一种提高全细胞转化生产α-酮戊二酸产量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高全细胞转化生产α-酮戊二酸产量的方法，属于生物【技术领域】。其特征在于以重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，敲除其基因组中sucA基因。是将sucA基因敲除，从而阻断胞内L-谷氨酸的分解途径，以此改造菌株高效转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸，从而解决了工业化α-酮戊二酸生产高成本、低得率、污染严重的问题。
【专利说明】—种提高全细胞转化生产α-酮戊二酸产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种通过敲除SUcA基因提高重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产α -酮戊二酸产量的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]α -酮戊二酸是三羧酸循环的重要中间体，对于协调细胞内碳代谢和氮代谢发挥重要作用。α -苯丙酮酸有很多应用，可用来合成抗肿瘤药物的杂环化合物，可作为抗氧化剂及促进伤口愈合。在生物医学诊断中，α-酮戊二酸可作为酮戊二酸脱氢酶，天冬氨酸转氨酶及丙氨酸转氨酶的底物。α -酮戊二酸可作为合成聚乙烯的原材料，这种聚合物具有生物降解能力。传统α-酮戊二酸生产采用化学法，化学法的主要缺点是缺乏选择性，采用有毒的氰化物及金属铜，产率低，且污染环境。酶和全细胞生物催化剂越来越多的用于工业化生产。
[0003]L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2)催化L-氨基酸氧化脱氨基，生成相应α -酮酸和氨，多为黄素蛋白，二聚体结构。L-氨基酸脱氨酶主要存在于蛇毒和昆虫毒素中，在细菌、真菌、藻类中也存 在。蛇毒氨基酸脱氨酶是研究最好的脱氨酶，但是价格昂贵，难以大规模使用。P.mirabilis KCTC2566有两种L-氨基酸脱氨酶，一种具有广泛的底物特异性，能够催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其对L-苯丙氨酸具有较高催化活性；另一种具有底物限制性，只对碱性氨基酸具有催化活性，尤其是L-组氨酸。大部分细菌L-氨基酸脱氨酶是胞外分泌型，但是P.mirabilis中两种L-氨基酸脱氨酶都是膜蛋白。
[0004]通过PCR和Cre/loxP定点重组系统结合进行基因重组操作，实现了枯草芽孢杆菌内不依赖载体构建的无痕敲除过程。
[0005]全细胞转化相比分离酶具有如下优势:全细胞生物催化剂更容易制备，成本低；比分离酶更稳定，不易受环境温度、PH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物。有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化PPA生产。之前的研究中我们已经成功构建了枯草芽孢杆菌全细胞催化剂，表达来源于P.mirabilisKCTC2566的改造的脱氨酶基因，α-酮戊二酸的产量为8.59g/L。但是由于全细胞催化剂本身对底物有一定吸收，用于胞内分解代谢消耗，从而影响了胞外底物转化生成α-酮戊二酸。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是解决全细胞催化剂本身对L-谷氨酸的吸收浪费，从而提高胞外转化L-谷氨酸的产量。是将sucA基因敲除，从而阻断胞内L-谷氨酸的分解途径，以此改造菌株高效转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸，从而解决了工业化α-酮戊二酸生产高成本、低得率、污染严重的问题。本发明以重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，敲除其基因组中sucA基因。
[0007]所述重组枯草芽孢杆菌为表达的改造后L-氨基酸脱氨酶基因的枯草芽孢杆菌168。
[0008]所述改造后L-氨基酸脱氨酶基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，编码的突变体为 F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T
[0009]所涉及到的微生物有:P.mirabilis KCTC2566、B.subtilisl68。
[0010]所涉及到的质粒有:p7Z6(pMD18_T containing lox71-zeo_lox66cassette)、pTSC (Emr Ampr; temperature sensitive in B.subtilis),均系本实验室保存。
[0011]所述sucA基因敲除方法:PCR扩增sucA基因上下游约1000bp及抗性标记片段约lOOObp，融合PCR制备打靶片段。将此融合产物转化枯草感受态细胞，抗生素筛选发生同源重组的菌株。最后用温敏型质粒消去抗性。所述sucAGENBANK ID:939507。
