们的片段；变异标志物蛋白和它们的片段；包含标志物或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸的区段的肽和多肽；以及包含标志物或变异标志物蛋白，或标志物或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸的区段的融合蛋白。[0322]本文中所述的组合物、试剂盒和方法特别地具有下列非限定性用途:
[0323]I)评估受:试者是否患有病症和/或疾病状态；
[0324]2)评估受试者的病症和/或疾病状态的分期；
[0325]3)评估受试者的病症和/或疾病状态的分级；
[0326]4)评估受试者的病症和/或疾病状态的性质；
[0327]5)评估受试者发生病症和/或疾病状态的可能性；
[0328]6)评估与受试者的病症和/或疾病状态相关的细胞的组织学类型；
[0329]7)制备可用于治疗受试者的病症和/或疾病状态的抗体、抗体片段或抗体衍生物；
[0330]8)评估病症和/或疾病状态在受试者的细胞中的存在；
[0331]9)评估一种或多种测试化合物抑制受试者的病症和/或疾病状态的功效；
[0332]10)评估疗法抑制受试者的病症和/或疾病状态的功效；
[0333]11)监控受试者的病症和/或疾病状态的进展；
[0334]12)选择抑制受试者的病症和/或疾病状态的组合物或疗法；
[0335]13)治疗患有病症和/或疾病状态的受试者；
[0336]14)抑制受试者的病症和/或疾病状态；
[0337]15)评估测试化合物的有害潜能；和
[0338]16)预防处于发生病症和/或疾病状态的风险中的受试者的病症和/或疾病状态的发作。
[0339]筛选方法
[0340]可产生动物模型以使能够筛选可用于治疗或预防受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂。因此，该方法可用于鉴定用于治疗或预防受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂。该方法包括对由本文所述的方法产生的动物模型施用候选试剂，评估与未施用候选试剂的对照动物模型相比动物模型中的至少一种应答。如果至少一种应答在症状上减轻或在发作上延迟，则候选试剂是用于治疗或预防疾病的试剂。
[0341]候选试剂可以是本领域已知的药理学试剂(pharmacologic agent)或可以是之前未知具有任何药理活性的试剂。试剂可以是天然产生的或实验室中设计的。它们可从微生物、动物或植物分离，或可重组产生或通过任何适当的化学方法合成。它们可以是小分子、核酸、蛋白质、肽或模拟肽(peptidomimetics)。在某些实施方案中，候选试剂是具有大于50且小于大约2，500道尔顿的分子量的小有机化合物。候选试剂包含与蛋白质结构性相互作用所必需的官能团。还在生物分子中发现候选试剂，包括但不限于:肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。
[0342]可从多种来源(包括合成的或天然化合物的文库)获得候选试剂。存在例如许多可获得用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子的方法，包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。备选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物的形式存在的天然化合物的文库是可获得的或可容易地产生。此外，天然或合成产生的文库和化合物可容易地通过常规化学、物理和生物学方法进行修饰，并且可用于产生组合文库。在某些实施方案中，候选试剂可使用组合文库方法领域中的许多方法中的任一方法来获得，所述方法包括非限定性实例:生物文库法；空间可定位平行固相或溶液相文库法(spatially addressable parallel solidphase or solut1n phase libraries);需要解卷积(deconvolut1n)的合成文库法；“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。
[0343]在某些其他实施方案中，可将某些药理学药剂经历定向或随机化学修饰，例如酰化、烧化、酯化、酰胺化(amidificat1n)等以产生结构类似物。
[0344]用于鉴定治疗受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂的相同方法还可用于验证体外研究产生的前导化合物(lead compound) /试剂。
[0345]候选试剂可以是上调或下调受试者中一个或多个病症和/或疾病状态应答途径的试剂。在某些实施方案中，候选试剂可以是影响这样的途径的拮抗剂。
[0346]用于治疗病症和/或疾病状态的方法
[0347]本文提供了用于治疗、抑制、减轻或逆转病症和/或疾病状态应答的方法。在本文所述的方法中，对有此需要的个体施用干扰信号级联的试剂，所述个体例如但不限于其中这样的并发症还不明显的受试者和已具有至少一种这样的应答的受试者。
[0348]在前一种情况下，这样的治疗用于预防此类应答的发生和/或减轻它们发生的程度。在后一种情况下，这样的治疗用于减轻此类应答发生的程度，阻止它们进一步发展或逆转所述应答。
[0349]在某些实施方案中，干扰应答级联的试剂可以是对此类应答特异的抗体。
[0350]生物标志物的表达
[0351]可以以许多方式抑制标志物的表达，所述方式包括非限定性实例:可对疾病细胞提供反义寡核苷酸以抑制标志物的转录、翻译或两者。备选地，可对细胞提供编码特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段并且与适当的启动子/调节子区域有效连接的多核苷酸，以产生抑制所述蛋白的功能或活性的细胞内抗体。标志物的表达和/或功能还可通过用特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段处理疾病细胞来抑制。通过使用本文中描述的方法，可筛选多种分子，特别地包括足够小以使它们能够穿过细胞膜的分子，以鉴定抑制标志物的表达或抑制标志物蛋白的功能的分子。可对受试者提供如此鉴定的化合物以抑制受试者的疾病细胞。
[0352]任何标志物或标志物的组合，以及与所述标志物组合的任何特定标志物可用于本文中描述的组合物、试剂盒和方法中。一般地，期望使用这样的标志物，对于所述标志物，疾病细胞中该标志物的表达水平与正常系统细胞中相同标志物的表达水平之间的差异尽可能大。虽然该差异可以小至用于评估标志物的表达的方法的检测极限，但期望差异至少大于评估方法的标准误，在一些实施方案中，与正常组织中相同标志物的表达水平相比，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000 倍或更大的差异。
[0353]已公认，某些标志物蛋白被分泌至围绕细胞的细胞外空间。由于此类标志物蛋白可在体液样品中检测，因此将这些标志物用于组合物、试剂盒和方法的某些实施方案，所述体液样品可以比组织活检样品更容易地从人受试者收集。此外，用于检测标志物蛋白的体内技术包括将抗所述蛋白的标记抗体引入受试者。例如，抗体可用其在受试者中的存在和定位可利用标准成像技术来检测的放射性标记物进行标记。
[0354]为了确定任何特定的标志物蛋白是否是分泌蛋白，在例如哺乳动物细胞例如人细胞系中表达标志物蛋白，收集细胞外液体，评估蛋白质在细胞外液体中的存在或不存在(例如，使用特异性结合所述蛋白的标记抗体)。[0355]应理解，含有此类细胞的受试者样品可用于本文中所述的方法。在这些实施方案中，标志物的表达水平可通过评估样品中标志物的量(例如，绝对量或浓度)来评估。当然，可在评估样品中标志物的量之前将细胞样品经历多种收集后制备和贮藏技术(例如，核酸和/或蛋白质提取、固定、贮藏、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。
[0356]还应理解，可使标志物流出细胞进入例如呼吸系统、消化系统、血流和/或间质间隙。可以例如通过检查痰、BAL、血清、血浆、尿、粪便等来检测流出的标志物。
[0357]组合物、试剂盒和方法可用于检测标志物蛋白的表达，所述标志物蛋白具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。例如，可将免疫学方法用于检测完整细胞上的此类蛋白，或可将基于计算机的序列分析法用于预测至少一个细胞外结构域(即，包括分泌蛋白和具有至少一个细胞表面结构域的蛋白质)的存在。可检测标志物蛋白的表达而无需裂解细胞(例如，使用特异性结合蛋白的细胞表面结构域的标记抗体)，所述标志物蛋白具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。
[0358]标志物的表达可通过多种用于检测转录的核酸或蛋白质的表达的方法中的任一种来评估。此类方法的非限定性实例包括用于检测分泌蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交法、核酸逆转录法以及核酸扩增法。
[0359]在特定的实施方案中，标志物 的表达可使用特异性结合标志物蛋白或其片段(包括已经历所有或部分其正常翻译后修饰的标志物蛋白)的抗体(例如，放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如，缀合有底物或蛋白质或蛋白质-配体对的配体的抗体)或抗体片段(例如，单链抗体、分离的抗体高变结构域等)来评估。
[0360]在另一个特定的实施方案中，标志物的表达通过下述来评估:从受试者样品的细胞制备mRNA/cDNA(即，转录的多核苷酸)，然后将mRNA/cDNA与为标志物核酸的互补序列的参照多核苷酸或其片段杂交。任选地，可在与参照多核苷酸杂交前使用多种聚合酶链式反应方法中的任一种来扩增cDNA ;优选，其不进行扩增。同样可使用定量PCR检测一个或多个标志物的表达以评估标志物的表达水平。备选地，可使用检测标志物的突变或变体(例如，单核苷酸多态性、缺失等)的许多方法中的任一种来检测受试者中标志物的存在。
[0361]在相关实施方案中，将获自样品的转录的多核苷酸的混合物与在其上固定有多核苷酸(其与标志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更多个核苷酸残基)互补或同源)的基质接触。如果可在基质上差异地检测到互补或同源的多核苷酸(例如，可使用不同的发色团或荧光团检测或固定至不同的选择的位置)，那么可使用单个基质(例如，固定在所选择的位置上的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)同时评估多个标志物的表达水平。当使用包括将一个核酸与另一个核酸杂交的评估标志物表达的方法时，期望在严格杂交条件下进行杂交。
[0362]在某些实施方案中，可使用质谱法或表面等离子共振术进行生物标志物测定(b1marker assay)。在不同的实施方案中，鉴定活性抗受试者的病症和/或疾病状态的试剂的方法可包括一个或多个下列步骤:a)提供含有一个或多个标志物或其衍生物的细胞的样品山)从此类细胞制备提取物；c)将所述提取物与含有标志物结合位点的标记核酸探针混合；和，d)在测试试剂存在或不存在的情况下测定标志物与核酸探针之间的复合物的形成。测定步骤可包括将所述提取物/核酸探针混合物经历电泳迁移率试验(electrophoretic mobility shift assay)。
