玉米胚乳特异表达启动子50kD zein启动子的克隆及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种玉米胚乳特异表达启动子50kD?zein启动子及其克隆方法。本发明首次分离到一个可在玉米胚乳中特异性表达的启动子——50kD?zein基因启动子。该启动子具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，或该序列经取代、缺失和／或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本发明从克隆玉米胚乳特异表达启动子50kD?zein启动子入手，通过对50kD?zein启动子的功能分析，从实验水平上验证了该启动子适用于启动目标基因在玉米胚乳中特异性表达，而在其他组织中低表达或不表达。为植物基因工程表达载体构建提供了合适的调控元件，为实验室其他课题的研究进行提供了新的材料。
【专利说明】玉米胚乳特异表达启动子50kD zein启动子的克隆及其应 用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种玉米胚乳特异表达启动子50kD zein启动子及其克隆方法。 技术背景
[0002] 玉米是世界上种植面积、产量、区域分布方面都占主要地位的粮食作物和饲料来 源。胚乳是玉米主要的贮藏器官，因此分离和鉴定玉米胚乳特异表达的启动子，对改造玉米 籽粒性状有重要的价值。
[0003] 启动子是一段位于基因上游区的DNA序列，参与下游基因的表达调控，决定了基 因的转录起始、转录效率和时空特异性。一般由核心启动子和上游的一些作用元件组成，核 心启动子包括转录起始位点、TATA-box以及5'UTR序列。上游的作用元件包括CAAT-box 、GC-box，以及一些组成型表达序列。启动子并不直接控制基因的表达，而是通过与转录因 子结合来控制基因的活动。
[0004] 按照启动子的作用方式和功能可以分为三大类：组成型启动子、诱导型启动子以 及组织特异性启动子。目前组成型启动子在植物基因工程中应用较为广泛，但在应用中逐 渐暴露出一些问题，比如说它使外源基因在整个植株中表达，产生大量的外源蛋白质或代 谢产物，打破了植株原有的代谢平衡，加重了植株的负担，影响了植物的形态和正常的生长 发育，甚至会导致植株死亡，造成资源不必要的浪费。而且转基因安全问题一直备受关注， 使用植物自身的启动子相对而言安全性会好一些。
[0005] 因此，人们正在努力寻找一些植物自身特有的组织特异启动子，来用于转基因载 体的构建。使用组织特异启动子，可以按照人们的意愿在生物体内表达外源基因，使外源基 因更为经济有效地发挥作用。
[0006] 组织特异性启动子（tissue-specific promoter)又称器官特异性启动子。这类启 动子只在某些特定的器官或组织部位调控基因表达，并表现出发育调节的特性。其特点在 于，在植物发育过程中，能够在时间和空间上有效地调控目的基因的表达，使得目的基因的 表达产物在特定的空间区域积累，按照人们的意愿改进代谢途径，提高组织中营养物质含 量，调控转基因植物继代繁殖，利用种子便利地获得工业新产品和医药新化合物等。因此， 组织特异性启动子，已成为转基因研究中最具有发展前景的外源基因的启动元件。
[0007] 目前组织特异性启动子的应用主要在以下几方面：①改良农作物品质，提高作 物的抗冻、抗旱、抗盐能力，防止水果腐烂；②改良花卉品质、控制观赏花卉的颜色；③提 高植物的抗病性、抗虫性和抗除草剂能力；④开发生物反应器用于生物制药；⑤创建雄性 不育系和恢复系；⑥用于植物的分化发育研究等。
[0008] 种子是主要的营养贮藏器官，具有重要的经济价值。因此，胚乳特异性启动子作为 一种重要的顺式作用元件，具有重要的实践意义和应用价值，今后在利用转基因技术来提 高种子中蛋白质含量和制备植物生物反应器等方面，将会有更加广泛的应用。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的之一在于提供一种玉米胚乳中特异表达启动子50kD zein启动子。
[0010] 本发明的目的之二在于提供该启动子的克隆方法。
[0011] 为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种玉米胚乳特异表达启动子50kD zein启动子，其特征在于该启动子为下列之一： i) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列； ii) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等 功能的由i)衍生的核苷酸序列。
[0012] 一种载体，其特征在于该载体含有上述的启动子。
[0013] 一种转基因细胞系，其特征在于该转基因细胞系含有上述启动子。
