齐口裂腹鱼cart基因的克隆方法

齐口裂腹鱼cart基因的克隆方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种齐口裂腹鱼CART基因克隆方法，通过齐口裂腹鱼CART基因克隆、测序及表达分析，得到CART基因三个亚型；本发明技术提供了一种高效、方便的获取齐口裂腹鱼CART基因的全长序列的方法，填补了该基因在齐口裂腹鱼上的空白，为进一步研究齐口裂腹鱼的该基因奠定了基础。
【专利说明】齐口裂腹鱼CART基因的克隆方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种齐口裂腹鱼CART基因克隆方法。

【背景技术】
[0002] 随着水生动物营养学研究的不断深入和完善，近年来，鱼类的摄食调控已逐渐成 为营养学的一个研究热点，迄今不同学者分别从营养与动物的生长性能，生理学参数，以及 生化酶和代谢之间的关系等方面做了大量的研究工作，但从分子水平上，尤其是摄食相关 的基因与鱼类能量代谢之间关系的研究仍颇为缺乏。
[0003] 可卡因-苯丙胺调节转录肤（cocaine-andamphetamine-regulatedtranscriptpe ptides，CART)是近年来发现的一种内源性神经肽。前期研究提示，CART广泛分布于中枢神 经系统和外周组织，具有多种生理功能。1998年，CART肽作为脑内源厌食因子被提出，其在 动物摄食平衡调节中的作用受到重视，随后在哺乳动物和人上已进行了大量的研究。然而， CART基因在鱼类上的研究还较为缺乏，目前仅在斑马鱼、金鱼、大西洋鲑鱼等一些少数鱼类 上进行了基因克隆。本发明利用RACE技术快速扩增CART基因，填补了该基因在齐口裂腹 鱼上的空白，为进一步研究该基因在鱼类上的功能奠定了基础。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种高效、方便的获取齐口裂腹鱼CART基因的全长序列 的方法，填补了该基因在齐口裂腹鱼上的空白，为进一步研究齐口裂腹鱼的该基因奠定了 基础。
[0005] 本发明所述的方法包括如下步骤：
[0006] 1、脑组织总RNA的抽提；
[0007] 2、cDNA 第一链合成；
[0008] 3、CART基因核心片段的PCR扩增；
[0009] 4、RACE 扩增；
[0010] 5、目的片段的分离和回收；
[0011] 6、感受态细胞制备；
[0012] 7、连接和转化；
[0013] 8、质粒DNA抽提；
[0014] 9、将阳性克隆菌液送出测序。
[0015] 本发明的有益技术效果是：本发明技术提供了一种高效、方便的获取齐口裂腹鱼 CART基因的全长序列的方法，填补了该基因在齐口裂腹鱼上的空白，为进一步研究齐口裂 腹鱼的该基因奠定了基础。

【具体实施方式】
[0016] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0017] 实施实例1
[0018] 齐口裂腹鱼CART基因克隆的方法，具体包括以下步骤：
[0019] 1、脑组织总RNA的抽提
[0020] 总RNA提取过程严格按无菌操作要求进行。具体操作步骤如下：
[0021] (1)从一 80°C冰箱中取出冻存组织，取100mg左右，放入高温灭菌处理过的研钵 中，加入液氮，磨成粉末；
[0022] (2)向1. 5mL离心管中加入lmL预冷的RNAisoPlus裂解液，迅速把组织粉末放置 于离心管中，剧烈振荡5min，使其充分溶解；
[0023] (3)4°C条件下12000g离心5min，小心吸取上清液，移入新的1. 5mL离心管中。
[0024] (4)吸取0. 2mL氯仿加入离心管中，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s，待溶液充分 乳化，再室温静置5min。
[0025] (5)4°C条件下12000g离心15min，吸取上清液转移至另一新的1. 5mL离心管中；
[0026] (6)向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管使其充分混匀，在室温下静置 lOmin ；
[0027] (7)4°C条件下12000g离心lOmin，在离心管底部可见胶状RNA沉淀；
[0028] (8)小心弃去上清液，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇lmL，轻轻上下颠倒洗涤 离心管管壁。
[0029] (9) 4°C条件下12000g离心5min后小心弃去乙醇。
[0030] (10)室温干燥沉淀2?5min，加入适量的DNase/RNase-free去离子水溶解沉淀。