[0363]在某些实施方案中，测定步骤包括选自酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于荧光的测定和超高通量测定，例如，表面等离子共振术(SPR)或荧光相关光谱(FCS)测定的测定。在此类实施方案中，SPR传感器用于指导生物分子相互作用的实时观察，因为SPR对金属-电介质表面上的微小折射率改变非常敏感。SPR是对大约200nm的SPR传感器/样品介面内的15至10_6折射率(RI)单位的改变敏感的表面技术。因此，SPR光谱法用于监控沉积在传感层上的薄有机薄膜的生长。
[0364]因为组合物、试剂盒和方法依赖于一种或多种标志物的表达水平的差异的检测，因此期望标志物的表达水平显著大于用于评估至少一种正常细胞和受癌症影响的细胞中的表达的方法的最小检测极限。
[0365]应理解，通过使用一种或多种标志物对另外的受试者样品进行常规筛选，将了解某些标志物在不同类型的细胞，包括受试者的特定病症和/或疾病状态细胞中过表达。
[0366]此外，通过就标志物的表达评估更大数量的受试者样品，并且使从其获得样品的个体受试者的结果相互关联，还将确认某些标志物的改变的表达与受试者的病症和/或疾病状态强相关以及其他标志物的改变的表达与其他疾病强相关。从而组合物、试剂盒和方法可用于表征受试者的病症和/或疾病状态的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种。
[0367]当组合物、试剂盒和方法用于表征受试者的病症和/或疾病状态的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种时，期望选择标志物或标志物组以使在至少大约20%,在某些实施方案中，至少大约40%、60%或80%和基本上所有受试者(其患有相应分期、分级、组织学类型或性质的病症和/或 疾病状态)中获得阳性结果。可选择本发明的标志物或标志物组以使对于一般群体可获得大于大约10%的阳性预测值(在非限定性的实例中，外加大于80%的测定特异性)。
[0368]当多个标志物用于组合物、试剂盒和方法时，可在单个反应混合物(即，使用针对各个标志物的试剂，例如不同的荧光探针)或在相应于一个或多个标志物的单独的反应混合物中，将受试者样品中各标志物的表达水平与相同类型的非病症和/或非疾病样品中多个标志物中的每一个的正常表达水平相比较。在一个实施方案中,相对于相应的正常水平，样品中一个以上的标志物的显著增加的表达水平表示受试者患有病症和/或疾病状态。当使用多个标志物时，可使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多个单独的标志物；在某些实施方案中，可能期望使用更少的标志物。
[0369]为了使组合物、试剂盒和方法的灵敏性最大化(即在干扰可归因于受试者样品中系统来源的细胞的情况下)，期望本文中所使用的标志物是具有受限制的组织分布(例如通常不在非系统组织中表达)的标志物。
[0370]应认识到，组合物、试剂盒和方法对于具有增加的发生受试者的病症和/或疾病状态的风险的受试者和他们的医学顾问将是特别有用的。被认为具有增加的发生病症和/或疾病的风险的受试者包括例如具有此类病症或疾病的家族史的受试者。
[0371]可以以多种方法评估正常人系统组织中标志物的表达水平。在一个实施方案中，该正常表达水平通过下述来评估:评估一部分表现正常的系统细胞中标志物的表达水平且将该正常表达水平与一部分怀疑为异常的系统细胞中的表达水平相比较。备选地，特别是当由于常规进行本文中所述的方法而可获得进一步的信息时，可使用标志物的正常表达的群体平均值。在其他实施方案中，标志物的〃正常〃表达水平可通过评估标志物在从未受影响的受试者获得的受试者样品、在怀疑病症和/或疾病状态在受试者中发作之前从受试者获得的受试者样品、编档保存的受试者样品等中的表达来进行测定。
[0372]本文中还提供了用于评估病症和/或疾病状态细胞在样品(例如编档保存的组织样品或从受试者获得的样品)中的存在的组合物、试剂盒和方法。这些组合物、试剂盒和方法基本上与上述的相同，除了必要时，使组合物、试剂盒和方法适用于除了受试者样品外的样品。例如，当待使用的样品是石蜡包埋的(parafinized)编档保存的人组织样品时，可能必需在用于评估样品中标志物表达水平的组合物、试剂盒或方法中调整化合物的比例。
[0373]试剂盒和试剂
[0374]试剂盒可用于评估疾病细胞的存在(例如在样品例如受试者样品中)。试剂盒包括多种试剂，其各自能够特异性结合标志物核酸或蛋白质。用于与标志物蛋白结合的合适的试剂包括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。用于与标志物核酸(例如基因组DNA、MRNA、剪接的MRNA、cDNA等)结合的合适的试剂包括互补核酸。例如，核酸试剂可包括固定至基质的寡核苷酸(标记的或未标记的)、不与基质结合的标记的寡核苷酸、PCR引物对、分子信标探针等。
[0375]试剂盒可任选地包含用于进行本文中所述的方法的另外的成分。例如，试剂盒可包含适合于使互补核酸 退火或适合于使抗体与其特异性结合的蛋白质结合的液体(例如SSC缓冲液)、一个或多个样品隔室、描述方法的进行的说明书、正常系统细胞样品、癌症相关疾病细胞样品等。
[0376]产生抗体的方法
[0377]本文中还提供了制备产生用于评估受试者是否患有病症和/或疾病状态的抗体的分离的杂交瘤的方法。在该方法中，合成或分离(例如通过从表达其的细胞纯化或通过体内或体外转录和翻译编码蛋白质或肽的核酸)含有完整标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽。使用蛋白质或肽免疫脊椎动物例如哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔或绵羊。任选地(和优选地)可用蛋白质或肽免疫脊椎动物至少另外一次，从而使脊椎动物呈现强烈的针对蛋白质或肽的免疫应答。从免疫的脊椎动物分离脾细胞，使用多种方法中的任一种将其与永生化的细胞系融合从而形成杂交瘤。然后使用标准方法筛选以该方式形成的杂交瘤，从而鉴定一个或多个产生特异性结合标志物蛋白或其片段的抗体的杂交瘤。本文还提供了通过该方法制备的杂交瘤和使用这样的杂交瘤制备的抗体。
[0378]评估有效性的方法
[0379]本文还提供了评估测试化合物抑制疾病细胞的有效性的方法。如上所述，标志物的表达水平的差异与受试者的细胞的异常状态相关。虽然公认，某些标志物的表达水平的变化可能由此类细胞的异常状态引起，但同样公认，其他标志物的表达水平的变化诱导、维持和促进此类细胞的异常状态。因此，抑制受试者的病症和/或疾病状态的化合物将使一个或多个标志物的表达水平改变至更接近该标志物的正常表达水平(即，所述标志物在正常细胞中的表达水平)的水平。
[0380]因此本方法包括将在测试化合物存在的情况下维持的第一细胞样品中的标志物的表达与在测试化合物不存在的情况下维持的第二细胞样品中的标志物的表达相比较。在测试化合物存在的情况下，标志物的显著减少的表达表示该测试化合物抑制相关疾病。细胞样品可以例如是获自受试者的正常细胞的单个样品的等分、获自受试者的正常细胞的混合样品、正常细胞系的细胞、获自受试者的相关疾病细胞的单个样品的等分、获自受试者的相关疾病细胞的混合样品、相关疾病细胞系的细胞等。
[0381]在一个实施方案中，样品是获自受试者的癌症相关疾病细胞，并且检测多种据认为对于抑制各种癌症相关疾病是有效的化合物，以鉴定可能最佳地抑制受试者的癌症相关疾病的化合物。
[0382]同样可将该方法用于评估疗法抑制受试者的相关疾病的有效性。在该方法中，评估一个或多个标志物在样品对(一个样品经历疗法，另一个不经历疗法)中的表达水平。与评估测试化合物的有效性的方法一样，如果疗法诱导显著更低的标志物表达水平，则疗法对于抑制癌症相关疾病是有效的。如上，如果来自选择的受试者的样品用于本方法，那么可在体外评估备选疗法以选择对于抑制受试者的癌症相关疾病最可能有效的疗法。
[0383]如本文中所描述的，人细胞的异常状态与标志物的表达水平的变化相关。还提供了用于评估测试化合物的有害潜能的方法。该方法包括在测试化合物存在和不存的情况下维持分开的人细胞等分。比较各等分中标志物的表达。在测试化合物存在的情况下维持的等分中标志物的显著更高的表达水平(相对于在测试化合物不存在的情况下维持的等分)表示测试化合物具有有害的潜能。各种测试化合物的相对有害潜能可通过比较相关标志物的表达水平的增强或抑制的程度，通过比较其表达水平被增强或抑制的标志物的数目，或通过比较两者来评估。在下列部分更详细地描述了各个方面。
[0384]分离的蛋白质和抗体
[0385]一个方面涉及分离的标志物蛋白和其生物活性部分，以及适合用作免疫原以产生抗标志物蛋白或其片段的抗体的多肽片段。在一个实施方案中，天然标志物蛋白可使用标准蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从细胞或组织来源分离。在另一个实施方案中，含有完整的标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽通过重组DNA技术产生。除重组表达外，可使用标准肽合成技术化学合成此类蛋白质或肽。
[0386]“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含细胞材料或来自细胞或组织来源(所述蛋白质源自于其)的其他污染性蛋白，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学药品。术语“基本上不含细胞材料”包括其中将蛋白质与从其分离或重组产生所述蛋白质的细胞的细胞组分分离的蛋白质制剂。因此，基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有低于大约30%、20%、10%或5%(按干重计算)的异种蛋白质(在本文中也称为“污染性蛋白”)的蛋白质制剂。
[0387]当重组产生蛋白质或其生物活性部分时，其也优选基本上不含培养基，即，培养基占据低于大约20%、10%或5%的蛋白质制剂的体积。当通过化学合成产生蛋白质时，其优选基本上不含化学前体或其他化学药品，即，其与参与蛋白质合成的化学前体或其他化学药品分离。因此，此类蛋白质制剂具有低于大约30%、20%、10%、5%(按干重计算)的化学前体或除了目的多肽外的化合物。
[0388]标志物蛋白的生物活性部分包括含有与标志物蛋白的氨基酸序列充分同一或源自于其的氨基酸序列的多肽，其包含比全长蛋白质更少的氨基酸，并且展示相应的全长蛋白质的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有相应的全长蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。标志物蛋白的生物活性部分可以是其长度为例如10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。此外，其中标志物蛋白的其他区域被缺失的其他生物活性部分可通过重组技术来制备，并且可就标志物蛋白的天然形式的一种或多种功能活性对其进行评估。在某些实施方案中，有用的蛋白质与此类序列之一基本上同一(例如，至少大约40%，在某些实施方案中，50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一)并且保持相应的天然发生的标志物蛋白的功能活性但因天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上不同。