[0012]所述微生物菌株的种子培养与发酵培养基:种子培养基:蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCllg,自来水定容至100mL。发酵培养基:蛋白胨12g,酵母提取物24g,甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60°C，再加IOOmL灭菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2P O4和12.54g的K2HPO4溶于水中，终体积为IOOmL,高压灭菌)。
[0013]本发明的有益效果:本发明成功实现了枯草芽孢杆菌内sucA基因的敲除，从而阻断了细胞对底物的吸收，进一步提高了胞外转化L-谷氨酸的产量，α -酮戊二酸的产量可达12.20g/L。此全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成α -酮戊二酸的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产α-酮戊二酸的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产α -酮戊二酸，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。
【具体实施方式】
[0014]材料与方法
[0015]种子培养基:蛋白胨lg，酵母粉0.5g, NaCllg,自来水定容至100mL。
[0016]发酵培养基:蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到 60°C，再加 IOOmL 灭菌的 17mmol/L KH2PO4 和 72mmol/LK2HP04 的溶液。
[0017]α-酮戊二酸含量测定:将转化体系进行离心，弃上清，离心向细胞中加入50 μ LL-谷氨酸(IOOmM)，30min后，加入45 μ I三氯乙酸(20%)，室温放置30min，终止反应。加入20yL DNP (20mM)，室温放置15min，加入400 μ L NaOH (0.8Μ)终止反应。离心，取上清，酶标仪测定520nm的吸光度。
[0018]实施例1sucA基因的敲除
[0019]之前的研究中，通过枯草芽孢杆菌表达通过易错PCR或定点饱和突变改造的L-氨基酸脱氨酶基因(SEQ ID N0.1)，提高了全细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸的转化率。
[0020]SEQ I D NO, 1:
atggcaataa gtagaagaaa alllallcll gglggcacag lggllgclgl lgclgcaggc60
gctggggttt taacacciat gttaacgcga gaagggcgti Ugttcctgg lacgccgaga120
calggUUg llgagggaac tggcgglcca Uaccgaaac aagatgalgl Igltglaatt180
gglgcgggta UUagglal calgaccgcg allaaccttg ctgagcglgg cUalctgtc240
acaatcgllg aaaaaggaaa tattgccggc gaacaalcat ctcgattcta tggtcaagct300
[0021]attagctata aaatgccaga tgaaaccatc ttattacatc acctcgggaa gcaccgclgg360
cgtgaj acgctaaagt iggtattgat accacttatc giacacaagg icgtgtagaa420
gttcclUag atgaagaaga uiaac glaagaaaat ggaiigalgc taaaagcaaa480
gaigttggci cagacaltcc atttagaaca aaaatgattg aaggcgclga guaaaacag540
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gtaacagaaa aaggaccaai laaatcttct cgigUgUg tcaccggtgg tgttgggtca780
cglUaltta lgcagaacct aaalgllgat giaccaacat lacclgclla tcaaicacag840
caattaalta gcgcagcacc aaalgcgcca ggl.gga.aacg UgcUtacc cggcggaait900
ltclttcgtg aicaagcgga tggaacgtat gcaacltclc cicgtgtcat lgttgclccg960
giagiaaaag aatcatttac uacggclai aaataltiac cicigciggc Utacctgai1020
UcccagUic atalltcgtl aaatgatcag UggctaaU cclllalgca atcaacacai1080
tgggaicUa aigaagagtc gccalltgaa aaatatcgtg am^acc^c ictgcctgat1140
clgccagaat taaatgcctc actggaaaaa ctgaaaaaag agttcccagc atttaaagaa1200