[0031] (11) 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，剩余RNA保存于-80°C保存备用。
[0032] 2、cDNA 第一链合成
[0033] cDNA第一链合成的具体步骤如下：
[0034] 在 PCR 管中加入 5XPrimeScriptBufTer2 μ L，PrimeScriptRTEnzymeMixIO· 5 μ L， OligodTPrimerO. 5 μ L，Random6mers0. 5 μ L，TotalRNA2 μ L，RNaseFreedH204. 5 μ L，瞬时离 心，混匀试剂。然后在PCR仪进行反转录反应，反应条件为42°C反应15min，85°C反应5s，于 4°C保存。
[0035] 3、CART基因核心片段的PCR扩增
[0036] 根据GenBank中公布硬骨鱼类CARTcDNA的保守序列设计引物(核心序列引物 CART-1F1、R1 ;CART-2F1、R1 ;CART-3F1、R1)，在 Bio-RadPCR 扩增仪上进行，变性温度、退火 温度和延伸温度根据引物的Tm值和目的片段大小而定。将PCR扩增得到的核心片段送出 测序。
[0037] 4、RACE 扩增
[0038] 4.1RACE 引物设计
[0039] 根据已获得CART核心序列分别设计设计RACE的巢式引物：5'下游特异性引 物 1 (5, RACE 引物 CART-1F1 ;CART-2F1 ;CART-3F1)，5' 下游特异性引物 2 (5, RACE 引物 CART-1F2 ;CART-2F2 ;CART-3F2)，3'上游特异性引物 1 (3'RACE 引物 CART-1R1 ;CART-2R1 ; CART-3R1)，3' 上游特异性引物 2 (3, RACE 引物 CART-1R2 ;CART-2R2 ;CART-3R2)。
[0040] 4. 2RACE_ReadycDNA 的准备
[0041] RACE-ReadycDNA合成的具体操作步骤如下：
[0042] (1)准备 2 个 PCR 管，向其加入 First-StrandBuffer2y L，DTT1 μ L 和 dNTPMixl μ L，瞬时离心，混匀试剂。
[0043] (2)向以上反应管中加入RNA2 μ L。其中向5' RACE反应管中加入 5' -CDSPrimerAl μ L，并定容至 3. 75 μ L。3' RACE 反应管中加入 3' -CDSPrimerA，并定容至 4. 75 μ L。瞬时离心，混匀试剂。
[0044] (3) 72°C孵育 3min，然后 42°C冷却 2min。最后 14000rpm 离心 10s。
[0045] (4) 5' RACE反应管中各加入1 μ LSMARTerllAoligo,混匀后瞬时离心。
[0046] (5)5, RACE 和 3' RACE 反应管都加入 BufferMix4y L，RNaseInhibitorO. 25μ L和 ReverseTranscriptasel μ L,瞬时离心。
[0047] (6) 42 °C 孵育 90min。
[0048] (7) 70°C加热 lOmin 终止反应。
[0049] (8)用TE缓冲液稀释第一链反应产物，并于_20°C保存备用。
[0050] 4. 35' -RACE 扩增
[0051] (1)准备50μ L的5' -RACE反应体系，按照顺序混匀以下试剂： 34.5yLPCR-GradeWater、5yL10XAdvantage2PCR 缓冲液、lyLdNTP(10mmoL/L)、 1 μ L50XAdvantage2PolymeraseMix。旋润混勻试剂，瞬时离心。
[0052] (2)再向 50 μ L 的 5' -RACE 反应体系加入 2. 5 μ L5' RACE-ReadycDNA、5 μ LUPM 和 1 μ L5' 下游特异性引物 1 (5' RACE 引物 CART-1F1 ;CART-2F1 ;CART-3F1)。然后在 Bio-RadPCR仪上进行"Touchdown'TCR反应。反应条件如下：94°C变性5min ;94°C反应30s， 72°C反应3min，进行5次循环；94°C反应30s，70°C反应30s，72°C反应2min，进行5次循环； 94°C反应30s，68°C反应30s，72°C反应2min，进行25次循环；然后72°C延伸lOmin。
[0053] (3)将上一步获得的反应液为模板，以5'下游特异性引物2 (5' RACE引物 CART-1F2 ;CART-2F2 ;CART-3F2)和 UPM 为引物，再次进行"Touchdown" PCR 反应。
[0054] 4. 43' -RACE 扩增
[0055] "Touchdown"PCR 方法和体系同 5' -RACE。
[0056] 5、目的片段的分离和回收