[0389]此外，标志物蛋白的区段文库可用于产生用于筛选和随后选择变异标志物蛋白或其区段的多肽的多样化(variegated)群体。
[0390]预测医学
[0391]本文中还提供了动物模型和标志物在预测医学领域中的用途，其中诊断测定、预后测定、药物基因组学和监控临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性治疗个体。因此，本文中还提供了用于测定一个或多个标志物蛋白或核酸的表达水平以确定个体是否处于发生特定病症和/或疾病的风险中的诊断测定。此类测定可用于预后或预测目的，从而在病症和/或疾病发作之前预防性治疗个体。
[0392]在另一个方面，方法可用于相同个体的至少周期性筛查以观察该个体是否已暴露于改变他/她的表达模式的化学药品或毒素。
[0393]另一方面涉及监控被施用以抑制病症和/或疾病或治疗或预防任何其他病症的试剂(例如，药物或其他化合物)在临床试验中对标志物的表达或活性的影响(例如，以了解这样的治疗可能具有的任何系统性作用)。
[0394]药物组合物
[0395]化合物可进行配制以用于在合适的药物载体中局部(topically)、局域(locally)或全身性施用。Remington’s Pharmaceutical Sciences,第 15 版，E.ff.Martin (MarkPublishing Company, 1975),公开了常用载体和制备方法。化合物还可以封装在用于祀向细胞的合适的生物相容性微胶囊、微粒或微球体(由生物可降解或非生物可降解聚合物或蛋白质或脂质体形成)。此类系统对于本领域技术人员来说是熟知的并且可进行最优化以与合适的核酸一起使用。
[0396]在例如Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, New York;和 Ausubel 等人，1994, Current Protocols inMolecular B1logy, John ffiley&Sons, New York中描述了用于核酸递送的各种方法。此类核酸递送系统包括期望的核酸，例如但不限于，其以“裸露的”形式作为“裸露的”核酸，或配制于适合于递送的媒介物中例如与阳离子分子或形成脂质体的脂质的复合物中，或作为载体的成分或药物组合物的成分。可将核酸递送系统直接(例如通过将其与细胞接触)或间接(例如通过任何生物过程的作用)提供给细胞。
[0397]用于局部施用的制剂可包括软膏、洗剂、乳膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。需要时可使用常规药物载体(水性的、粉状的或基于油的)或增稠剂。
[0398]适合用于胃肠外施用例如通过关节内(关节中)、静脉内、肌内、真皮内、腹膜内和皮下途径施用的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与期望的受者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液、溶液或乳剂，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、分散剂、稳定剂和防腐剂。用于注射的制剂可以以单位剂型、与加入的防腐剂一起存在，例如存在于安瓿中或存在于多剂量容器中。本领域技术人员可容易地确定制备和配制组合物的各种参数而无需过度的实验。可单独地或与其他合适的成分组合来使用化合物。
[0399]—般地，施用化合物(包括核酸)的方法在本领域内是熟知的。特别地，已用于核酸治疗剂的施用途径，和目前使用的制剂一起，为选择的核酸提供了优选的施用和配制途径，当然这将取决于因素例如特定的制剂、待治疗的受试者的状态的严重度和治疗功效所需的剂量。如本文中通常使用的，“有效量”是指在对其施用了制剂的受试者(与未接受所述化合物的匹配的受试者相比较)中能够治疗病症的一个或多个症状，逆转病症的一个或多个症状的进展，终止病症的一个或多个症状的进展或预防病症的一个或多个症状的发生的量。化合物的实际有效量可根据待使用的特定化合物或其组合、配制的特定组合物、施用模式，和个体的年龄、体重、状况，和待治疗的症状或病况的严重度而变化。
[0400]本领域技术人员已知的任何可接受的方法可用于给受试者施用制剂。取决于待治疗的病况，施用可以是局部的(即，至特定区域、生理系统、组织、器官或细胞类型)或全身性的。
[0401]药物基因组学
[0402]标志物还可用作药物基因组学标志物。如本文中所用的，“药物基因组学标志物”是其表达水平与受试者中特定临床药物应答或易感性相关的目的生物化学标志物。药物基因组学标志物表达的存在或量与预测的受试者应答和更特别地受试者的肿瘤对用特定药物或药物种类的疗法的应答相关。通过评估受试者中一个或多个药物基因组学标志物的表达的存在或量，可选择最适合于受试者的或预测具有更大的成功程度的药物疗法。 [0403]监控临床试验
[0404]监控试剂(例如，药物化合物)对标志物的表达水平的影响不仅可用于基础药物筛选，而且还可用于临床试验。例如，可在接受癌症相关疾病治疗的受试者的临床试验中监控试剂影响标志物表达的有效性。
[0405]在一个非限定性实施方案中，本发明提供了用于监控利用试剂(例如，激动剂、拮抗剂、模拟肽、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他药物候选物)治疗受试者的有效性的方法，该方法包括步骤:
[0406]i)在施用试剂之前从受试者获得施用前的样品；
[0407]ii)检测一个或多个选择的标志物在施用前的样品中的表达水平；
[0408]iii)从受试者获得一个或多个施用后的样品；
[0409]iv)检测标志物在施用后的样品中的表达水平；
[0410]V)将施用前的样品中标志物的表达水平与施用后的样品中标志物的表达水平相比较；和
[0411]vi)相应地改变试剂至受试者的施用。
[0412]例如，在治疗过程中增加的标志物基因的表达可表明无效剂量，从而需要增加剂量。相反地，减少的标志基因的表达可表明有效治疗，从而不需要改变剂量。
[0413]电子设备可读介质、系统、阵列和使用其的方法
[0414]如本文中所使用的，“电子设备可读介质”是指用于存储、保存或包含可用电子设备直接阅读和存取的数据或信息的任何适当介质。此类介质可包括但不限于:磁性存储介质，例如软盘、硬盘存储介质以及磁带；光学存储介质例如光盘；电子存储介质例如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等；以及普通硬盘和这些类别的混合体例如磁性/光学存储介质。可对介质进行改造或设定以用于在其上记录本文中所述的标志物。
[0415]如本文中所用的，术语“电子设备”旨在包括任何适当的计算或处理设备或其他经改造或设定用于存储数据或信息的装置。适合用于本发明的电子设备的实例包括独立的计算设备；网络，包括局域网(LAN)、广域网络(WAN)因特网、内联网和外联网；电子器具例如个人数字助理(PDA)、手机、寻呼机(pager)等；以及局域和分布式处理系统。
[0416]如本文中所使用的，“记录”是指在电子设备可读介质上存储或编码信息的过程。本领域技术人员可容易地采用任何用于在介质上记录信息的方法来产生包含本文中所述的标志物的材料。
[0417]许多软件程序和格式可用于在电子设备可读介质上存储本发明的标志物信息。为了获得或产生在其上记录了标志物的介质，可使用许多数据处理程序构建格式(dataprocessor structuring format)(例如，文本文件或数据库)。通过以可读形式提供标志物，可常规存取用于多种目的的标志物序列信息。例如，本领域技术人员可使用可读形式的核苷酸或氨基酸序列来将靶序列或靶结构基序与存储在数据存储工具中的序列相比较。搜索工具用于鉴定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或区域。
[0418]因此，本文中还提供了用于保存进行确定受试者是否具有癌症相关疾病或对癌症相关疾病的易感性的方法的说明书的介质，其中所述方法包括步骤:确定标志物的存在或不存在，并且基于标志物的存在或不存 在来确定受试者是否具有癌症相关疾病或对癌症相关疾病的易感性，和/或推荐用于癌症相关疾病或癌症相关疾病前状况(pre-cancer-related disease condit1n)的特定治疗。
[0419]本文中还提供了电子系统和/或在网络中提供了用于确定受试者是否患有癌症相关疾病或具有对与标志物相关的癌症相关疾病的易感性的方法，其中所述方法包括步骤:确定标志物的存在或不存在，并且基于标志物的存在或不存在来确定受试者是否患有特定病症和/或疾病或具有对此类病症和/或疾病的易感性，和/或推荐用于此类疾病或疾病和/或这样的癌症相关疾病前状况的特定治疗。该方法还可包括接收与受试者相关的表型信息和/或从网络获取与受试者相关的表型信息的步骤。
[0420]本文中还提供了网络，用于确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对与标志物相关的病症和/或疾病的易感性的方法，所述方法包括步骤:接收与标志物相关的信息，接收与受试者相关的表型信息，从网络获取相应于标志物和/或病症和/或疾病的信息，并且基于表型信息、标志物和获取的信息中的一个或多个，确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性。所述方法还包括推荐用于病症和/或疾病或对其的易感性的特定治疗的步骤。
[0421]本文中还提供了用于确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性的商业方法，所述方法包括步骤:接收与标志物相关的信息，接收与受试者相关的表型信息，从网络获取相应于标志物和/或病症和/或疾病的信息，并且基于表型信息、标志物和获得的信息中的一个或多个，确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性。所述方法还可包括推荐用于其的特定治疗的步骤。
[0422]本文中还提供了可用于测定阵列中一个或多个基因的表达的阵列。在一个实施方案中，阵列可用于测定组织中基因的表达，从而确定阵列中基因的组织特异性。这样，可就表达同时测定直至大约7000或更多个基因。这使得能够产生显示在一个或多个组织中特异性表达的一组基因的特征谱。
[0423]除了此类定性测定外，本文中还提供了基因表达的定量。因此，不仅组织特异性而且一组基因在组织中的表达水平也是可确定的。因此，可基于基因本身的组织表达和在该组织中的表达水平来对基因进行分类。这可用于例如确定组织间基因表达的关系。因此，可干扰一个组织，然后可测定对第二组织中的基因表达的影响。在本说明书中，可测定一种细胞类型对另一种细胞类型(响应生物刺激)的影响。
[0424]此类测定可用于例如在基因表达的水平上了解细胞间相互作用的效果。如果试剂被治疗性施用以治疗一种细胞类型但其对另一种细胞类型具有不期望的作用，则所述方法提供了确定不期望的作用的分子基础的测定，从而提供共施用中和剂(counteractingagent)或另外治疗不期望的作用的机会。类似地，即使在单个细胞类型中，可在分子水平上测定不期望的生物学效应。因此，可确定和中和试剂对非靶基因的表达的作用。
