一种板栗疫病菌巢式pcr检测试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种板栗疫病菌巢式PCR检测试剂盒及其使用方法。本发明的试剂盒包括(1)10×PCR?Buffer，其成份为100mmol·L-1Tris-HCl，PH8.3，500mmol·L-1KCl；(2)2.5mmol·L-1的dNTP；(3)25mmol·L-1的MgCl2；(4)5U·μL-1Taq酶；(5)10μmol·L-1的引物ITS1/ITS4，其中ITS1序列为5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇，ITS4序列为5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇；(6)10μmol·L-1的引物ITSP1/ITSP2，其中ITSP1序列为5＇-CCAGATACCCTTTGTGAACT-3＇，ITSP2序列为5＇-TCAGAGTCTTAGCGAGCC-3＇；(7)灭菌双蒸水。本发明采用ITS1/ITS4和ITSP1/ITSP2组成巢氏PCR，可检测到3fg·μL-1基因组DNA，灵敏度至少可提高1000倍。利用本发明的试剂盒能准确地从板栗自然发病的及携菌组织中检测到病原菌。
【专利说明】—种板栗疫病菌巢式PCR检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，尤其涉及的是一种板栗疫病菌巢式PCR检测试剂盒及其使用方法。
【背景技术】 [0002]板栗疫病(chestnut blight)是世界著名森林病害之一，也是我国林业检疫有害生物之一。其病原为栗疫病菌C.parasitica,主要危害中国板栗(Castanea mollissima)、欧洲板栗(C.sativa Mill.)、维栗(C.henryi (skan)Rehd.et ffils.)、美洲板栗(Gastaneadentate Marsh.)等山毛榉科植物。病原主要以伤口侵入方式为主,症状主要表现为主干、分枝及小枝上出现烂皮、溃疡，严重时整个枝条甚至全株枯死。该病于1904年首次在美洲发现，由于危害严重和蔓延迅速，在其后半个多世纪中致使欧美栗树遭到了毁灭性的灾害。板栗疫病在亚洲也普遍发生，中国在1913年也发现了该病，随后各地陆续有报道，部分地区由于病害严重造成林木质量和果实产量严重下降，损失极为严重。板栗疫病在自然发病的情况下不易被发现，待其症状出现后，再采取防治措施已为时已晚，且现阶段对该病尚无有效的根除手段。板栗疫病作为一种检疫性病害，目前我国对该病的检疫方法仍是靠病原形态，病害特征等来判断，这些方法费时且难以识别潜伏期病害。因此，有必要建立快速、准确和高效率的检测方法。
[0003]PCR技术的发展推动了植物病原菌鉴定和病害诊断工作。近年来，利用病原菌核糖体内转录间隔区(ITS)序列设计引物进行病原菌鉴定、检测和病害诊断的技术，使得分子检测在植物病原检测这一领域的应用越来越广泛。目前，国内对c.parasiticaa分子检测的工作尚未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在检测板栗疫病菌中存在的不足，提供了一种板栗疫病菌巢式PCR检测试剂盒及其使用方法。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]一种板栗疫病菌巢式PCR检测试剂盒，其包括⑴10XPCR Buffer,其成份为 IOOmmol.!/1Tris-HCl, PH8.3，500mmol.!/1KCl ; (2)2.5mmol.I/1的 dNTP ； (3) 25mmol.I/1 的 MgC12 ； (4) 5U.μ IZ1Taq 酶；(5) 10 μ mol.I/1 的引物 ITS1/ITS4，其中 ITSl 序列为 5 ; -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ;，ITS4 序列为
5; -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ; ; (6) 10 μ mol.L-1 的引物 ITSP1/ITSP2，其中 ITSPl 序列为 5 ; -CCAGATACCCTTTGTGAACT-3 ;，ITSP2 序列为 5 ; -TCAGAGTCTTAGCGAGCC-3 ; ； (7)灭菌双蒸水。
[0007]所述的板栗疫病菌巢式PCR检测试剂盒的使用方法，其步骤如下:
[0008](I)板栗组织DNA提取
[0009]采集疑似病害的板栗枝干组织，用刀片切取约IOOmg小块组织，表面用70%酒精消毒后蒸馏水冲洗，用吸水纸吸干后，置于研钵中用液氮研磨成粉末，进行DNA提取，提取步骤参见TIANGEN公司Plant Genomic DNA Kit试剂盒说明书；
[0010](2)第一轮扩增
[0011]利用引物ITSl和ITS4对步骤(1)中提取的DNA进行扩增，其PCR反应体系为:反应的混合液体总体积为25 μ L，其中2.5 μ LlO XPCR Buffer, 10 μ mol.171的引物ITS1/ITS4各 0.8 μ L，2 μ L2.5mmol.171 的 dNTP, 2 μ L25mmol.171 的 MgCl2,0.2 μ L5U.μ L-1Taq 酶，模板DNA提取液I μ L,加灭菌双蒸水补足25 μ L ;将反应混合液于Mastercycler Personal PCR仪上进行扩增，程序为94°C预变性4min ;94°C变性40sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，共35个循环；72°C延伸IOmin ；
[0012](3)第二轮扩增