[0057] (1)从电泳板上切割目的DNA片段的凝胶块(割胶尽可能的小，提供后续回收效 率)。
[0058] (2)凝胶称重后并将其放入1. 5mL管中，将其适当切小，加速溶解。每100mg凝胶 加入 400 μ LSolutionSN。
[0059] (3)凝胶溶解：55?6(TC，保温5?lOmin,每2min混勻一下，使凝胶溶解，胶完全 融化后每 400 μ LSolutionSN 中加入 SolutionBlOO μ L，混匀。
[0060] (4)将3S柱装入2mL洗管，将上述混合液转移至3S柱，室温放置2min.室温 10000r/min 离心 lmin，稳定 45S。
[0061] (5)取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，加入 700μ LWashSolution，室温 10000r/min 离心 lmin。
[0062] (6)重复步骤5-次。
[0063] (7)取下3S柱，倒掉收集管中废液，将3S柱放入同一收集管中，室温10000r/min 离心2min。
[0064] (8)将3S柱放入新的离心管中，在3S柱子膜中央加30μ LddH20,室温放置2min。
[0065] (9)盖上离心管，室温10000r/min离心lmin，离心管中的液体即为回收的DNA片 段，-20°C保存备用。
[0066] 6、感受态细胞制备
[0067] 用无菌钼丝直接醮取E. coliDH5a菌株，在LB平板表面划线，37°C倒置培养过 夜；从LB平板上挑取单菌落，接种于3mLLB液体培养基中，37°C震荡培养过夜；取30 μ L 培养液接种于3mLLB液体培养基，37°C震荡培养2. 5h，至肉眼能看到微微浑浊；将培养液 转入 1. 5mLEppendorf 管，冰浴 10min ;4°C、4000r/minX5min，弃上清；用预冷的 75mmol/ LCaC12750y L轻轻悬浮细胞，冰浴30min ;4°C、4000r/minX4min，弃上清；加入预冷的 75mmol/LCaC12 (内含甘油终浓度为15%)200yL，轻轻悬浮，冰浴至少4h，即成感受态细胞 悬液，分装后_80°C保存。
[0068] 7、连接和转化
[0069] (1)连接：在微离心管中依次加入PCR纯化产物4 μ L (约0. 4 μ g)，载体 pMD19-TlyL，Solution I 5yL;16°C水浴反应 12h。
[0070] (2)转化：取200 μ LToplO感受态细胞悬液，加入连接溶液10 μ L，轻轻混匀，冰上 放置30min ;42°C水浴1. 5min，冰上放置2. 5min，加入lmL37°C预热的液体培养基，37°C预 表达111，使细胞恢复正常生长状态；41：，350〇1'/1^11\51^11，将菌液浓缩至20(^1^，分别加 入10 μ L的IPTG和X-gal，轻轻悬浮细胞，将菌液均匀涂布在含Amp+的LB固体培养基上， 37°C正面放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，37°C倒置培养过夜。
[0071] 8、质粒DNA抽提
[0072] 挑取转化后的白色单菌落，分别接种于2mL含适当Amp+抗生素的LB培养基，37°C 下225r/min振荡培养过夜。按照质粒小量快速抽提试剂盒的说明书进行操作。
[0073] 9、将阳性克隆菌液送出测序：
[0074] 将抽提出来的质粒用BamH I和Sal I酶切，1. 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将阳性 克隆菌液大约500mL进行测序。
[0075] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0001] SEQUENCE LISTING \110>四川农业大学 <120〉齐口裂腹鱼CART基因的克隆方法 <130>说明书 <160〉 24 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 597 <212> DNA <213〉齐口裂腹鱼CART-1亚型核苷酸序列 <400> 1 acatggggaa tctcagtgca cagggcgagc ttggctgtga ccatggagag ctccaaactc 60 tggaccacag cgatggcatg cgcggtgctg gtctcctgca ttcagggtgc tgaaatggac 120 tttgacaacg aatccgactt agaaacgaga gctttgagag agttttaccc aaaggacccg 180 aatctgacca acgaaaagca gctcctcggg gctttacatg acgttctgga gaaactgcag 240 agtaaacgca tctcactctg ggaaaagaag tttgggcgcg ttcctacatg cgatgttggg 300 gagcaatgcg ccatcaggaa aggatcaaga atcggcaaaa tgtgcgactg tccacgtgga 360 gcgttttgca attacttttt gctgaaatgt ttgtaaagat aaaaatggat tgtgaattgg 420 aaatatacac atgatcttgc agatatttat acattatgtc atttctattt ttatgattat 480