[0425]在另一个实施方案中，阵列可用于监控阵列中一个或多个基因的表达的时程。如本文中所公开的，这可发生在各种生物学背景(例如病症和/或疾病的发生，其进展)和过程(例如与其相关的细胞转化)中。
[0426]阵列还可用于确定基因的表达或其他基因的表达在相同细胞或不同细胞中的作用。如果不能调控最终或下游靶，那么这提供了例如用于治疗性干预的备选分子靶的选择。
[0427]阵列还可用于确定一个或多个基因在正常和异常细胞中的差异表达模式。这提供了可用作诊断或治疗性干预的分子靶的一组基因。 [0428]替代标志物(SurrogateMarker )
[0429]标志物可用作一种或多种病症或疾病状态或导致其的状况的替代标志物。如本文中所使用的，“替代标志物”是与疾病或病症的不存在或存在，或与疾病或病症的进展相关的目的生物化学标志物。此类标志物的存在或量不依赖于疾病。因此，此类标志物可用于指示特定的疗程在减轻疾病状态或病症中是否有效。当疾病状态或病症的存在或程度难以通过标准方法来评估，或当在达到潜在危险的临床终点之前期望评估疾病进展时，替代标志物是特别有用的。
[0430]标志物还可用作药效标志物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的药效标志物”是与药物作用特异性相关的目的生物化学标志物。药效标志物的存在或量与将对其施用药物的疾病状态或病症无关；因此，标志物的存在或量表示药物在受试者中的存在或活性。例如，药效标志物可表示药物在生物组织中的浓度，因为标志物在该组织中表达或转录，或者不表达或转录与药物的水平相关。这样，药物的分布或吸收可通过药效标志物来监控。类似地，药效标志物的存在或量可与药物的代谢产物的存在或量相关，这样标志物的存在或量表示药物在体内的相对分解速率。
[0431]药效标志物在增加药物作用的检测的灵敏性中特别有用，特别是当以低剂量施用药物时。由于即使少量的药物也可足以激活多轮的标志物转录或表达，因此扩增的标志物可以以比药物本身更容易检测的量存在。同样，标志物由于其本身的性质而可以更容易地进行检测；例如，通过使用本文中描述的方法，可将抗体用于针对蛋白标志物的基于免疫的检测系统，或可使用标志物特异性放射性标记探针来检测mRNA标志物。此外，药效标志物的使用可提供由于药物治疗超出可直接观察的范围而产生的风险的基于机制的预测。
[0432]用于检测的方案
[0433]检测病症和/或疾病的方法可包括例如在一段时间内测量各标志物基因在来自受试者的生物学样品中的表达水平和将该水平与对照生物学样品中标志物基因的水平相比较。
[0434]当标志物基因是本文中描述的基因之一并且表达水平差异表达(例如，比对照中的表达水平更高或更低)时，受试者被判断为患有病症和/或疾病。当标志物基因的表达水平落在容许的范围内时，受试者不可能患有所述病症和/或疾病。
[0435]可通过测量对照中标志物基因的表达水平来预先测定对照的标准值，以比较表达水平。例如，可基于上述标志物基因在对照中的表达水平来测定标准值。例如，在某些实施方案中，容许的范围基于标准值采用±2S.D.。在测定标准值后，可通过只测量来自受试者的生物学样品中的表达水平并将该值与测定的对照的标准值相比较来进行检测方法。
[0436]标志物基因的表达水平包括标志物基因至mRNA的转录和至蛋白质的翻译。因此，基于相应于标志物基因的mRNA的表达强度或由标志物基因编码的蛋白质的表达水平的比较，进行检测病症和/或疾病的一个方法。
[0437]可根据各种基因分析方法在病症和/或疾病的检测中测量标志物基因的表达水平。具体地，可使用例如利用与此类基因杂交的核酸作为探针的杂交技术，或利用与标志物基因杂交的DNA作为引物的基因扩增技术。
[0438]可基于标志物基因的核苷酸序列设计用于检测的探针或引物。本文中描述了各标志物基因的核苷酸序列的标识号。
[0439]此外，应理解，高等动物的基因通常伴有高频率的多态性。也存在许多在剪接过程中产生含有相互不同的氨基酸序列的同种型的分子。与癌症相关疾病相关的、具有与标志物基因的活性相似的活性的任何基因包括在标志物基因中，即使其由于多态性或为同种型而具有核苷酸序列差异。
[0440]也应理解，标志物基因可包括除了人外的其他物种的同源物。因此，除非明确指出，否则表述“标志物基因”是指对于物种独特的标志物基因的同源物或已被导入个体的外源标志物基因。
[0441]同样，应理解，“标志物基因的同源物”是指来源于除了人以外的物种的基因，其在严格条件下可作为探针与人标志物基因杂交。这样的严格条件对于本领域技术人员(其可通过实验或凭经验选择适当的条件来产生相同严格性)来说是已知的。
[0442]含有标志物基因的核苷酸序列或与标志物基因的核苷酸序列的互补链互补并且具有至少15个核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探针。因此，“互补链”是指由A:T (对于RNA为U)和G:C碱基对组成的双链DNA中相对于另一条链的一条链。
[0443]此外，“互补”不仅意指与至少15个连续核苷酸的区域完全互补的序列，而且还指具有在某些情况下至少40%，在某些情况下50%，在某些情况下60%，在某些情况下70%，在某些情况下80%、在某些情况下90%和在某些情况下95%或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之间的同源性的程度可利用算法BLAST等来测定。
[0444]此类多核苷酸可用作检测标志物基因的探针，或用作扩增标志物基因的引物。当用作引物时，多核苷酸通常包含15bp至lOObp，在某些实施方案中15bp至35bp的核苷酸。当用作探针时，DNA包含标志物基因的整个核苷酸序列(或其互补链)，或具有至少15bp核苷酸的其部分序列。当用作引物时，3’区域必须与标志物基因互补，而5’区域可连接至限制性内切酶识别序列或标签(tag)。
[0445]“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此类多核苷酸可以是合成的或天然发生的。同样，通常也标记用作杂交探针的DNA。本领域技术人员易于理解此类标记方法。在本文中，术语“寡核苷酸”意指具有相对低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸内。
[0446]可使用例如Northern杂交、斑点印迹杂交或DNA微阵列技术进行利用杂交技术的病症和/或疾病的检测。此外，可使用基因扩增技术例如RT-PCR法。通过在RT-PCR的基因扩增步骤中使用PCR扩增监控法，可更加定量地分析标志物基因的表达。
[0447]在PCR基因扩增监控法中，将检测靶(DNA或RNA的反转录物)与用荧光染料和吸收荧光的猝灭剂标记的探针杂交。当PCR进行并且Taq聚合酶以其5’-3’外切核酸酶活性降解探针时，荧光染料与猝灭剂彼此分离，从而检测到荧光。实时检测荧光。通过同时测量其中靶的拷贝数是已知的标准样品，可利用循环数(其中PCR扩增是线性的)测定受试者样品中靶的拷贝数。同样，本领域技术人员公认PCR扩增监控法可使用任何适当的方法来进行。
[0448]还可通过检测标志物基因编码的蛋白质来进行检测癌症相关疾病的方法。在下文中，标志物基因编码的蛋白质被描述为“标志物蛋白”。对于此类检测方法，可通过使用结合各标志物蛋白的抗体来应用例如，Western印迹法、免疫沉淀法和ELISA法。
[0449]用于检测的结合标志物蛋白的抗体可通过任何适当的技术来产生。同样，为了检测标志物蛋白，可适当 地标记这样的抗体。备选地，可不标记抗体，而是标记特异性结合抗体的物质例如蛋白A或蛋白G以间接检测标志物蛋白。更特别地，此类检测方法可包括ELISA 法。
[0450]可以例如通过将标志物基因或其部分插入表达载体，将构建体导入适当的宿主细胞来产生转化株，培养所述转化株以表达重组蛋白，然后从培养物或培养上清液纯化表达的重组蛋白来获得用作抗原的蛋白质或其部分肽。备选地，可化学合成由基因编码的氨基酸序列或含有由全长cDNA编码的氨基酸序列的一部分的寡肽，以用作免疫原。
[0451]此外，可通过将不仅生物学样品中标志物基因的表达水平而且标志物蛋白的活性用作指标来进行癌症相关疾病的检测。标志物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物学活性。可使用各种方法测量每一种蛋白的活性。
[0452]即使在常规检测中受试者未被诊断为患有病症和/或疾病(尽管症状暗示此类疾病)，这样的受试者是否患有病症和/或疾病也可通过按照本文中所述的方法进行检测来容易地确定。
[0453]更特别地，在某些实施方案中，当标志物基因是本文描述的基因之一时，其症状至少暗示对病症和/或疾病的易感性的受试者中，标志物基因的表达水平的增加或减少表明症状主要由所述病症和/或疾病引起。
[0454]此外，检测可用于确定病症和/或疾病是否在受试者中得到改善。换句话说，本文中描述的方法可用于判断用于所述病症和/或疾病的治疗的治疗效果。此外，当标志物基因是本文描述的基因之一时，已被诊断为患有所述病症和/或疾病的受试者中，标志物基因的表达水平的增加或减少意味着疾病已向前发展。[0455]还可基于表达水平的差异测定病症和/或疾病的严重度和/或对其的易感性。例如，当标志物基因是本文描述的基因之一时，标志物基因的表达水平的增加程度与病症和/或疾病的存在和/或严重度相关。
[0456]动物模型
[0457]还可产生病症和/或疾病的动物模型，其中一个或多个标志物基因或功能上与标志物基因等同的基因的表达水平在所述动物模型中已被提高。如本文中所用的，“功能上等同的基因”通常是编码具有与标志物基因编码的蛋白质的已知活性相似的活性的蛋白质的基因。功能上等同的基因的代表性实例包括受试动物的标志物基因对应物，其是动物本身固有的。
[0458]动物模型可用于检测由于病症和/或疾病而引起的生理学变化。在某些实施方案中，动物模型可用于揭示标志物基因的另外的功能和评估其靶为标志物基因的药物。
[0459]动物模型可通过控制对应物基因的表达水平或施用对应物基因来产生。方法可包括通过控制选自本文中所述的基因的基因的表达水平来产生动物模型。在另一个实施方案中，方法可包括通过施用由本文中所描述的基因编码的蛋白质或施用抗所述蛋白的抗体来产生动物模型。还应理解，在某些其他实施方案中，可过表达标志物，以便可使用适当的方法测量标志物。在另一个实施方案中，动物模型可通过导入选自此类基因的基因，或通过施用由这样的基因编码的蛋白质来产生。在另一个实施方案中，病症和/或疾病可通过抑制选自此类基因的基因的表达或由这样的基因编码的蛋白质的活性来诱导。反义核酸、核酶或RNAi可用于抑制 表达。蛋白质的活性可通过施用抑制所述活性的物质例如抗体来有效地控制。
[0460]动物模型可用于阐明病症和/或疾病背后的机制，还可用于检测通过筛选获得的化合物的安全性。例如，当动物模型产生特定病症和/或疾病的症状时，或当牵涉某种病症和/或疾病的测量值在动物中改变时，可构建筛选系统以探测具有减轻疾病的活性的化合物。
[0461]如本文中所使用的，表述“表达水平的增加”是指下列情况的任一种:人工表达作为外源基因导入的标志物基因；受试动物本身固有的标志物基因的转录和其至蛋白质的翻译得到增强；或作为翻译产物的蛋白质的水解被抑制。
[0462]如本文中所用的，表述“表达水平的减少”是指其中受试动物的标志物基因的转录和其至蛋白质的翻译被抑制的情况，或其中作为翻译产物的蛋白质的水解被增强的情况。基因的表达水平可以例如通过DNA芯片上信号强度的差异来测定。此外，翻译产物(蛋白质)的活性可通过与正常情况中的活性相比较来测定。
