一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法
【专利摘要】一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，步骤如下：a、斜面培养：将地衣芽孢杆菌接种于斜面培养基上，在37℃下培养24h；b、制备菌悬液：用无菌水将步骤a制备的斜面菌种洗下制成菌悬液；c、一级种子培养：将步骤b中制备的菌悬液接种于装有种子培养基的一级种子罐中，在温度37℃、转速600rpm、通气量0.5vvm的条件下培养16h；d、补料分批发酵：将步骤c中制备的一级种子按照体积比10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度37℃、转速600rpm、通气量1.0vvm的条件下进行发酵，当菌体进入指数生长期后，开始匀速流加补料，补料结束后控制pH7.0-7.5，40h终止发酵；e、检测发酵单位：检测杆菌肽的发酵单位并与不补料发酵生产的杆菌肽的发酵单位进行比较。
【专利说明】一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法。
【背景技术】
[0002]杆菌肽属多肽类抗生素，是由多种氨基酸结合而成的不稳定的多肽，对革兰氏阳性菌和部分阴性菌有强烈的抑制作用，它可以抑制细菌细胞壁的合成，影响其蛋白质合成及细胞膜功能，从而达到消除病原菌的目的。杆菌肽由多个氨基酸组成，由于其高效、无毒副作用、无残留、不产生抗药性及交叉耐药性、排泄快等优点被广泛应用于畜禽养殖业。
[0003]杆菌肽发酵生产使用地衣芽孢杆菌，以玉米淀粉、豆柏粉为主要碳、氮源，培养温度为37°C，经40h耗氧发酵培养生物合成杆菌肽，但发酵水平不高，生产能耗和生产成本高，目前对微生物发酵法生产杆菌肽的研究主要是发酵培养基的优化，或者发酵条件的优化，并没有取得很好的效果；也有的工厂通过传统的诱变育种来筛选高产杆菌肽的菌株，虽然发酵单位有了一定的提高，但是菌株的活力却在不断的下降。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，其目的在于克服现有技术的不足之处，提高发酵单位，降低生产能耗和生产成本。
[0005]本发明为实 现其目的采用的技术方案是:
[0006]一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，包括以下操作步骤:
[0007]a、斜面培养:将地衣芽孢杆菌接种于斜面培养基上，在37°C下培养24h ；
[0008]b、制备菌悬液:用无菌水将步骤a制备的斜面菌种洗下制成菌悬液；
[0009]C、一级种子培养:将步骤b中制备的菌悬液接种于装有种子培养基的一级种子罐中，在温度37°C、转速600rpm、通气量0.5vvm的条件下培养16h ；
[0010]d、补料分批发酵:将步骤c中制备的一级种子按照体积比10%的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度37°C、转速600rpm、通气量1.0vvm的条件下进行发酵，当菌体进入指数生长期后，开始匀速流加补料，补料结束后控制PH7.0-7.5,40h终止发酵；
[0011]e、检测发酵单位:发酵结束后检测杆菌肽的发酵单位，并与不补料发酵生产的杆菌肽的发酵单位进行比较。
[0012]步骤a中所用斜面培养基(m/v)的成分及用量为:葡萄糖I %、蛋白胨1.5 %、牛肉膏I %、酵母浸出粉0.2 %、琼脂2.0%，培养基的pH7.0。
[0013]步骤c中所用种子培养基(m/v)的原料及用量为:黄豆饼粉3%、玉米粉2%、玉米淀粉I %、玉米浆0.5%、硫酸铵0.15%、碳酸钙0.3%，培养基的pH6.8。
[0014]步骤d中所用发酵培养基(m/v)的成分及用量为:豆柏粉9%、玉米粉2%、玉米淀粉3%、硫酸铵0.3%、硫酸镁0.003%、碳酸钙0.5%，培养基的pH7.2，发酵培养基的体积为发酵罐容积的50-80%。[0015]步骤d所述的补料(m/v)成分及用量为:豆柏粉6-9%、玉米粉0.5_1%、玉米淀粉2-3%、玉米浆0.3-0.5%、葡萄糖5-8%，补料pH为5.5-6.5，补料流加速度为每小时流加发酵液体积的1-2%，共流加发酵液总体积的10% -20%。
[0016]步骤d中补料结束后通过调节转速控制pH7.0-7.5。
[0017]本发明的有益效果是:本发明提供的方法提高了发酵水平，并且补料成分简单，价格低廉，发酵结束时检测营养物质基本被耗尽，同时缓解了对数期速效营养不足的矛盾，有利于生物量的提高，降低生产能耗和生产成本，与不补料相比杆菌肽产量有较大幅度的提闻。
【具体实施方式】
[0018]本发明提供了一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，其目的在于克服现有技术的不足之处，提高发酵单位，降低生产能耗和生产成本，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。 [0019]具体实施例1，一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，包括以下操作步骤:
[0020]a、斜面培养:将地衣芽孢杆菌接种于斜面培养基上，在37°C下培养24h ；
[0021]b、制备菌悬液:用无菌水将步骤a制备的斜面菌种洗下制成菌悬液；
[0022]C、一级种子培养:将步骤b中制备的菌悬液接种于装有IOL种子培养基的15L —级种子罐中，在温度37°C、转速600rpm、通气量0.5vvm的条件下培养16h ；
[0023]d、补料分批发酵:将步骤c中制备的一级种子按照体积比10%的接种量接种于装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，在温度37°C、转速600rpm、通气量1.0vvm的条件下培养3h后，开始以0.3L/h的速率匀速流加成分及含量为豆柏粉6%、玉米粉0.5%、玉米淀粉3%、玉米浆0.3%、葡萄糖7%的补料(m/v)，共流加3L补料，13h流加结束，然后通过调节转速将pH控制在7.0-7.5的范围之内，40h终止发酵；
