一株食品级黑曲霉及其在玉米赤霉烯酮降解的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株从酱醅中分离的能够防治玉米赤霉烯酮毒素的食品级黑曲霉（Aspergillus?niger）菌株FS-Z1，保藏编号CCTCC?NO：M?2013703。该菌株对玉米赤霉烯酮具有良好的降解效果，降解率达到89.56%。并且通过大鼠动物实验验证了黑曲霉发酵液降解后的玉米浆中玉米赤霉烯酮的毒性消失。
【专利说明】—株食品级黑曲霉及其在玉米赤霉烯酮降解的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株黑曲霉，特别是从酱醅中筛选分离出的能够防治玉米赤霉烯酮毒素的食品级菌株。
【背景技术】
[0002]玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)是由镰刀菌产生的一种类雌激素样真菌毒素，是世界上污染最为广泛的一种镰刀菌毒素，全世界谷物和饲料普遍受到玉米赤霉烯酮的严重污染。在中国，不良的谷物收获条件和油料加工过程加重了 ZEA的污染，低质量的玉米和粮食加工副产品，特别是非常规原料的广泛使用，使ZEA等霉菌毒素的污染程度远远超出国外。ZEA及其代谢物的主要毒性归因于它们的动情激素活性和合成代谢活性。大量研究证实，ZEA及其代谢物能够引起很多动物的真菌毒素中毒症，影响内脏器官发育，还可导致动物繁殖障碍、消化系统功能紊乱，给畜牧业带来很大的经济损失。
[0003]目前，针对去除饲料和食品中玉米赤霉烯酮的方法，根据其作用原理可分化学法，物理法和生物法三类。其中物理脱毒法在去除玉米赤霉烯酮毒素的同时也会造成动物饲料营养物质的流失；而化学脱毒法虽然可以脱去一些霉变较严重的谷物饲料，但费时费工，而且对营养成分造成极大的破坏，还可能产生一些对动物健康有害的化学物质，值得注意的是，欧盟不允许在食品生产过程中应用化学方法消除真菌毒素。由于传统的物理、化学方法去除毒素污染存在着不可避免的局限性，利用生物降解法清除ZEN毒素已成为重要的研究方向，生物降解是指霉菌毒素分子的毒性基团被微生物产生的次级代谢产物或者所分泌的胞内、胞外酶分解破坏，同时产生无毒的降解产物过程。这种脱毒的方法不会破坏原料当中的其他成分，不会降低营养价值。因此，生物降解法是去除ZEN最有效及可行的方法。
[0004]研究表明多种微生物对玉米赤霉烯酮具有生物防治作用。如枯草芽胞杆菌，不动杆菌属，恶臭假单胞菌，藤黄微球菌，毛孢子菌属，胶红类酵母菌等微生物对玉米赤霉烯酮有较强的脱毒作用；Kakeya H等对分离到粉红粘帚霉(C.rosea IF07063)菌株进行了研究，研究发现该菌株可将ZEN转化为1-(3，5 二羟苯基)-10'-羟基-1'反式十一碳烯-6'-酮，该降解产物无任何雌激素活性。余元善成功的从农业土壤中分离到一株能以ZEN为唯一碳源和能源生长的不动杆菌属SM04，该菌株的上清发酵液具有高效降解ZEN的能力。因此分离出一种对玉米赤霉烯酮毒素具有良好防治及降解效果的安全菌株具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一株食品级黑曲霉FS-Zl (Aspergillus niger)FS-Z1菌株，已于2013年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2013703;以其ISSrDNA全序列为基础的系统发育树如说明书附图1所示。该菌株对玉米赤霉烯酮具有良好的降解效果，降解率达到89.56%。
[0006] 所述黑曲霉是从酱醅中分离得到，其保藏条件如下:从生长良好的固态平板培养基上接取3环黑曲霉孢子到摇瓶培养基中，28°C摇床(150rpm)培养36h，取0.65mL移入含有0.3mL无菌甘油的甘油管中，放入_70°C超低温冰箱保存。
[0007]所述固体平板培养基PDA为(w/v):马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1L，自然pH, 121 °C高压灭菌15min。
[0008]所述液体培养基PDB为(w/v):马铃薯300g、葡萄糖20g、蒸馏水1L、自然pH、121°C高压灭菌15min。
[0009]所述黑曲霉的培养条件为:将已保藏甘油管的黑曲霉接入固体培养基活化3d，然后再接入到液体培养基，280C，150rpm,摇床培养。
[0010]所述黑曲霉的筛选条件为:将从酱醅筛选出来的黑曲霉接种到PDA固体培养基中，28°C培养36h，取50ml生理盐水洗下孢子，振荡均匀，形成单孢子悬浮液，制成IO8CFU/ml的菌悬液。按2%的接种量接种到60ml无菌PDB培养基中，28°C，150rpm，摇床培养5d，向发酵液中加入玉米赤霉烯酮，使其终浓度达到2ppm，以无菌PDB培养液加玉米赤霉烯酮作为空白对照，分别于48h后用HPLC检测法检测玉米赤霉烯酮的浓度。
[0011]本发明还提供了一种所述黑曲霉在降解玉米赤霉烯酮中的应用方法，最适降解条件为菌液接种量2%，降解温度28°C，降解pH=5，转速150r/min，降解时间48h。
[0012]所述的黑曲霉在食品、饲料领域的应用也属于本发明的保护范围。
[0013]本发明是从酱醅中分离得到的对玉米赤霉烯酮具有良好降解效果的安全菌株，对玉米赤霉烯酮的降解 效率达到89.56%，该菌株还可应用食品，农产品，粮食以及饲料等领域中多种真菌毒素的降解中，达到降低真菌毒素尤其是玉米赤霉烯酮含量的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1:食品级黑曲霉FS-Zl (sample)的系统发育树