[0463]也在预期的范围内的是:动物模型可包括转基因动物，包括例如其中已人工导入并且表达标志物基因的动物；标志物基因敲除动物；和其中已用另一个基因置换标志物基因的基因敲入动物。已向其中导入了标志物基因的反义核酸、核酶、具有RNAi作用的多核苷酸或用作诱饵核酸的DNA等的转基因动物可用作转基因动物。此类转基因动物还包括例如这样的动物，在所述动物中标志物蛋白的活性已通过将突变导入基因的编码区而得到增强或抑制，或氨基酸序列已被修饰而变得抗水解或对水解敏感。氨基酸序列中的突变包括置换、缺失、插入和添加。
[0464]表达的实例[0465]此外，标志物基因本身的表达可通过向基因的转录调控区导入突变来控制。本领域技术人员理解此类氨基酸置换。同样，被突变的氨基酸的数目不受特别限制，只要活性得到保持即可。通常，其在50个氨基酸以内，在某些非限定性实施方案中，在30个氨基酸以内，在10个氨基酸以内，或在3个氨基酸以内。突变的位点可以是任何位点，只要活性得到保持即可。
[0466]在另一个方面，本文中提供了治疗特定病症和/或疾病的治疗剂的候选化合物的筛选方法。一个或多个标志物基因选自本文中描述的基因。可通过选择能够增加或减少标志物基因的表达水平的化合物来获得癌症相关疾病的治疗剂。
[0467]应理解，表述“增加基因的表达水平的化合物”是指促进基因转录、基因翻译或蛋白质活性的表达的步骤中的任一步骤的化合物。另一方面，表述“减少基因的表达水平的化合物”，如本文中所用的，是指抑制这些步骤中的任一步骤的化合物。
[0468]在特定的方面，可在体内或体外进行筛选用于病症和/或疾病的治疗剂的方法。该筛选方法可以例如通过下列步骤来进行:
[0469]I)对动物受试者施用候选化合物；
[0470]2)测量动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平；或
[0471]3)选择与对照(其未与候选化合物接触)中标志物基因的表达水平相比较增加或减少标志物基因的表达水平的化合物。
[0472]在另一个方面，本文中提供了这样的方法，其通过将动物受试者与候选化合物接触，然后监控化合物对来源于动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平的作用来评估药剂的候选化合物对标志物基因的表达水平的功效。来源于动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平的变化可使用与上述检测方法中所用的相同的技术来监控。此外，基于评估，可通过筛选来选择药剂的候选化合物。
[0473]本文中所引用的所有专利、专利申请和参考文献以其全文通过引用合并入本文。虽然对于制备和使用其的本领域技术人员来说已十分详尽地描述和例示了本发明，但各种改变、修饰和改进是显然的，且不背离本发明的精神和范围。本领域技术人员易于理解，本发明可进行适当地改变以适合于实现目的和获得提及的目标和有利方面以及其中固有的那些。
[0474]某些核喊基(Nucleobase)序列
[0475]本文中描述的成熟miRNA和它们的相应的茎-环序列的核碱基序列是见于miRBase (见于http://microrna.sanger.ac.uk/的miRNA序列和注释的在线可搜索数据库)中的序列。miRBase序列数据库中的条目(entry)代表预测的miRNA转录物的发夹部分(茎-环)和关于成熟miRNA序列的定位和序列的信息。数据库中miRNA的茎-环序列严格说来不是前体miRNA (pre-miRNA),并且在一些情况下可包括pre_miRNA和来自假定的初级转录物的一些侧翼序列。本文中描述的miRNA核碱基序列包括miRNA的任何形式，包括miRBase序列数据库的Releasel0.0中描述的序列和miRBase序列数据库的任何更早的Release中描述的序列。序列数据库释放可导致某些miRNA的重新命名。序列数据库释放可导致成熟miRNA序列的变化。可包括此类修饰的寡核苷酸的化合物可与本文中描述的miRNA的任何核碱基序列形式互补。
[0476] 应理解，本文中所示的任何核碱基序列不依赖于对糖部分、核苷间连接或核碱基的任何修饰。还应理解，包含U的核碱基序列也包括其中在一个或多个具有‘U’的位点上‘U’被‘T’置换的相同核碱基序列。反过来，应理解，包含T的核碱基序列也包括其中在一个或多个具有‘T’的位点上‘T’被‘U’置换的相同核碱基序列。
[0477]在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核碱基序列，这意味着修饰的寡核苷酸的核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或更多个核碱基的区域中与 miRNA 或其前体的互补序列至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99%同一，或两个序列在严格杂交条件下杂交。因此，在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列相对于其靶miRNA或靶miRNA前体序列可具有一个或多个错配的碱基对，并且能够与其靶序列杂交。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有与miRNA或其前体100%互补的核碱基序列。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列具有对miRNA的全长互补性。
[0478]miRNA (miR)疗法
[0479]在一些实施方案中，本发明提供了抑制受试者的一个或多个基因的表达的微RNA。微RNA表达特征谱可用作新型癌症生物标志物。
[0480]本文中包括使用一个或多个MiR抑制基因表达和/或活性的方法。在一些实施方案中，miR抑制蛋白质的表达。在其他实施方案中，miRNA抑制基因活性(例如，细胞侵袭活性)。
[0481]可通过本领域技术人员熟知的许多种技术从细胞或组织分离，重组产生或体外合成miRNA。在一个实施方案中，从细胞或组织分离miRNA。用于从细胞或组织分离miRNA的技术对于本领域技术人员来说是熟知的。例如，可使用来自Amb1n, Inc.的mirVanamiRNA分离试剂盒从总RNA分离miRNA。另一种技术利用flashlPAGE? Fract1natorSystem (Amb1n, Inc.)来进行小核酸的PAGE纯化。
[0482]关于miRNA治疗剂的使用，本领域技术人员理解，体内施用的核酸被吸收和分配至细胞和组织。
[0483]可以以合适的方式递送核酸，所述方式使得能够组织特异性地吸收试剂和/或核酸递送系统。本文中描述的试剂可通过任何已知的常规疗法来补充治疗状况，所述疗法包括但不限于抗体施用、疫苗施用、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物和生物应答调节剂的施用。可一起或相继使用两个或多个组合的化合物。
[0484]本发明的某些实施方案提供了包含(a) —种或多种核酸或小分子化合物以及(b)一种或多种其他化学治疗剂的药物组合物。
[0485]另外的有用的定义
[0486]“受试者”是指经选择接受治疗或疗法的人或非人动物。“怀疑患有……的受试者”是指展示病症、疾病或病况的一个或多个临床指标的受试者。
[0487]“预防”或“防止”是指延迟或阻止病况或疾病的发作、发展或进展，持续一段时间，包括数周、数月或数年。“治疗”或“医治”是指一种或多种用于治愈或改善病症和/或疾病的特定方法的应用。在某些实施方案中，特定方法是一种或多种药剂的施用。
[0488]“改善”是指减轻病况或疾病的至少一个指标的严重度。在某些实施方案中，改善包括病况或疾病的一个或多个指标的进展的延迟或减缓。指标的严重度可通过对于本领域技术人员来说是已知的主观或客观量度来测定。
[0489]“有此需要的受试者”是指确定为需要治疗或疗法的受试者。
[0490]“施用”是指给受试者提供药剂或组合物，包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。
[0491]“胃肠外施用”是指通过注射或输注进行的施用。胃肠外施用包括但不限于皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用和颅内施用。“皮下施用”是指紧在皮肤下方施用。
[0492]“改善功能”是指使功能向正常参数改变。在某些实施方案中，通过测量在受试者的体液中发现的分子评估功能。“药物组合物”是指适合于给个体施用的物质的混合物，其包括药剂。例如，药物组合物可包含修饰的寡核苷酸和无菌水性溶液。
[0493]“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”和“核酸靶”都是指能够被反义化合物靶向的核酸。“靶向”是指与靶核酸杂交并且诱导期望的作用的核碱基序列的设计和选择的过程。“被靶向”是指具有核碱基序列，所述序列允许与靶核酸杂交以诱导期望的作用。在某些实施方案中，期望的作用是靶核酸的减少。
[0494]“调控”是指对功能或活性的干扰。在某些实施方案中，调控是指基因表达的增加。在某些实施方案中，调控是指基因表达的减少。
[0495]“表达”是指藉以将基因的编码信息转变成存在于细胞中和在细胞中运转的结构的任何功能和步骤。
[0496]“区域”是指核酸内一部分连接的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有与靶核酸的区域互补的核碱基序列。例如，在某些此类实施方案中，修饰的寡核苷酸与miRNA茎-环序列的区域 互补。在某些此类实施方案中，修饰的寡核苷酸与miRNA序列的区域100%同一。
[0497]“区段”是指更小的区域或区域的亚部分。
[0498]“核碱基序列”是指以5’至3’方向，不依赖于任何糖、连接和/或核碱基修饰的连续核喊基的顺序。
[0499]“连续核碱基”是指核酸中彼此紧密相邻的核碱基。
[0500]“核碱基互补性”是指两个核碱基通过氢键非共价配对的能力。“互补”是指第一核碱基序列在 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域内与第二核碱基序列的互补序列至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 同一，或 100% 同一，或两个序列在严格杂交条件下杂交。在某些实施方案中，具有与miRNA或其前体100%互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸可以在修饰的寡核苷酸的整个长度上不与miRNA或其前体100%互补。
[0501]“互补性”是指第一核酸与第二核酸之间的核碱基配对能力。“全长互补性”是指第一核酸的各核碱基能够与第二核酸中相应的位点上的各核碱基配对。例如，在某些实施方案中，其中各核碱基与miRNA中的核碱基具有互补性的修饰的寡核苷酸与miRNA具有全长互补性。
[0502]“百分比互补性”是指核酸中互补核碱基的数目除以核酸的长度。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的百分比互补性是指与靶核酸互补的核碱基的数目除以修饰的寡核苷酸的核碱基数目。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的百分比互补性是指与miRNA互补的核碱基的数目除以修饰的寡核苷酸的核碱基的数目。