[0024]e、检测发酵单位:发酵结束后检测杆菌肽的发酵单位为959U/ml，不补料发酵生产的杆菌肽的发酵单位为830U/ml。
[0025]具体实施例2，一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，包括以下操作步骤:
[0026]a、斜面培养:将地衣芽孢杆菌接种于斜面培养基上，在37°C下培养24h ；
[0027]b、制备菌悬液:用无菌水将步骤a制备的斜面菌种洗下制成菌悬液；
[0028]C、一级种子培养:将步骤b中制备的菌悬液接种于装有IOL种子培养基的15L —级种子罐中，在温度37°C、转速600rpm、通气量0.5vvm的条件下培养16h ；
[0029]d、补料分批发酵:将步骤c中制备的一级种子按照体积比10%的接种量接种于装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，在温度37°C、转速600rpm、通气量1.0vvm的条件下培养3h后，开始以0.6L/h的速率匀速流加成分及含量为豆柏粉9%、玉米粉0.6%、玉米淀粉
2.3%、玉米浆0.5%、葡萄糖5%的补料(m/v)，共流加5L补料，11.5h流加结束，然后通过调节转速将PH控制在7.0-7.5的范围之内，40h终止发酵；
[0030]e、检测发酵单位:发酵结束后检测杆菌肽的发酵单位为1036U/ml，不补料发酵生产的杆菌肽的发酵单位为830U/ml。[0031]具体实施例3，一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，包括以下操作步骤:
[0032]a、斜面培养:将地衣芽孢杆菌接种于斜面培养基上，在37°C下培养24h ；
[0033]b、制备菌悬液:用无菌水将步骤a制备的斜面菌种洗下制成菌悬液；
[0034]C、一级种子培养:将步骤b中制备的菌悬液接种于装有IOL种子培养基的15L —级种子罐中，在温度37°C、转速600rpm、通气量0.5vvm的条件下培养16h ；
[0035]d、补料分批发酵:将步骤c中制备的一级种子按照体积比10%的接种量接种于装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，在温度37 °C、转速600rpm、通气量1.0vvm的条件下培养4h后，开始以0.4L/h的速率匀速流加成分及含量为豆柏粉8 %、玉米粉I %、玉米淀粉2 %、玉米浆0.5%、葡萄糖6%的补料(m/v)，共流加4L补料，14h流加结束，然后通过调节转速将pH控制在7.0-7.5的范围之内，40h终止发酵；
[0036]e、检测发酵单位:发酵结束后检测杆菌肽的发酵单位为1100U/ml，不补料发酵生产的杆菌肽的发酵单位为830U/ml。
[0037]本发明提供的方法提高了发酵水平，并且补料成分简单，价格低廉，发酵结束时检测营养物质基本被耗尽，同时缓解了对数期速效营养不足的矛盾，有利于生物量的提高，降低生产能耗和生产成本，与不补料相比杆菌肽产量有较大幅度的提高。
【权利要求】
1.一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，其特征在于包括以下操作步骤: a、斜面培养:将地衣芽孢杆菌接种于斜面培养基上，在37°C下培养24h； b、制备菌悬液:用无菌水将步骤a制备的斜面菌种洗下制成菌悬液； C、一级种子培养:将步骤b中制备的菌悬液接种于装有种子培养基的一级种子罐中，在温度37°C、转速600rpm、通气量0.5vvm的条件下培养16h ； d、补料分批发酵:将步骤c中制备的一级种子按照体积比10%的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度37°C、转速600rpm、通气量1.0vvm的条件下进行发酵,当菌体进入指数生长期后，开始匀速流加补料，补料结束后控制pH7.0-7.5,40h终止发酵； e、检测发酵单位:发酵结束后检测杆菌肽的发酵单位，并与不补料发酵生产的杆菌肽的发酵单位进行比较。
2.根据权利要求1所述的一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，步骤a中所用斜面培养基(m/v)的成分及用量为:葡萄糖1%、蛋白胨1.5%、牛肉膏I %、酵母浸出粉0.2 %、琼脂2.0%，培养基的pH7.0。
3.根据权利要求1所述的一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，步骤c中所用种子培养基(m/v)的原料及用量为:黄豆饼粉3%、玉米粉2%、玉米淀粉I %、玉米浆0.5%、硫酸铵0.15%、碳酸钙0.3%，培养基的pH6.8。
4.根据权利要求1所述的一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，步骤d中所用发酵培养基(m/v)的成分及用量为:豆柏粉9%、玉米粉2%、玉米淀粉3%、硫酸铵0.3%、硫酸镁0.003%、碳酸钙0.5%，培养基的pH7.2，发酵培养基的体积为发酵罐容积的50-80%。
5.根据权利要求1所述的一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，步骤d所述的补料(m/v)成分及用量为:豆柏粉6-9%、玉米粉0.5-1%、玉米淀粉2-3%、玉米浆0.3-0.5%、葡萄糖5-8%，补料pH为5.5-6.5，补料流加速度为每小时流加发酵液体积的1-2%，共流加发酵液总体积的10% -20%。
6.根据权利要求1所述的一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，步骤d中补料结束后通过调节转速控制pH7.0-7.5。
【文档编号】C12P21/04GK103882081SQ201410163024
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】林青, 郭耀光 申请人:河北圣雪大成制药有限责任公司