[0002] ggagtacaat gagaagaaca gatgaatttg aaagattgtt taattatttg ctgctcttga 540 tgtgtaatta atcctgaata aactgtggac ttttgttttc aaaaaaaaaa aaaaaaa 597 <210〉 2 <211〉 694 <212〉 DNA <213〉齐口裂腹鱼CART-2亚型核苷酸序列 <400> 2 acatgggggg gtgcaaggct gtcgagatgg ttatttgcgc caaaactttg catagagacg 60 tataacggca ttgcgcgctc aggtgacaaa gttccctaaa gtcaggacca tggagagctc 120 cagtctgaag acgcgcatgg ctgtgtgcgc gctgctgccc tgcttgttga ccggagccaa 180 agcgaacgag tcagagccgg agatagaggt ggaactggac acaagagcca tcagagactt 240 ctaccccaaa gacccaaacc tgacaagtga aaaacagctt ctcggggctc tgcaagaagt 300 tctggaaaag ctgcagacga aacgaattcc accttgggag aagaaatttg gtcaagttgc 360 catgtgtgat ttgggggagc agtgcgcgat cagaaaaggc tctcgaatcg gcaagatgtg 420 cgactgtccg cgcggggctt tctgcaactt tttcttgtta aagtgcttgt gatggaaagt 480 ccatatgcat tatatatcat aaataactac agttttattt agattaatat ttttttaagt 540 gaagagactg aagacactga agcaaagttg taaagaaatt gttcttcaaa tatttgcgtg 600
[0003] atgtaaacat gtaatactgt catatttaat gttaatctgc tgttttgtgc attaaagtgc 660 aatataactt gttttgtaaa aaaaaaaaaa aaaa 694 <210> 3 <211> 749 <212> DNA <213〉齐口裂腹鱼CART-3亚型核苷酸序列 <400> 3 acatggggga agcaatagaa agaggcaaca agagcacaag cgccgagaaa actaaaacag 60 aaaatagcaa acgattttgt attttaaatt ctcagtttta ccttactgac gccaaagcat 120 tcagcaccat ggacagcgtc cgcgccgcgg tttacctgag cgttttcctc tcgctgctct 180 gcgtctgcag gggtcagatg tcactggaca accgactgag cgcgcaagag gagcagtt.ca 240 txaaaacaga cctggctgag gcgctcgatg aacttttgaa tggagatcag gacaatcgga 300 tatctgtgga gaaaaaagct agcgtcattc caaggtgtga tgtgggggag cgctgcgcca 360 tgaagcacgg accgcgcatc gggcgactgt gtgattgcat gcgaggaaca gcctgcaata 420 ctttcttctt gcgctgctac tgatggagct cgcgcagctt tcctctctct caggcgctgt 480 gctaagagac tcgtgacagc aatgcgtggg acacctcatc tatttaacgc gtgaaattac 540 atgggtgatg tattgatagt gttttgttcg taaccgtgtc tatatgtgtt tgtgtttttt 600
