一种板栗疫病菌分子检测试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种板栗疫病菌分子检测试剂盒及其使用方法。本发明的试剂盒包括10μmol/L的引物CP1/CP2各1μL；10μmol/L的引物SC1/SC2各1μL、ddH2O7.5μL、Premix12.5μL；其中，CP1序列为5＇－CGGCCCACTAAACTCTTTGT－3＇，CP2序列为5＇－ATTTCAGGGCCTACCGTTTT－3＇SC1序列为5＇－AACGGTGACCCTTCTGGGGC－3＇，SC2序列为5＇－AACGGTGACCGCAAAGGACTC－3＇。本发明克服RAPD稳定性差、重复性差等缺点，同时提高了病害检测的准确性；本发明可快速准确的对板栗疫病菌进行分子鉴定和板栗疫病的早期诊断，对控制板栗疫病的检疫及病害的防治具有重要意义。
【专利说明】一种板栗疫病菌分子检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，尤其涉及的是一种板栗疫病菌分子检测试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]板栗疫病是世界著名的森林病害之一，是栗树的毁灭性病害，给生产带来巨大损失。板栗疫病曾在十九世纪使美洲栗遭到全面灭种的威胁，成为植物病害摧毁自然物种的唯一典型例子。1913年，美国学者ShearC.L首次在中国东部发现板栗疫病，此后陆续在河北、山东、河南、江苏、浙江、陕西、湖南、广东、江西等地都有疫病发生。该病由板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica(Murr.)barr)引起。板栗疫病多发于树干的近地表和主枝基部，幼龄树当年发病率和枯死率较高，一旦发生防治极其困难。
[0003]板栗在四川省分布面积很广，全省水平分布东起巫山，南到德昌，西到天全，北至广元，50多个县市均有栽培。早期，由于盲目引种及栽培不当，多数栽培区出现了板栗疫病，个别地区由于病害而损失严重。为此，亟需建立快速灵敏的检测方法，为板栗疫病的防治提供依据。
[0004]随着分子生物学的飞速发展，其应用范围也越来越广。近年来分子生物学方法已广泛应用于植物病原真菌的分类鉴定中。PCR技术及基于PCR的检测方法因其具有快速、准确、灵敏的特点，使其在植物病害的检测上发挥着越来越重要的作用。双重PCR是标准PCR的发展和完善。双重PCR是指在同一反应体系里加上二对引物，同时扩增出二个核酸片段的PCR反应扩增反应。双重PCR较普通PCR具有更高的特异性和准确度，不仅具有普通PCR操作简单、快速、灵敏度高的特点，而且大大减少了因单一基因PCR扩增而出现假阳性或者检测特异性差的可能性。
[0005]国内外虽然对板栗疫病菌rDNA的ITS区域序列及生物学特性、弱毒菌株、遗传多样性、营养体亲和性等方面开展了广泛而深入的研究，但有关C.parasitica分子检测的国内外检测报道较少。Popov等开展过巢氏PCR的检测研究。Marra等用DNA杂交技术设计出栗疫菌交配型特异性引物及配套巢氏引物，用于区分两种交配型。潘琪等用栗疫菌交配型特异性引物以及配套巢氏引物PCR，用于野生菌株交配型测定。但尚未有针对板栗疫病菌的检测技术的开发，并且国内外尚未见基于ITS区域和SCAR标记技术对板栗疫病菌进行双重PCR分子检测的报道。
[0006]传统真菌的鉴定主要是通过形态学和生理生化指标。形态学鉴定菌株是普遍采用的方法，但耗时、繁琐、需要较高的专业技术知识。形态学鉴定必须是在分离培养得到病原物的基础上才能开展，对有些培养条件特殊及形态结构不易区分的一些种的鉴定上显得非常困难，且真菌种类繁多、个体多态性明显，有些真菌在生长的过程中由于受到环境的压力，其形态特征和生理生化指标发生变化，使得其形态特征复杂化，从而给分类和检测带来困难和不准确性。同工酶技术往往受到组织特异性和发育特异性的影响，准确度不高。免疫学技术在检测植物病原时，也有许多不足之处，主要是抗血清效价不高、特异性不强，因而很难达到实际应用水平。