[0503]“百分比结合的区域”是指与寡核苷酸区域互补的区域的百分比。通过将与寡核苷酸互补的靶区域的核碱基的数目除以靶区域的长度来计算百分比结合的区域。在某些实施方案中，百分比结合的区域是至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%。
[0504]“百分比同一性”是指第一核酸中与第二核酸相应的位点上的核碱基相同的核碱基的数目除以第一核酸中的核碱基的总数。
[0505]本文中使用的“大体上同一的”可以指第一与第二核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90,95,100 或更多个核碱基的区域上至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或99% 同一，或 100% 同一。
[0506]“杂交”是指通过核碱基的互补性发生的互补核酸的退火。
[0507]“错配”是指不能够与第二核酸的相应的位点上的核碱基配对的第一核酸的核碱
基。
[0508]“非互补核碱基”是指不能够通过氢键配对的两个核碱基。
[0509]“同一的”是指具有相同核碱基序列。
[0510]“miRNA”或“miR”是指长度在18至25个核碱基之间的非编码RNA，其与编码RNA杂交并且调控编码RNA的表达。在某些实施方案中，miRNA是Dicer切割pre-miRNA的产物。miRNA 的实例见于称为 miRBase 的 miRNA 数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)。
[0511]“Pre-miRNA”或〃pre_miR”是指具有发夹结构的非编码RNA，其包含miRNA。在某些实施方案中，pre-miRNA是称为Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶切割pri_miR的产物。
[0512]“茎-环序列”是指具有发夹结构并且包含成熟miRNA序列的RNA。Pre-miRNA序列和莖-环序列可重叠。莖-环序列的实例可见于称为miRBase的miRNA数据库(microrna.sanger.ac.uk/)。
[0513]“miRNA前体”是指源自基因组DNA并且包含含有一个或多个miRNA序列的非编码性结构化RNA的转录物。例如，在某些实施方案中，miRNA前体是pre-miRNA。在某些实施方案中，miRNA前体是pr1-miRNA。
[0514]“反义化合物”是指具有允许与靶核酸杂交的核碱基序列的化合物。在某些实施方案中，反义化合物是具有与靶核酸互补的核碱基序列的寡核苷酸。
[0515]“寡核苷酸”是指连接的核苷的聚合物，各核苷可以彼此独立地被修饰或不被修饰。“天然发生的核苷间连接”是指核苷之间的3’至5’磷酸二酯连接。“天然核碱基”是指相对于其天然发生的形式未被修饰的核碱基。“miR拮抗剂”是指经设计用于干扰或抑制miRNA的活性的试剂。在某些实施方案中，miR拮抗剂包括靶向miRNA的反义化合物。在某些实施方案中，miR拮抗剂包括具有与miRNA或其前体的核碱基序列互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，miR拮抗剂包括干扰或抑制miRNA的活性的小分子
坐寸ο
[0516]本文中所描述的方法和试剂代表优选实施方案，是示例性的，并且不意欲限制本发明的范围。其中的改进和其他用途对于本领域技术人员来说显然的。这些改进包括在本发明的精神内并且由权利要求的范围界定。对于本领域技术人员来说，同样极显然的是可对本文中公开的发明进行各种替代和改进而不背离本发明的范围和精神。
[0517]应理解，虽然本发明已通过优选实施方案和任选特征明确地公开，但本领域技术人员可采用本文中公开的概念的改进和变化，并且此类改进和变化被认为在由所附权利要求界定的本发明的范围内。
[0518]虽然通过参考各种和优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，可进行各种变化并且可用等同物替代其元素而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改进以使特定的情况或材料适合于本发明的教导而不背离本发明的基本范围。
[0519]本申请涉及下述实施方案:
[0520]1.一种方法，所述方法诊断受试者是否患有前列腺相关病症或处于发生前列腺相关病症的风险中，确定患有前列腺相关病症的受试者的预后和/或治疗患有前列腺相关病症的受试者的前列腺相关病症，所述方法包括
[0521]测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平，
[0522]其中相对于对照样品中相应的生物标志物的水平，测试样品中生物标志物的水平的改变表示受试者患有所述病症或处于发生所述病症的风险中。
[0523]2.项目I的方法，其中测试样品中所述至少一个生物标志物的水平低于对照样品中相应的生物标志物的水平。
[0524]3.项目I的方 法，其中测试样品中所述至少一个生物标志物的水平高于对照样品中相应的生物标志物的水平。
[0525]4.项目I的方法，其中所述至少一个生物标志物在肿瘤组织和非肿瘤组织之间差异表达，并且是图11-表2中所列的一种或多种miR或其功能性变体。
[0526]5.项目4的方法，其中所述至少一个生物标志物选自图11-表2中所列的在前列腺肿瘤中上调的一种或多种miR或其功能性变体:miR-32，miR-182，miR-31，miR-26a-l/2，miR-200c, miR-375, miR-196a_l/2， miR-370, miR-425, miR-194-1/2， miR-181a_l/2，miR-34b, let_7i，miR-188, miR-25, miR_106b，miR-449, miR_99b，miR-93, miR-92-1/2，miR-125a。
[0527]6.项目4的方法，其中所述至少一个生物标志物选自图11-表2中所列的在前列腺肿瘤中下调的一种或多种miR或其功能性变体:miR-520h、miR-494、miR-490、miR-133a_l、miR-1-2、miR-218-2、miR-220、miR_128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR_34a、miR-487、let-7bo
[0528]7.项目I的方法，其中所述至少一个生物标志物与前列腺外疾病相关，并且选自图12-表3中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR-101-l/2、miR-200a、miR-200b、miR-196a-l/2、miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186、miR-195、let_7f_2、miR_34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。
[0529]8.项目I的方法，其中至少一个生物标志物显示前列腺肿瘤中miR-Ι与靶基因转录物水平之间的负相关，并且选自图13A-表4A中所列的一个或多个基因或其功能性变体。
[0530]9.项目I的方法，其中所述至少一个生物标志物选自图13B-表4B中所列的一个或多个 miR 或其功能性变体:miR-l、miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、miR_181a、miR-182、miR-194、miR-196a、miR-200c、miR-218-2、miR-220、miR-329、miR-338、miR_369、miR-409-3p、miR-410、miR-448、miR-490、miR-494、miR-499、miR_520h 和 let_7i。
[0531]10.项目I的方法，其中所述至少一个生物标志物选自图13B-表4B中所列的一个或多个 miR 或其功能性变体:miR-32、miR-282-2、miR490 和 miR_520h。
[0532]11.项目I的方法，其包括在前列腺肿瘤中显示与miR_181a的负相关的探针组，其中所述探针组包括图14-表5中所列的一个或多个基因或其功能性变体。
[0533]12.项目I的方法，其中所述至少一个生物标志物是雄激素应答性生物标志物，并且选自图15-表6中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR-338、miR-126_5p、mir-181b-l 簇、miR181c 簇、miR-219_5p 和 miR221 簇。
[0534]13.项目I的方法，其中所述至少一个生物标志物是图16-表7中所列的一个或多个雄激素受体结合位点。
[0535]14.项目I的方法，其中所述至少一个生物标志物选自图23-表9中所列的在前列腺癌中在具有神经周浸润的肿瘤中上调的一个或多个miR或其功能性变体:miR-224、miR-21、miR-10 (a/b)、miR_125b (-1/2)、miR-30a/b/c_2/d、miR-100、miR-24(_l/2)、miR-15a-2、miR-191、miR_99b、miR_27a/b、miR_26a(-1/2)、miR-126、miR-145、miR-195、miR-181a_l、miR_199b、miR-151、let_7g。
[0536]15.项目I的方法，其中所述至少一个生物标志 物在PNT肿瘤组织与非PNT肿瘤组织之间差异表达，并且是图24-表10中所列的一个或多个基因或其功能性变体。
[0537]16.项目I的方法，其包括下列中的一个或多个的增加的表达:前列腺肿瘤中的Dicer和DGCR8,和/或具有高Gleason评分的肿瘤中的Dicer和编码argonuate-2的EIF2C2。
[0538]17.项目I的方法，其中所述样品包括血液样品。
[0539]18.项目15的方法，其中所述样品包括血清或血浆血液样品中的一种或多种。
[0540]19.生物标志物，其包含至少一个在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达的生物标志物，并且其是图11-表2中所列的一个或多个miR或其功能性变体。
[0541]20.生物标志物，其包含至少一个选自下列的生物标志物:图11-表2中所列的在前列腺肿瘤中上调的一个或多个miR或其功能性变体:miR-32、miR-182、miR-31、miR-26a-l/2、miR-200c、miR-375、miR-196a_l/2、miR-370、miR-425、miR-194-1/2,miR-181a-l/2、miR_34b、let_71、miR-188、miR-25、miR_106b、miR-449、miR_99b、miR-93、miR-92-1/2、miR_125a。
[0542]21.生物标志物，其包含至少一个选自下列的生物标志物:图11-表2中所列的在前列腺肿瘤中下调的一个或多个miR或其功能性变体:miR-520h、miR-494、miR-490、miR-133a_l、miR-1-2、miR-218-2, miR-220、miR_128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR_34a、miR-487、let-7bo