[0004] taagttaata aaacgtcttt aaggctcatt cgttttgaac actgtttact ctaaatgaaa 660 gtatatgtat acattctctg tgagtttata atgtatctgt ttaataaaaa ccgtaaaaac 720 8,3,8,3,8,3,3.3,8,3, 3,8,3,8,3,3.3,8,3, 749 <210〉 4 <211> 120 <212> PRT <213〉齐口裂腹鱼CART-1亚型编码的氨基酸序列 <400〉 4 Met Glu Ser Ser Lys Leu Trp Thr Thr Ala Met Ala Cys Ala Val Leu 15 10 15 Val Ser Cys lie Gin Gly Ala Glu Met Asp Phe Asp Asn Glu Ser Asp 20 25 30 Leu Glu Thr Arg Ala Leu Arg Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Pro Asn Leu 35 40 45 Thr Asn Glu Lys Gin Leu Leu Gly Ala Leu His Asp Val Leu Glu Val 50 55 60
[0005] Leu Glu Lys Leu Gin Ser Lys Arg lie Ser Leu Trp Glu Lys Lys Phe 65 70 75 80 Gly Arg Val Pro Thr Cys Asp Val Gly Glu Gin Cys Ala lie Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Arg lie Gly Lys Met Cys Asp Cys Pro Arg Gly Ala Phe Cys 100 105 110 Asn Tyr Phe Leu Leu Lys Cys Leu 115 120 <210〉 5 <211> 120 <212〉 PRT <213〉齐口裂腹鱼CART-2亚型编码的氨基酸序列 <400〉 5 Met Glu Ser Ser Ser Leu Lys Thr Arg Met Ala Val Cys Ala Leu Leu 15 10 15 Pro Cys Leu Leu Thr Gly Ala Lys Ala Asn Glu Ser Glu Pro Glu lie 20 25 30
[0006] Glu ￥al Glu Leu Asp Thr Arg Ala lie Arg Asp Phe Tyr Pro Lys Asp 35 40 45 Pro Asn Leu Thr Ser Glu Lys Gin Leu Leu Gly Ala Leu Gin Glu Val 50 55 60 Leu Glu Lys Leu Gin Thr Lys Arg 丄丄e Pro Pro 1'rp Glu Lys Lys Phe 65 70 75 80 Gly Gin Val Ala Met Cys Asp Leu Gly Glu Gin Cys Ala lie Arg Lys 85 90 9b Gly Ser Arg lie Gly Lys Met Cys Asp Cys Pro Arg Gly Ala Phe Cys 100 105 110 Asn Phe Phe Leu Leu Lys Cys Leu 115 120 <210〉 6 <211〉 104 <212> PRT 〈213〉齐口裂腹鱼CART-3亚型编码的氦基酸序列 <400〉 6
[0007] Met Asp Ser Val Arg Ala Ala Val Tyr Leu Ser ￥al Phe Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Cys Val Cys Arg Gly Gin Met Ser Leu Asp Asn Arg Leu Ser Ala 20 25 30 (iln G_Lu Glu Gin Phe 丄le Lys Thr Asp Leu Ale G丄u Ala leu Asp G丄u 35 40 45 Leu Leu Asn Gly Asp Gin Asp Asn Arg lie Ser Yal Glu Lys Lys Ala 50 55 60 Ser Val lie Pro Arg Cys Asp Val Gly Glu Arg Cys Ala Met Lys His 65 70 75 80 Gly Pro Arg lie Gly Arg Leu Cys Asp Cys Met Arg Gly Thr Ala Cys 85 90 95 Asn Thr Phe Phe Leu Arg Cys Tyr 100 <210〉 7