[0007]rDNA-1TS序列分析技术已是国际上对病原真菌分类鉴定、检测及病害诊断广泛使用的技术，通过rDNA-1TS区通用引物的PCR扩增，经克隆测序获后，与现有的基因库中已知的菌株序列进行比对，进而确定其分类地位。但其序列的获得仍需要对菌株进行分离、纯化培养、提取DNA、PCR扩增、回收克隆、测序等一系列的繁琐步骤，仍不能做到病原菌的快速准确检测和鉴定。有些种属的真菌rDNA-1TS序列相似度较高仅仅依靠已有的ITS序列设计引物仍很难做到准确鉴定。因此，对有些真菌的检测仅依靠rDNA-1TS序列分析技术设计引物，可能产生假阳性。若采用双重PCR技术则可很好地解决这种问题。
[0008]RAPD (Randomly Amplified Polymorphism DNA)技术由 Williams 和 Welsh 等人基于PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。其原理是以随机引物(一般IObp)对目的基因组DNA进行非定点扩增，然后用凝胶电泳对扩增产物DNA片段进行多态性分析。RAPD对模版DNA所需量少且对设备要求简单，是广泛使用的一种分子标记技术，但RAPD易受环境条件的影响，重复性和稳定性不高，因此，通常对目地RAPD、AFLP等片段进行克隆和测序，根据序列设计引物，将其转化为更稳定的SCAR标记。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在检测板栗疫病菌中存在的不足，提供了一种板栗疫病菌分子检测试剂盒及其使用方法。
[0010]本发 明的技术方案如下:
[0011]一种板栗疫病菌分子检测试剂盒，其特征在于，其包括ΙΟμ mol/L的引物CP1/CP2各 I μ L ；10ymol/L 的引物 SC1/SC2 各 I μ L、ddH207.5 μ L、Premixl2.5μ L ;其中，CPl 序列为 5 ' - CGGCCCACTAAACTCTTTGT - 3 ;，CP2 序列为 5 ; — ATTTCAGGGCCTACCGTTTT —3 ' SCl 序列为 5 ' — AACGGTGACCCTTCTGGGGC — 3 '，SC2 序列为 5 '—AACGGTGACCGCAAAGGACTC — 3 '。
[0012]所述的板栗疫病菌分子检测试剂盒的使用方法，其步骤如下:
[0013](I)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA ；
[0014](2)所述的反应体系包含:10ymol/L的引物CP1/CP2各lyL,10ymol/L的引物SC1/SC2各 lyL;12.5yL Premix，ddH207.5 μ L ;加(I)中提取的 DNA 提取液 I μ L，组成反应混合液；
[0015](3)PCR 反应条件为:94°C预变性 4min ;94°C变性 40sec，62°C退火 30sec，72°C延伸30sec，共35个循环；72°C延伸7min ；
[0016](4)PCR产物的电泳检测:取⑶中PCR扩增产物5 μ L，在质量浓度1.5%~2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳缓冲液为1ΧΤΑΕ，100V电压下电泳20min后，经溴化乙锭染色后在紫外灯下检测结果；如果存在分子量为285bp和389bp的双片段，则判定所述菌株中或植株组织样中存在板栗疫病菌。
[0017]本发明利用RAPD-SCAR标记技术和ITS序列分析技术，设计双重PCR引物。该方法可以克服RAPD稳定性差、重复性差等缺点，同时提高了病害检测的准确性，为其它病害的分子检测提供技术参考，特别对于ITS区同源性高难以区分的种属真菌的鉴定和检测提供参考依据。本发明可快速准确的对板栗疫病菌进行分子鉴定和板栗疫病的早期诊断，对控制板栗疫病的检疫及病害的防治具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为板栗疫病菌双重PCR检测技术实现图。