[0015]图2:食品级黑曲霉FS-Zl对玉米衆中玉米赤霉稀丽的降解效果
[0016]图3:大鼠动物实验验证玉米赤霉烯酮被降解后的毒性(1-肝；2_肾)
[0017]A:生理盐水组；B:玉米浆组；C:降解组。D:培养液组；
【具体实施方式】
[0018]实施例1:酱醅中黑曲霉的筛选方法
[0019]从发酵4d后的酱中用含β -环糊精的PDA培养基定性地分离出酱醅中的非产毒丝状真菌，然后用ELISA方法对所分离菌株的产毒能力进行定量分析，最后筛选出非产毒的霉菌。对能抑制黄曲霉产毒菌进行复筛，筛选出能防治真菌毒素的菌株。
[0020]通过菌落特征观察和个体形态观察，并将菌株的18S rDNA与GenBank数据库(http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中已知序歹Ij 对 I:匕，发现其与黑曲霉(Aspergillus niger)同源性达100%。结合菌株的形态特征和分子生物学鉴定,可确定菌株为黑曲霉。本菌株与2013年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCM2013703，保藏地址为中国武汉大学。
[0021 ] 实施例2:黑曲霉对玉米赤霉烯酮的降解
[0022]将分离得到的菌株FS-ZI按2%的接种量接种到60ml无菌PDB培养基中，280C 150rpm,摇床培养5d。向发酵液中加入玉米赤霉烯酮使其终浓度达到2ppm,以无菌PDB培养液加玉米赤霉烯酮作为空白对照，分别培养48h后，从两组样品中吸取2ml液体加A4ml三氯甲烷，萃取3次，氮气吹干后再加Iml流动相[乙腈:水=50:50 (v/v)]复溶，过
0.22 um的有机滤膜后用高效液相色谱法(HPLC)进行检测。
[0023]色谱检测条件为:色谱柱:C18柱6mmX 150mmX5um ;流动相:乙腈:水=50:50 ；检测温度:25°C ;流速:lml/min ;检测波长:激发波长:274nm ;发射波长:440nm ;进样量:20 μ L ;洗脱时间20min ;玉米赤霉烯酮的保留时间在6.5±0.5min。
[0024]结果显示,玉米赤霉烯酮的降解率达到89.56%ο
[0025]实施例3:黑曲霉FS-Zl对玉米赤霉烯酮毒素污染的玉米浆的防治
[0026]将分离得到的菌株FS-ZI按2%的接种量接种到60ml无菌PDB培养基中，280C 150rpm，摇床培养5d。用四层无菌纱布将黑曲霉的菌丝过滤，得到黑曲霉的发酵液。将发酵液与玉米浆混合[l:l(v/v)]振荡均匀，以无菌PDB培养基与玉米浆等体积混合作为空白对照，于28°C 150rpm的条件下培养48h，经玻璃纤维滤纸过滤I~2次，至滤液澄清，按上述方法提取样品中的玉米赤霉烯酮，用高效液相色谱法检测残留玉米赤霉烯酮毒素的含量。
[0027]经高效液相色谱法测定，发现Oh玉米浆中玉米赤霉烯酮的浓度为29.06ppm,而48h过后玉米浆中毒素的 含量仅为11.62ppm,降解率达60% (图2)。
[0028]实施例4:大鼠动物实验验证玉米赤霉烯酮被降解后毒性变化
[0029]大鼠灌胃前禁食12h，自由饮水，称体质量并记录，做好标记，随机分成4组，即:灌胃生理盐水组(简称:生理盐水组A);灌胃被玉米赤霉烯酮污染的玉米浆组(简称:玉米浆组B);灌胃污染玉米浆和黑曲霉发酵液共培养48h实验组(简称:降解组C);灌胃无菌TOB培养液组(简称:培养液组D);，每组各8只。各组小鼠每日同一时间灌胃处理，自由采食饮水，持续30天，最后脱颈处死。取出大鼠的肝脏和肾脏，经过石蜡包埋，切片，HE染色，在100X和400X的光学显微镜下观察其组织切片图。结果发现，玉米浆组B由于玉米赤霉烯酮毒素含量高，导致大鼠的肝肾明显损坏:肝细胞脂肪变性、局灶性坏死；肾小球发生明显萎缩，肾细胞脂肪变性；而降解组C的大鼠肝肾和对照组A，对照组D均未发现明显的组织损坏，这说明黑曲霉发酵液能够降解玉米浆中的玉米赤霉烯酮毒素，并使其毒性消失。因此，该黑曲霉对玉米赤霉烯酮的降解是安全无毒副产物的菌株，为动物饲料提供了一种高效安全的脱毒方法。
[0030]可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一株食品级黑曲霉FS-Zl (Aspergillus niger)FS-Z1菌株，于2013年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CCTCC M2013703，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.根据权利要求1所述黑曲霉，其特征在于该菌株是从酱醅中经过初筛复筛分离出的能够防治黄曲霉毒素B1、玉米赤霉稀丽的囷株。
3.权利要求2中所述的黑曲霉，其特征在于该菌株对玉米赤霉烯酮的降解率可达到89.56%。
4.根据权利要求1-3任一所述黑曲霉在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
5.权利要求4中所述的方法，其特征在于该菌株对玉米赤霉烯酮的最适降解条件为菌液接种量2%，降解温度28°C，降解pH=5，转速150r/min，降解时间48h。
6.根据权利要求1-3任一所述的黑曲霉在食品、饲料领域的应用。
【文档编号】C12N1/14GK103937681SQ201410147140
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】孙秀兰, 何兴兴, 徐丹, 张银志 申请人:江南大学