[0008] <211> 18 <212> DNA <213〉核心序列引物CART-1上游引物F1 <400> 7 actctggacc acagcgat 18 <210〉 8 <211〉 18 <212> DNA <213〉核心序列引物CART-1下游引物R1 <400> 8 gcacattttg ccgattct 18 <210〉 9 <211〉 18 <212> DNA <213>核心序列引物CART-2上游引物F2 <400〉 9 gagccaaagc gaacgagt 18 <210〉 10 <211> 18 <212> DNA
[0009] <213〉核心序列引物CART-2下游引物R2 <400〉 10 gcggacagtc gcacatct 18 <210〉 11 <211> 18 <212〉 DNA <213〉核心序列引物CART-3上游引物F3 <400〉 11 gcggtttacc tgagcgtt 18 <210> 12 <211〉 22 <212> DNA <213〉核心序列引物CART-3下游引物R3 <400〉 12 agaagaaagt attgcaggct gt 22 <210〉 13 <211> 28 <212> DNA <213〉5'-RACE 引物 CART-1 R1 <400> 13
[0010] gtggacagtc gcacattttg ccgattct 28 <210〉 14 <211> 26 <212> DNA <213〉5'-RACE 引物 CART-1 R2 〈400〉 14 acttcttttc ccagagtgag atgcgt 26 〈210〉 15 〈211〉 26 〈212〉 DNA <213〉5'-RACE 引物 CART-2 R1 <400> 15 gctcccccaa atcacacatg gcaact 26 <210〉 16 <211> 28 〈212〉 DNA 〈213〉5'-RACE 引物 CART-2 R2 〈400〉 16 tcacttgtca ggtttgggtc tttggggt 28
[0011] <210> 17 <211〉 28 <212〉 DNA <213〉5'-RACE 引物 CART-3 R1 <400〉 17 aggtgtccca cgcattgctg tcacgagt 28 <210〉 18 〈211〉 26 <212〉 DNA 〈213〉5'-RACE 引物 CART-3 R2 〈400〉 18 ccacatcaca ccttggaatg acgcta 26 <210> 19 <211〉 28 <212> DNA <213〉3'-RACE 引物 CART-1 FI <400> 19 cagggtgctg aaatggactt tgacaacg 28 <210> 20
[0012] <211> 28 <212〉 DNA <213〉3'-RACE 引物 CART-1 F2 <400> 20 tctcactctg ggaaaagaag tttgggcg 28 <210> 21 <211> 28 〈212〉 DNA <213〉3'-RACE 引物 CART-2 FI <400> 21 ctaccccaaa gacccaaacc tgacaagt 28 <210> 22 <211> 24 〈212〉 DNA 〈213〉3'-RACE 引物 CART-2 F2 <400> 22 cgaatcggca agatgtgcga ctgt 24 <'210> 23 <211> 30 〈212〉L)M
[0013]
【权利要求】
1. 齐口裂腹鱼CART基因，其特征在于，所述的CART基因含有CART-1、CART-2和CART-3 三个亚型；所述CART-1亚型的核苷酸序列是SEQIDNO : 1，所述CART-2亚型的核苷酸序列是 SEQIDN0 :2,所述CART-3亚型的核苷酸序列是SEQIDN0 :3。
2. 根据权利要求1所述齐口裂腹鱼CART基因，其特征在于，所述CART-1亚型核苷酸编 码的蛋白序列是SEQIDNO :4,所述CART-2亚型核苷酸编码的蛋白序列是SEQIDNO :5,所述 CART-3亚型核苷酸编码的蛋白序列是SEQIDNO :6。
3. -种携带有CART基因 DNA序列的载体。
4. 一种宿主，其由权利要求3所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得 至IJ，所述的宿主为细菌、酵母或哺乳动物细胞。
【文档编号】C12N5/10GK104059922SQ201410133601
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】陈德芳, 袁登越, 李志琼 申请人:四川农业大学