[0019]图2为引物S160对板栗疫病菌及其它参试菌株标记结果；图中，泳道M为标准分子量大小，泳道CK为阴性对照，泳道1-3为板栗疫病菌，泳道4-20为其它参试菌株。
[0020]图3为双重PCR引物检测混合DNA中板栗疫病菌；图中，泳道M为标准分子量大小，泳道I是引物SC1/SC2和CP1/CP2组合成双引物对板栗疫病菌DNA溶液PCR扩增，泳道2是引物SC1/SC2对板栗疫病菌DNA溶液PCR扩增，泳道3是引物CP1/CP2板栗疫病菌DNA溶液PCR扩增，CK为阴性对照。
[0021]图4为双引物对供试菌株扩增结果；图中，引物SC1/SC2和CP1/CP2组合成双引物扩增所有供试菌株特异性结果，泳道M为标准分子量大小，CK为阴性对照，1-3为板栗疫病菌，4-20为其它参试菌株。
[0022]图5为双重PCR灵敏度检测；图中，泳道M为标准分子量大小，泳道CK为阴性对照，泳道1-8的板栗疫病菌基因组DNA浓度分别为300ng/ μ L, 30ng/ μ L, 3ng/ μ L, 300pg/ μ L,30pg/μ L,3pg/μ L,300fg/μ L,30fg/μ L。 [0023]图6为板栗疫病菌双重PCR检测流程。
[0024]图7为双重PCR引物检测田间发病植株；图中，泳道M为DL2000Marker，泳道1_3为初期发病植株，泳道4为健康植株，泳道5为具有典型症状植株，泳道6为阴性对照。
【具体实施方式】
[0025]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0026]实施例
[0027]所用主要试剂:DNA提取试剂盒及回收试剂盒均购自天根生化科技公司，DH5 α Ε.coli感受态和Premix均购自TaKaRa公司，引物合成及PCR产物测序交由上海生工生物工程公司完成。
[0028]图1为板栗疫病菌双重PCR检测技术实现图。
[0029]1、板栗疫病菌快速分子检测的双重PCR引物的设计
[0030](l)rDNA-1TS区引物:对分离自四川重庆，四川雅安，四川泸州板栗栽培区的板栗疫病菌进行纯化培养，首先将供试菌株接种于PDA培养基上，25°C温箱内黑暗条件下培养3天，然后从菌落边缘挑取3~4块5mm左右菌饼，接种于装有100mL马铃薯-葡萄糖液体(PDB)培养基的三角瓶中，25°C，125转/分钟摇床震荡培养7天。用灭菌纱布过滤，收集菌丝，灭菌蒸馏水冲洗3次，冷冻干燥后，置于_20°C冰箱中保存备用。真菌基因组DNA提取采用CTAB法或试剂盒提取。以CTAB法实现为例:
[0031]I)取IOOmg左右的新鲜菌丝，置于研钵中用液氮迅速研磨为粉末，装入1.5mL离心管；
[0032]2)加入经60°C预热后CTAB溶液900yL和90yL10%的SDS(称取IOg高纯度SDS,加80mL去离子水，68°C溶解，浓盐酸调节PH至7.2，定容至IOOmL)，充分混匀；
[0033]3) 60°C水浴lh，中间每IOmim上下颠倒混匀一次；[0034]4) 12000rpm 离心 IOmin ；
[0035]5)取上清液加入700μL体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分混匀，静置IOmin ；
[0036]6) 12000rpm 离心 IOmin ；
[0037]7)取上清液置于1.5mL新的离心管，加入等体积氯仿，充分混匀，静置5min ；
[0038]8) 12000rpm离心8min，取上清置于新的1.5mL离心管中；
[0039]9)加入2ml经预冷的无水乙醇，和0.1ml浓度为3mol/L的NaAC溶液，_20°C沉淀30min ； [0040]10) 12000rpm 离心 5min ；
[0041]11)弃上清，向沉淀部分加入700μ L经_20°C预冷的70%乙醇，充分洗涤后，置于超净工作台自然晾干至无酒精味；
