老芒麦种质的快速鉴定方法及其est-ssr分子标记特异引物组和专用试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种老芒麦种质EST-SSR分子标记特异引物组，包括3对EST-SSR分子标记特异引物，还提供了老芒麦种质的快速鉴定方法及专用试剂盒。本发明的有益效果为：本发明提供了用于鉴定老芒麦种质的特异EST-SSR分子标记引物组、快速检测试剂盒及检测方法，采用本发明提供的引物及相应的PCR扩增程序和电泳产物检测方法，可以利用植物组织准确的对不同来源的老芒麦进行快速、准确鉴定，和现有的形态鉴定相比，该方法操作简单、周期短，鉴定准确率高，同时通用型PCR扩增程序大大避免了传统SSR引物扩增需要设定不同退火温度的麻烦，且扩增效率大大提高，电泳产物快速检测方法，在30分钟内即可获得清晰可辨的电泳条带。
【专利说明】老芒麦种质的快速鉴定方法及其EST-SSR分子标记特异引物组和专用试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物种质鉴定领域，具体涉及老芒麦种质的快速鉴定方法及其EST-SSR分子标记特异引物组和专用试剂盒。
【背景技术】
[0002]老芒麦sibiricusL.)是禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)披碱草属的多年生疏丛型中旱生植物，为披碱草属的模式种。老芒麦在北半球温带地区分布较广，是欧亚大陆的广布种，尤其是我国草甸草原和高寒草甸群落的重要组成部分，能形成优势种和建群种。由于其具有抗寒性强、粗蛋白含量高、适口性好、易栽培等优点，老芒麦已成为国家“天保工程”和“退牧还草工程”中广泛使用的优良牧草之一。
[0003]我国野生老芒麦资源非常丰富，现已广泛分布于我国的西北、华北、东北和青藏高原等地区，这为我国老芒麦资源的收集、评价和育种提供了极为重要的前提和基础。但自然界野生老芒麦由于形态多样、生态类型丰富往往很难快速鉴定，这给资源的收集、鉴定、保存和利用带来诸多困难。传统上对于老芒麦种质的分类和鉴定常依耐株高、穗长、分蘖数等形态学指标，其种植成本高、鉴定周期长；另外形态指标受环境因素影响大，具有不稳定性，在测定过程中也存在较大的人为误差，从而影响鉴定结果的可靠性。
[0004]随着分子生物学技术的快速发 展，特别是分子标记和基因标记技术的建立和成熟，为发展简便、快速、准确的种质鉴定技术提供了有效手段。SSR (Simple sequencerepeat，简单重复序列)标记因具有数量丰富、多态性高、共显性、扩增稳定、引物序列易于交流等优点，已在水稻iOryza satira )、玉米iZea mays L.)、棉花SGossypiumherbaceum L)、甜瓜(Ci/cawis melo L)、西瓜lanatus.)等作物的种质鉴定中应用。而在草业上SSR分子标记应用不多,仅见于披碱草JaAtfricw1S)、柱花草(Stylosanthess^.)、紫花苜猜(ifet/icago 5<3(/^3)、结缕草(70/7>5/<3 japoniCa、等少数阜种。而有关不同来源老芒麦种质的SSR分子标记鉴定未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种老芒麦种质的快速鉴定方法及其EST-SSR分子标记特异引物组和专用试剂盒。
[0006]本发明是利用5份来至于甘肃南部不同地域的老芒麦种质对前期开发的披碱草属、鹅观草属EST-SSR引物进行扩增，获得一批多态性引物，如图1所示。再通过对鉴定材料的进一步扩增，筛选出3对EST-SSR引物，能通过扩增的特异性条带将来自于不同生境和地域的老芒麦种质快速鉴定，并由此提供了老芒麦种质快速检测试剂盒及鉴定方法。
[0007]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一种老芒麦种质EST-SSR分子标记特异引物组，包括3组核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物:
第一组引物对，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；第二组引物对，其序列如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示；
第三组引物对，其序列如SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示；
第四组引物对，其序列如SEQ ID NO:7和SEQID NO:7所示。
[0008]老芒麦种质EST-SSR分子标记特异引物组具体如表1所示:
表1
【权利要求】
1.一种老芒麦种质EST-SSR分子标记特异引物组，其特征在于，包括3组核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物: 第一组引物对，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示； 第二组引物对，其序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示； 第三组引物对，其序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示； 第四组引物对，其序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:7所示。
2.权利要求1所述的引物组在老芒麦种质快速鉴定中的应用。
3.—种老芒麦种质的快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取老芒麦种质DNA； 2)以步骤I)得到的DNA为模板，利用如权利要求1所述的老芒麦种质EST-SSR分子标记特异引物组中的成对 引物分别PCR扩增EST-SSR分子标记，得到PCR产物； 3)将步骤2)得到的PCR产物进行检测。
4.根据权利要求3所述的老芒麦种质的快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤I)中，是取生长良好的老芒麦幼嫩叶片采用CTAB方法提取DNA，用0.8 %琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测DNA浓度和纯度，OD26(i/OD28(i在1.7-1.9之间的DNA样品为合格样品，每份样品稀释成25 ng/μ I置于4 °C冰箱中保存备用。
5.根据权利要求4所述的老芒麦种质的快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)中， PCR扩增的反应体系为:25ng/y I的模板DNA 2μ 1，PCR预混液2XReaction Mix7.5 μ 1,10 μ M/μ I 的 PF 上游引物 0.5 μ I，10 μ M/μ I 的 PR 下游引物 0.5 μ I，2.5 υ/μ I 的Taq 酶 0.2 μ I,灭菌水 4.3 μ I ； SSR-PCR扩增的反应程序为:94°C变性30 sec, 65 - 60 °C退火30 sec，72°C延伸Imin，共5个循环，每个循环退火温度降低1°C;94 V变性30 sec, 60 °C退火30 sec, 72 V延伸I min,共30个循环；72 °C延伸IOmin,4°C保持。
6.根据权利要求5所述的老芒麦种质的快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤3)中，PCR扩增产物的检测方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染色的方法，具体过程为:采用6%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，胶版采用质量百分浓度为0.08 %-0.1 %的银染液进行染色10-15分钟，以蒸馏水水洗1-2次后加入至显影液中显影至条带清晰即可。
7.根据权利要求6所述的老芒麦种质的快速鉴定方法，其特征在于，所述显影后的胶版置于质量百分浓度为7 %的冰醋酸溶液中进行停显。
8.根据权利要求6或7所述的老芒麦种质的快速鉴定方法，其特征在于，所述银染液为硝酸银染色液；所述银染液的质量百分浓度为0.09% ;所述染色时间为10分钟；所述显影液的配方比例为每升显影液含有氢氧化钠15g、甲醛4ml、四硼酸钠0.19g ;所述显影时间为5分钟。
9.一种老芒麦种质EST-SSR特异性分子标记鉴定方法及快速检测的专用试剂盒，其特征在于，所述专用试剂盒中包含有PCR预混液2 X Reaction Mix、Taq酶、如权利要求1所述的老芒麦种质EST-SSR分子标记特异引物组。
【文档编号】C12N15/11GK103923910SQ201410142555
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月10日 优先权日:2014年4月10日
【发明者】谢文刚, 刘勇, 王彦荣, 刘文献, 张建全 申请人:兰州大学