[0014] -种克隆上述的玉米胚乳特异表达启动子50kD zein启动子的方法，其特征在于 该方法的具体步骤为：在NCBI数据库中找到玉米胚乳特异表达基因50kD zein的ATG上游 序列，截取2018bp的碱基序列，设计引物，以B73基因组为模板，通过PCR技术获得片段，获 得目的片段2018bp后，通过TA克隆连接载体，所述的引物序列为 ： 正向引物从Y端至:V端为：CAAGAGTAACAAATCCGC; 反向引物从 Y 端至:V 端为：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG。
[0015] 本发明首次提出一个新的能够在玉米胚乳中特异表达启动子50kD zein启动子， 该启动子适用于启动目标基因（如GUS基因或GFP基因）在玉米胚乳中的特异性表达。由 于该启动子的特异性很强，因此为后续进一步确定胚乳特异表达的瞬时作用元件奠定了基 础，且为植物基因工程表达载体提供合适的调控元件，为实验室其他课题的研究进行提供 新的材料。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1PCR获得玉米胚乳特异表达基因50kD zein基因的ATG上游2018bp&1036bp 序列片段电泳图 图 2PCR 获得 523bp、431bp、320bp、237bp、108bp 的序列片段 图3基因枪瞬时转化载体构建示意图 图4B73玉米授粉后14天的籽粒基因枪轰击GUS染色结果 A :35S(正对照）B :B73 负对照 C :50kDzein_2018bp 片段 D :50kDzein_1036bp 片段 E :50kDzein-523bp 片段 F :50kDzein-431bp 片段 G :50kDzein-320bp 片段 图中的标尺长度代表1_ 图5农杆菌转化载体构建示意图 图6 PBPA玉米幼胚转化流程图 A :取胚侵染 B :共培养C :恢复培养D : -轮筛选E :三轮筛选 F :抗性愈 伤 G:暗再生 H:光再生 I:阳性苗入土 图7PCR检测结果电泳图 A: (bar) 50-1-3, 4, 5; 50-4-9, 10, 11; 50-6-5, 6, 7; 50-8-9, 10, 11，12 B:(⑶S) 50-1-3, 4, 5; 50-4-9, 10, 11; 50-6-5, 6, 7; 50-8-9, 10, 11，12 图8 部分事件bar探针检测Southern杂交图 M ：lkb marker 1 :PBPA基因组DNA 2_6 :5个独立的转基因事件基因组 图9植株的叶、根、种皮、胚、胚乳组织GUS染色结果图 35S-⑶S的 a :叶b :根c :种皮d :胚e :胚乳 50kD_⑶S的 A :叶B :根C :种皮D :胚E :胚乳 图中的标尺长度代表1_。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常 规条件，如分子克隆（Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生 物学一实验手册（Plant Molecular Biology -A Laboratory Manual, Melody S. Clark 编，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的 条件。
[0018] 实施例一：获得启动子片段 在NCBI数据库中找到玉米胚乳特异表达基因50kD zein的ATG上游序列，截取2018bp 和1036bp的碱基序列，具体序列详见SEQ ID NO. 1 (序列表中没有2018bp，请核查)，设计 引物，以B73基因组为模板，通过PCR技术获得片段，参见图1。扩增片段的引物序列： 2018bp: 正向引物从Y端至:V端为：CAAGAGTAACAAATCCGC; 反向引物从 Y 端至:V 端为：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG; 1036bp ： 正向引物从Y端至:V端为：AATTAACCAAGCAGGCAT ; 反向引物从 Y 端至:V 端为：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG; 结果：获得目的片段2018bp和1036bp后通过TA克隆连接载体，测序比对，与数据库中 提供的序列一致。
[0019] 实施例二：启动子截短片段的获得 根据预测启动子元件的网站（http://www. softberry. com)的预测结果，分别截取 523bp、431bp、320bp、237bp、108bp大小的碱基序列，PCR获得片段，见图2。