[0042]12)加入50-100 μ LlXTE溶液溶解后即得到菌株DNA溶液，紫外分光光度计下检测DNA浓度。
[0043]利用真菌rDNA 基因 ITS 区通用引物 ITSl (5 ; — TCCGTAGGTGAACCTGCGC - 3 ;)和ITS4 (5 ; - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3 ;)对板栗疫病菌进行PCR扩增，扩增体系和程序如下:
[0044]25 μ L反应体系中:10 μ mol/L的ITSl和ITS4各I μ L，板栗疫病菌DNA溶液I μ L，Premixl2.5 μ L, ddH209.5 μ L。
[0045]PCR 反应程序:94°C 预变性 4min ;94°C 变性 40sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸lmin，共35个循环；最后72°C延伸7min。
[0046]PCR产物送往上海生工生物工程公司进行测序。根据测序结果(上传序列后获得GenBank登录号:KJ528274、KJ528272、KJ528273)在板栗疫病菌ITS保守区内利用软件Primer Premier6.0设计引物,通过基因库Blast比对验证引物的特异性。引物序列如下:
[0047]上游=CPlS'— CGGCCCACTAAACTCTTTGT — 3 ;
[0048]下游:CP25; - ATTTCAGGGCCTACCGTTTT — 3 '，目的片段扩增大小为 285bp。
[0049](2) RAPD-SCAR标记引物:通过对分离自四川地区的重庆，雅安，泸州栽培区的板栗疫病菌、近缘种及其它真菌共计20株(见表1)。基因组DNA提取参照(I)(同I (I) CTAB法)中方法。
[0050]表1板栗疫病菌及其它参试菌株
[0051]
【权利要求】
1.一种板栗疫病菌分子检测试剂盒，其特征在于，其包括10 μ mo I/L的引物CP1/CP2各lyL;10ymol/L 的引物 SC1/SC2 各 I μ L、ddH207.5 μ L、Premixl2.5 μ L ;其中，CPl 序列为5 ; — CGGCCCACTAAACTCTTTGT - 3 ;，CP2 序列为 5 ; — ATTTCAGGGCCTACCGTTTT - 3 ; SCl序列为 5 ; — AACGGTGACCCTTCTGGGGC - 3 ;，SC2 序列为 5 ; — AACGGTGACCGCAAAGGACTC —3 ; ο
2.根据权利要求1所述的板栗疫病菌分子检测试剂盒的使用方法，其特征是，其步骤如下: (1)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA； (2)所述的反应体系包含:10ymol/L的引物CP1/CP2各lyL，10ymol/L的引物SCl/SC2各I μ L ;12.5 μ L Premix, ddH207.5 μ L ;加(I)中提取的DNA提取液I μ L，组成反应混合液； (3)PCR反应条件为:94°C预变性4min ;94°C变性40sec，62°C退火30sec，72°C延伸30sec，共35个循环；72°C延伸7min ； (4)PCR产物的电泳检测:取(3)中PCR扩增产物5 μ L，在质量浓度1.5%~2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳缓冲液为1ΧΤΑΕ，100V电压下电泳20min后，经溴化乙锭染色后在紫外灯下检测结果；如果存在分子量为285bp和389bp的双片段，则判定所述菌株中或植株组织样中存在板栗疫 病菌。
【文档编号】C12Q1/04GK103966324SQ201410181647
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】朱天辉, 麻文建, 朱涵明月, 李姝江, 谯天敏, 张静, 彭艳, 罗蓉 申请人:四川农业大学