IcaacgUaa Ugalcaglg gagtggtgcg atggcgallg caccagalga aaacccaatt1260
alclclgatg Uaaagagta lccaggicta gttattaata ctgcaacagg Uggggaatg1320
acigaaagcc cigtatcagc agaaalUica gcagaUlal laltaggcaa aaaaccagta1380
ttagatgcca a a c c a t I I a g t c I g t a I c g t t t c t a a
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[0022]以此重组枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，以sucA-L-F和sucA-L-R为引物，PCR扩增sucA基因上游约lOOObp，以sucA-R-F和sucA-R-R为引物，PCR扩增sucA基因下游约lOOObp。以p7Z6为模板，以sucA-Z-F和sucA_Z-R为引物，扩增抗性标记片段Lox71-zeo-lox66约lOOObp。对这三个片段进行融合PCR。融合PCR片段转化枯草芽孢杆菌，同源重组，筛选 zeor转化子。温敏型质粒pTSC转化zee/转化子,促进1οχ71和1οχ66的接合，从而消除zeo抗性。通过50°C
[0023]培养12h，丢失温敏型质粒pTSC。从而得到了敲除sucA基因的菌株。
[0024]表1PCR所用引物
[0025]PrimersSequence
sucA-Z-F.r-ACCATGTGCATGACTTCAAAGAGCAGCGGATAACAATTTCACACAGG-:^
sucA-Z-R5-CTCCTGCACTTCCGACACCGTATTTGGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC-3f
sucA-L-F5-ACGAACAAAATGGGA?CGTTGATA-3,
sucA-L-RS- rCdO rGl GAAAl I G I I AiCCGC IC AlCCAC IC ICCAAACGAGr I GAI AC-3
t
sucA-R-F^-ACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCACGGTGTCGGAAGTGCAGGAG-S'sucA-R-R 5 -TCGACATCCTGCTTGCGCACTCTTC-3(
[0026]实施例2全细胞催化剂的制备及全细胞转化过程
[0027]实施例 1中的原始枯草芽孢杆菌和敲除sucA后的重组枯草芽孢杆菌接种种子培养基(氯霉素10mg/L)，37°C，200rpm过夜培养。发酵在3L NBS发酵罐中进行，1%接种量到
1.8L发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、l.0vvm和28°C，当OD6tltl达到
0.6,加入0.41111 IPTG诱导L-氨基酸脱氨酶表达。诱导5h后,8，OOOrpm低温离心10min,收集菌体，用20mM Tris-HCl (pH8.0)缓冲液洗两遍菌体。全细胞转化体系为:L_谷氨酸15g/L,全细胞催化剂 20.0g/L,反应在 20mM Tris-HCl (pH8.0)中进行，37°C，200rpm 转化 24h。
[0028]敲除sucA后的重组枯草芽孢杆菌，其α -酮戊二酸的产量可达12.20g/L ;未敲除sucA的重组枯草芽孢杆菌，其α -酮戊二酸的产量为8.59g/L。
[0029]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种提高全细胞转化生产α-酮戊二酸产量的方法，其特征在于以重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，敲除其基因组中sucA基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组枯草芽孢杆菌为表达改造后L-氨基酸脱氨酶基因的枯草芽孢杆菌168。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述改造后L-氨基酸脱氨酶基因核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 所示，编码的突变体为 F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于敲除重组枯草芽孢杆菌中sucA基因的方法为:通过PCR方法将sucA基因上下游约1000bp及抗性标记片段约1000bp融合，抗性标记片段两端含有突变的1xP位点；将此融合产物转化枯草感受态细胞，抗生素筛选发生同源重组的菌株；最后用温敏型质粒消去抗性，实现无痕敲除。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于敲除sucA基因后此全细胞催化剂转化L-谷氨酸生产α -酮戊二酸的产量为12.20g/L。
【文档编号】C12N15/70GK103937842SQ201410146961
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】陈坚, 刘龙, 堵国成, 李江华, 嘎子侯赛因, 侯颖 申请人:江南大学