[0543]22.生物标志物，其包含至少一个与前列腺外疾病相关并且选自下列的生物标志物:图12-表3中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR-101-1/2、miR-200a、miR-200b、miR-196a_l/2、miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186、miR-195、let_7f_2、miR-34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。[0544]23.生物标志物，其包含至少一个显示miR-Ι与前列腺肿瘤中靶基因转录物水平之间的负相关并且选自下列的生物标志物:图13A-表4A中所列的一个或多个基因或其功能性变体。
[0545]24.生物标志物，其选自图13B-表4B中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR_l、miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、miR_181a、miR-182、miR-194、miR_196a、miR_200c、miR-218-2、miR-220、miR-329、miR-338、miR-369、miR-409_3p、miR-410、miR-448、miR-490、miR-494、miR-499、miR_520h 和 let_7i。
[0546]25.生物标志物，其选自图13B-表4B中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR-32、miR-282-2、miR490 和 miR_520h。
[0547]26.生物标志物，其包含在前列腺肿瘤中显示与miR_181a的负相关的探针组，其中所述探针组包括图14-表5中所列的一个或多个基因或其功能性变体。
[0548]27.生物标志物，其包含至少一个为雄激素应答性生物标志物并且选自下列的生物标志物:图15-表6中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR-338、miR-126_5p、mir-181b-l 簇、miR181c 簇、miR-219_5p 和 miR221 簇。
[0549]28.生物标志物，其包含图16-表7中所列的一个或多个雄激素受体结合位点或其功能性变体。
[0550]29.生物标志物，其包含至少一个选自下列的生物标志物:图23-表9中所列的在前列腺癌中在具有神经周浸润的肿瘤中上调的一个或多个miR或其功能性变体:miR-224、miR-21、miR-10 (a/b)、miR_125b (-1/2)、miR-30a/b/c_2/d、miR-100、miR-24(_l/2)、miR-15a-2、miR-191、miR_99b、miR_27a/b、miR_26a(-1/2)、miR-126、miR-145、miR-195、miR-181a_l、miR_199b、miR-151、let_7g。
[0551] 30.生物标志物，其包含至少一个在PNT肿瘤组织与非PNT肿瘤组织之间差异表达的生物标志物，并且其是图24-表10中所列的一个或多个基因或其功能性变体。
[0552]31.生物标志物，其包括下列中的一个或多个的增加的表达:前列腺肿瘤中的Dicer和DGCR8,和/或具有高Gleason评分的肿瘤中的Dicer和编码argonuate-2的EIF2C2。
[0553]32.前列腺肿瘤中独特的微RNA表达特征，其包括一个或多个调控肿瘤微RNA加工的生物标志物的表达的改变。
[0554]33.影响前列腺中靶mRNA的转录物丰度和/或蛋白质表达的方法，其包括使有此需要的受试者中一个或多个微RNA失调。
[0555]34.前述项目的方法，其包括抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
[0556]35.前述项目的方法，其包括改变miR-32和miR_106b中的一个或多个的表达以抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
[0557]36.微RNA和编码蛋白质的RNA的大规模基因表达特征谱分析的用途，其用于鉴定人前列腺肿瘤中发生的微RNA功能的改变。
[0558]37.前列腺相关病症的肿瘤基因特征，其包括:下列中的一个或多个:上调的miR-32，其次 miR-182、miR-31、miR_26a、miR_200c、miR_196a ;和 miR-106b_25 簇；和 / 或显著下调的miR-520h、miR-494、miR-490和miR-l_133a簇中的一个或多个。
[0559]38.以低误差边际与前列腺外疾病扩展相关的肿瘤特征，其包括miR-101。[0560]39.项目I的方法，其中所述生物标志物包括在前列腺肿瘤中增加的前列腺肿瘤中的宿主基因表达。
[0561]40.前述项目的方法，其中所述生物标志物包括下列中的一个或多个:其表达分别与内含子微RNA，miR-32和miR-106b_25簇的表达相关的上调的C9orf5和MCM7。
[0562]41.miR-106b的用途，其作为前列腺癌细胞中E2F1和/或⑶KNlA基因的靶和/或用于抑制E2F1和/或⑶KNlA基因的蛋白质表达。
[0563]42.通过改变前列腺癌细胞中miR-Ι的表达进行的XP06和PTK9中的一个或多个
的调控。
[0564]43.微RNA与3’ UTR序列的结合的用途，其用于导致哺乳动物细胞中靶mRNA的降解和/或积累。
[0565]44.人组织中微RNA与mRNA之间的负相关和/或正相关的用途，其用于预测微RNA的靶基因。
[0566]45.用于鉴定受微RNA调控的mRNA的方法，其包括进行人组织中的微RNA和mRNA的表达的关联分 析。
[0567]46.miR表达反义抑制剂，其包括miR-32和miR_106b中的一个或多个。
[0568]47.前列腺病症或疾病的oncomiR生物标志物，其包括下列中的一个或多个:miR-Ι、miR-32 和 mir-106b-25 簇。
[0569]48.用于调控前列腺癌细胞中的蛋白质表达的方法，其包括在前列腺癌细胞中调控miR-Ι、miR-32和mir-106b_25簇中的一个或多个的表达。
[0570]49.用于抑制前列腺癌细胞中输出蛋白-6和PTK9中的一个或多个的表达的组合物，所述组合物包含miR-Ι或其功能性变体。
[0571]50.用于调控有此需要的受试者中E2F1和p21/WAFl中的一个或多个的蛋白水平的方法，其包括使用miR-106b或其功能性变体。
[0572]51.一种组合物，其包含用于增加有此需要的受试者的前列腺癌细胞中P21/WAF1和/或E2F1的蛋白水平的反义miR-106b。
[0573]52.项目I的方法，其包括确定患有前列腺癌的受试者的预后，包括测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平，其中:i)生物标志物与前列腺癌中不利的预后相关；和ii)相对于对照样品中相应的生物标志物的水平，前列腺测试样品中所述至少一个生物标志物的水平的改变表示不利的预后。
[0574]53.项目I的方法，其包括诊断受试者是否患有前列腺癌或处于发生前列腺癌的风险中，所述方法包括:(I)从获自受试者的测试样品逆转录RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；(2)将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和(3)将测试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，其中至少一个miRNA的信号的改变表示受试者患有前列腺癌或处于发生前列腺癌症的风险中。
[0575]54.前述项目的方法，其中相对于从对照样品产生的信号，至少一个miRNA的信号下调，和/或其中相对于从对照样品产生的信号，至少一个miRNA的信号上调。
[0576]55.前述项目的方法，其中选自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的组的至少一个生物标志物的信号的改变表示受试者患有具有不利预后的前列腺癌或处于发生所述癌症的风险中。
[0577]56.治疗患有前列腺癌的受试者的前列腺癌的方法，在所述前列腺癌中至少一个生物标志物在受试者的癌细胞中相对于对照细胞下调或上调，所述方法包括:(I)当所述至少一个生物标志物在癌细胞中下调时，给受试者施用有效量的至少一个分离的生物标志物，或其分离的变体或生物学活性片段，以便受试者中癌细胞的增殖被抑制；或(2)当所述至少一个生物标志物在癌细胞中上调时，给受试者施用有效量的至少一种抑制所述至少一个生物标志物表达的化合物，以便受试者中癌细胞的增殖被抑制。
[0578]57.治疗受试者的前列腺癌的方法，其包括:(I)测定相对于对照细胞，前列腺癌细胞中至少一个生物标志物的量；和(2)通过下列来改变前列腺癌细胞中表达的生物标志物的量:(i)如果癌细胞中表达的生物标志物的量低于对照细胞中表达的生物标志物的量，给受试者施用有效量的至少一个分离的生物标志物；或Qi)如果癌细胞中表达的生物标志物的量高于对照细胞中表达的生物标志物的量，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一个生物标志物表达的化合物。
[0579]58.用于治疗前列腺癌的药物组合物，其包含至少一个分离的生物标志物和可药用载体。
[0580]59.前述项目的药物组合物，其中所述至少一个分离的生物标志物相应于相对于对照细胞在前列腺癌细胞中下调的生物标志物。
[0581]60.前述项目的药物组合物，其包含至少一个miR表达抑制剂化合物和可药用载体。
[0582]61.鉴定抗前列腺癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂和测量与前列腺癌细胞中减少的表达水平相关的至少一个生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的增加表示测试试剂是抗前列腺癌试剂。
[0583]62.鉴定抗前列腺癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂和测量与前列腺癌细胞中增加的表达水平相关的至少一个生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的减少表示测试试剂是抗前列腺癌试剂。
[0584]63.评估疗法预防、诊断和/或治疗前列腺癌相关疾病的有效性的方法，其包括:i)使动物经历其有效性待评估的疗法，和ii)通过评估表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表
7、表9或表10的一个或多个中所列的至少一个生物标志物来测定被测试的疗法在治疗或预防疾病中的有效性的水平。
[0585]64.前述项目的方法，其中候选治疗剂包括:药物组合物、营养组合物和顺势疗法组合物中的一种或多种。