扩增片段的引 物序列： 523bp ： 正向引物从Y端至:V端为：CACATGACATTACCTTTA ; 反向引物从 Y 端至:V 端为：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG ; 431bp ： 正向引物从5'端至3'端为：GATTCGTCGCGTTTCAAC ; 反向引物从 Y 端至:V 端为：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG ; 320bp ： 正向引物从Y端至:V端为：AAGCTTATTATACTTCCT ; 反向引物从 Y 端至:V 端为：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG; 237bp ： 正向引物从5'端至3'端为：ACGTAAAGTGAGTGATGA; 反向引物从 Y 端至:V 端为：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG; 108bp ： 正向引物从5'端至3'端为：ACTCATGCATCACAAAAC; 反向引物从 Y 端至:V 端为：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG; 结果：分别回收不同大小的目的片段后通过TA克隆连接载体，测序比对，与提供的序 列一致。
[0020] 实施例三：截短片段与⑶S基因连接，打基因枪，验证启动子核心元件 用5)^ I + ? I酶点将gusA-NOS片段从PBI121载体上酶切连接到PUC18载体中， 构建pUCIS-Gus-nos载体(见图3)。将克隆到的不同长度的片段回收连接测序验证正确后， 用油al+Aal酶切，连入pUC18-Gus-nos，构建pUC18-50kD zein-GUS载体。将构好的载体 转入大肠杆菌T0P10中，抽提质粒后打基因枪。
[0021] 选取B73玉米授粉后14天的籽粒为受体材料，用70%酒精消毒剥去种皮，放到渗 透培养基上培养6小时。基因枪参数：压力650,距离3cm，两枪。轰击之后25°C暗培养48 小时，⑶S染色（图4)。
[0022] 结果：50kDzein-2018bp 片段、1036bp 片段、523bp 片段、431bp 片段、320bp 片段均 有GUS表达，说明截短到302bp片段时启动子仍有功能。
[0023] 实施例四：根据截短片段的功能验证结果，选取1036bp片段构建表达载体，农杆 菌转化玉米幼胚 选取PTF102载体作为农杆菌转化玉米幼胚的载体。先用Α? I酶切pTF102载体去除 35S-GUS片段，载体自连。将pUC18-50kD zein-GUS载体中的1036bp启动子片段连接⑶S 的区段用油al+feo/P I酶切后，连入自连后的pTF102载体，构建pTF102-50kDzein-GUS载 体(见图5)，电击转化EHA101菌株。
[0024] 选取PBPA玉米品系授粉8-12天的幼胚，大小约1. 5mm左右作为受体材料，进行幼 胚转化，具体流程（图6):农杆菌侵染lOmin-共培养20°C 3天-恢复培养28°C 7天-筛选 培养(双丙氨磷1.5mg/l)28°C 14天-筛选培养(双丙氨磷3mg/l)28°C 14天3-5轮-获 得抗性愈伤组织-暗再生培养28 °C 14-21天-光再生培养28 °C 14-21天-获得阳性苗-移 入盆中_PCR检测（图7) -Southern检测（图8)-授粉获得后代。
[0025] 结果：选取了约2000个幼胚作为受体材料，经过转化筛选后获得7个抗性愈伤，经 过再生后获得转基因植株，并收获后代。同时选取部分事件的叶子抽提基因组，通过PCR检 测及Southern杂交验证转基因结果。
[0026] 实施实例五：⑶S染色 选取35S启动子-GUS基因作为正对照，与转基因植株的叶、根、种皮、胚、胚乳分别进行 ⑶S染色，验证启动子的特异性（图9)。
[0027] 结果：35S-GUS在玉米植株的叶、根、胚、胚乳均有⑶S基因表达，而50kD-GUS在玉 米植株的叶、根、胚乳组织均没有⑶S基因表达，胚组织有少量的表达，只有胚乳组织中⑶S 基因高效表达，证明50kD启动子的特异性很好。
【权利要求】
1. 一种玉米胚乳特异表达启动子50kD zein启动子，其特征在于该启动子为下列之 i) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列； ii) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等 功能的由i)衍生的核苷酸序列。
2. -种载体，其特征在于该载体含有根据权利要求1所述的启动子。
3. -种转基因细胞系，其特征在于该转基因细胞系含有根据权利要求1所述启动子。
4. 一种克隆根据权利要求1所述的玉米胚乳特异表达启动子50kD zein启动子的方 法，其特征在于该方法的具体步骤为：在NCBI数据库中找到玉米胚乳特异表达基因50kD zein的ATG上游序列，截取2018bp的碱基序列，设计引物，以B73基因组为模板，通过PCR 技术获得片段，获得目的片段2018bp后，通过TA克隆连接载体，所述的引物序列为： 正向引物从Y端至:V端为：CAAGAGTAACAAATCCGC ; 反向引物从 Y 端至:V 端为：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG。
【文档编号】C12N15/84GK104140966SQ201410147127
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】宋任涛, 马亚飞, 张婷婷, 杨曦, 王冠, 王珊珊, 祁巍巍, 梅冰, 唐远平 申请人:上海大学