[0586]65.前述项目的方法，其中被评估的疗法用于人受试者。
[0587]66.一种制品,其包含:至少一种结合前列腺癌相关疾病的标志物的捕获试剂，所述标志物包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一个或多个中所列的至少一个生物标志物。
[0588]67.用于筛选治疗前列腺癌相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括:表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一个或多个中所列的至少一个生物标志物的一个或多个试剂，和表达至少一个生物标志物的细胞。
[0589]68.前述项目的试剂盒，其中使用包含特异性结合至少一个生物标志物的抗体或抗体片段的试剂检测生物标志物的存在。
[0590]69.干扰前列腺癌相关疾病应答信号转导途径的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或或限制个体中疾病并发症的严重度，其中所述试剂包含表2、表
3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一个或多个中所列的至少一个生物标志物。
[0591]70.治疗、预防、逆转或限制有此需要的个体的前列腺癌相关疾病并发症的严重度的方法，其包括:给个体施用干扰至少前列腺癌相关疾病应答级联的试剂，其中所述试剂包含表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一个或多个中所列的至少一个生物标志物。
[0592]71.干扰至少前列腺癌相关疾病应答级联的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的前列腺癌相关疾病并发症的严重度，其中所述试剂包含表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一个或多个中所列的至少一个生物标志物。
[0593]72.包含miR-l、miR-32和miR_106b中的一个或多个的反义抑制剂的组合物。
[0594]73.治疗有此需要的受试者中的前列腺病症的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的前述项目的组合物。
[0595]74.前述项目的方法，其中预防性施用所述组合物。
[0596]75.前述项目的 方法，其中所述组合物的施用延迟病症的一个或多个症状的发作。
[0597]76.前述项目的方法，其中肽的施用抑制前列腺癌的发生。
[0598]77.前述项目的方法，其中肽的施用抑制肿瘤生长。
[0599]78.前述项目的方法，其中肽的施用抑制感染。
[0600]79.用于检测生物学样品中前列腺癌的存在的方法，该方法包括:a)将怀疑包含前列腺癌的生物学样品暴露于用于其的标志物；和《如果有的话，检测样品中所述标志物的存在或不存在。
[0601]80.前述项目的方法,其中所述标志物包括可检测的标记。
[0602]81.前述项目的方法，其还包括将来自受试者的生物学样品中标志物的量与来自正常受试者的相应的生物学样品中标志物的量相比较。
[0603]82.前述项目的方法，其还包括在不同时间点从受试者收集多个生物学样品和比较各生物学样品中标志物的量以确定标志物的量在受试者中是随时间增加还是减少。
[0604]83.治疗受试者的前列腺癌的方法，该方法包括:给有此需要的受试者施用治疗有效量的前列腺受体激动剂。
[0605]84.前述项目的方法，其中所述受体激动剂是:miRl、miR-21和miR_106b中的一个或多个的反义抑制剂。
[0606]85.制造用于治疗前列腺癌的药物的用途，所述药物包含选自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中显示的miR、来源于其的序列、此类miR的互补序列和来源于这样的互补序列的序列的核酸分子。
[0607]86.前述项目的用途，其中所述药物包含核酸分子，所述核酸分子提供选自下列的序列:表2中所列的miR、来源于此类miR的序列、此类miR的互补序列和来源于这样的互补序列的序列。
[0608]87.鉴定诱导前列腺癌细胞分化的有效治疗剂或治疗剂的组合的体外方法，该方法包括步骤:i)培养来源于前列腺肿瘤的细胞，ii)向细胞系的培养基中加入至少一种化合物，iii)分析步骤Q)与(ii)之间至少一个miR的表达水平的变化和iv)鉴定诱导步骤Q)与Qi)之间miR的表达水平的变化的化合物或化合物的组合。
[0609]88.前述项目的方法，其中步骤(iii)包括分析至少一个miR的表达水平。
[0610]89.前述项目的方法，其中步骤(iv)包括鉴定调控至少一个miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
[0611]90.前述项目的方法，其中步骤(iv)包括鉴定减少至少一个miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
[0612]91.前述项目的方法，其中所述化合物是治疗癌症的治疗剂。
[0613]92.用于分类受试者的前列腺组织的方法，其包括:
[0614]a)测量测试细胞群体中选自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的组的一个或多个核酸序列的表达，其中所述测试细胞群体中至少一个细胞能够表达选自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的组的一个或多个核酸序列；
[0615]b)将所述核酸序列的表达与参照细胞群体中核酸序列的表达相比较，所述参照细胞群体包含至少一个已知其前列腺癌分类的细胞；和
[0616]c)如果存在， 鉴定测试细胞群体和参照细胞群体中选择的一个或多个核酸序列的表达水平的差异，从而分类受试者的前列腺癌。
[0617]93.项目86的方法，其中与参照细胞群体相比，测试细胞群体中核酸的表达的差异表示测试细胞群体具有与来自参照细胞群体的细胞不同的分类。
[0618]94.项目86的方法，其中与参照细胞群体相比，测试细胞群体中核酸的相似表达模式表示测试细胞群体具有与来自参照细胞群体的细胞相同的分类。
[0619]95.项目86的方法，其中所述参照细胞群体是多个细胞或数据库。
[0620]96.前述项目的方法，其中所述参照细胞群体选自:分类为来自正常前列腺组织的细胞群体的参照细胞群体、分类为来自良性前列腺组织的细胞群体的参照细胞群体和分类为来自恶性前列腺组织的细胞群体的参照细胞群体。
[0621]参考文献
[0622]本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的公开案和其他材料通过引用合并入本文，并且为方便起见提供于下列参考书目中。
[0623]本文中引用的任何文献的引用不意欲作为任何前述内容是相关现有技术的承认。关于日期的所有声明和关于这些文献的内容的所有陈述基于 申请人:可获得的信息，并且不构成关于这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。
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【权利要求】
1.一种方法，所述方法诊断受试者是否患有前列腺相关病症或处于发生前列腺相关病症的风险中，确定患有前列腺相关病症的受试者的预后和/或治疗患有前列腺相关病症的受试者的前列腺相关病症，所述方法包括 测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平， 其中相对于对照样品中相应的生物标志物的水平，测试样品中生物标志物的水平的改变表示受试者患有所述病症或处于发生所述病症的风险中。
2.权利要求1的方法，其中测试样品中所述至少一个生物标志物的水平低于对照样品中相应的生物标志物的水平。
3.权利要求1的方法，其中测试样品中所述至少一个生物标志物的水平高于对照样品中相应的生物标志物的水平。
4.权利要求1的方法，其中所述至少一个生物标志物在肿瘤组织和非肿瘤组织之间差异表达，并且是图11-表2中所列的一种或多种miR或其功能性变体。
5.权利要求4的方法，其中所述至少一个生物标志物选自图11-表2中所列的在前列腺肿瘤中上调的一种或多种HiiR或其功能性变体:miR-32，miR-182，miR-31，miR-26a-l/2，miR-200c, miR-375, miR-196a_l/2， miR-370, miR-425, miR-194-1/2， miR-181a_l/2，miR-34b, let_7i，miR-188, miR-25, miR_106b，miR-449, miR_99b，miR-93, miR-92-1/2，miR-125a。
6.权利要求4的方法，其中所述至少一个生物标志物选自图11-表2中所列的在前列腺肿瘤中下调的一 种或多种miR或其功能性变体:miR-520h、miR-494、miR-490、miR-133a_l、miR-1-2、miR-218-2、miR-220、miR_128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR_34a、miR-487、let-7bo
7.权利要求1的方法，其中所述至少一个生物标志物与前列腺外疾病相关，并且选自图12-表3中所列的一个或多个miR或其功能性变体:miR-101-l/2、miR-200a、miR-200b、miR-196a-l/2、miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186、miR-195、let_7f_2、miR_34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。
8.权利要求1的方法，其中至少一个生物标志物显示前列腺肿瘤中miR-1与靶基因转录物水平之间的负相关，并且选自图13A-表4A中所列的一个或多个基因或其功能性变体。
9.权利要求1的方法，其中所述至少一个生物标志物选自图13B-表4B中所列的一个或多个 miR 或其功能性变体:miR-l、miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、miR_181a、miR-182、miR-194、miR-196a、miR-200c、miR-218-2、miR-220、miR-329、miR-338、miR_369、miR-409-3p、miR-410、miR-448、miR-490、miR-494、miR-499、miR-520h 和 let_7i。
10.权利要求1的方法，其中所述至少一个生物标志物选自图13B-表4B中所列的一个或多个 miR 或其功能性变体:miR-32、miR-282-2, miR490 和 miR_520h。
【文档编号】C12Q1/68GK104031984SQ201410133658
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2009年2月27日 优先权日:2008年2月28日
【发明者】C·M·克罗斯, S·阿姆布斯 申请人:俄亥俄州立大学研究基金会, 由卫生与公众服务部代表的美利坚合众国政府