[0013]取(2)中第一轮扩增产物稀释100倍，作为第二轮扩增的模板DNA提取液，利用引物ITSP1/ITSP2对 其进行扩增；其PCR反应体系为:反应的混合液体总体积为25 μ L，其中 2.5 μ LlO XPCR Buffer, IOymol.L-1 的引物 ITSP1/ITSP2 各 0.8μ L，2y L2.5mmol.L-1的 dNTP, 2 μ L25mmol. 1 的 MgCl2,0.2 μ L5U.μ T1Taq 酶，模板 DNA 提取液 I μ L,加灭菌双蒸水补足25 μ L，以灭菌水代替模板DNA设置阴性对照；将反应混合液于MastercyclerPersonal PCR 仪，PCR 反应程序为:94°C预变性 4min ;94°C变性 40sec，60°C退火 30sec，72°C延伸40sec，共35个循环；72°C延伸7min ;反应结束后取5 μ L PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在紫外灯或凝胶成像系统下观察条带，如果存在462bp的条带，则判断所检测组织样品中含有板栗疫病菌，反之则不存在该菌。
[0014]本发明采用ITS1/ITS4和ITSP1/ITSP2组成巢氏PCR，可检测到3fg.μ L—1基因组DNA，灵敏度至少可提高1000倍。利用本发明的试剂盒能准确地从板栗自然发病的及携菌组织中检测到病原菌。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为引物ITS1/ITS4扩增结果；图中，M:DL2000marker ；CK:阴性对照;1_3:L-l，L-2，L-3 ；4-20:YA，LX-1，GL4-1, , GL4-2, GL4-3, GL5-1, GL1-1, GL1-2, YUNI, YUN2 ,LSI,GL1-3，LX-3, GL-2, GL5-2，YANG I, LX-2。
[0016]图2为引物ITSP1/ITSP2特异性检测结果；图中，M:DL2000marker ；CK:阴性对照；1-3:L-1, L-2, L-3 ;4_20:YA, LX-1，GL4-1，GL4-2，GL4-3，GL5-1，GL1-1，GL1-2，YUN1, YUN2,LSI，GL1-3，LX-3, GL-2, GL5-2，YANG I, LX-2。
[0017]图3为PCR灵敏度检测；其中，A:巢氏PCR检测不同浓度基因组DNA ;M:DL2000marker ;1 ~9:PCR 检测基因组浓度分别为:30ng.μ L-1, 3ng.μ L-1, 300pg.μ L-1,30pg.μ L \ 3pg.μ L S 300fg.μ L S 30fg.μ L \ 3fg.μ L \ 300ag.μL SB:常规 PCR扩增不同浓度基因组DNA ；M:DL2000marker ;1~9同A。
[0018]图4为引物ITSP1/ITSP2检测板栗枝干组织中C.parasitica ;图中，M:DL2000marker ;1_7:1TS1/ITS4 扩增结果;8_14:巢氏 PCR 扩增结果，15-21:常规 PCR 扩增结果；22:阳性对照(C .parasitica);其中1，8，15为新枯死组织；2，9，16为典型发病组织；3，10，17感染初发病组织；4，11，18为感染未发病组织；5，12，19病株残体；6，13，20为健康组织；7，14，21为阴性对照。【具体实施方式】
[0019]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0020]实施例1
[0021]病原菌及其它供试菌株分离自发病板栗枝干组织，编号、菌种及来源详见表1。
[0022]表1供试菌株及其来源
[0023]
【权利要求】
1.一种板栗疫病菌巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括⑴IOXPCRBuffer,其成份为 IOOmmol.L^1Tris-HCl, PH8.3,500mmol.L-1KCl ； (2)2.5mmol.L-1的 dNTP ； (3) 25mmol.L 1 的 MgCl2 ； (4) 5U.μ L 1Taq 酶；(5) 10 μ mo I.L 1 的引物 ITS1/ITS4，其中 ITSl 序列为 5 ; -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ;，ITS4 序列为5 ; -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ; ; (6) 10 μ mol.L-1 的引物 ITSP1/ITSP2，其中 ITSPl 序列为 5 ; -CCAGATACCCTTTGTGAACT-3 ;，ITSP2 序列为 5 ; -TCAGAGTCTTAGCGAGCC-3 ; ； (7)灭菌双蒸水。
2.根据权利要求1所述的板栗疫病菌巢式PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，其步骤如下: (1)板栗组织DNA提取 采集疑似病害的板栗枝干组织，用刀片切取约IOOmg小块组织，表面用70%酒精消毒后蒸馏水冲洗，用吸水纸吸干后，置于研钵中用液氮研磨成粉末，进行DNA提取，提取步骤参见TIANGEN公司Plant Genomic DNA Kit试剂盒说明书； (2)第一轮扩增 利用引物ITSl和ITS4对步骤(1)中提取的DNA进行扩增，其PCR反应体系为:反应的混合液体总体积为25 μ L，其中2.5 μ LlO XPCR Buffer, 10 μ mol.L-1的引物ITS1/ITS4各0.8 μ L, 2 μ L2.5mmol.L-1 的 dNTP, 2 μ L25mmol.L-1 的 MgCl2,0.2 μ L5U.μ L-1Taq 酶，模板 DNA提取液I μ L,加灭菌双蒸水补足25 μ L ;将反应混合液于Mastercycler Personal PCR仪上进行扩增，程序为94°C预变性4min ;94°C变性40sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，共35个循环；72°C延伸IOmin ； (3)第二轮扩增 取(2)中第一轮扩增产物稀释100倍，作为第二轮扩增的模板DNA提取液，利用引物ITSP1/ITSP2对其进行扩增；其PCR反应体系为:反应的混合液体总体积为25 μ L，其中2.5 μ LlO X PCR Buffer, 10 μ mol.L-1 的引物 ITSP1/ITSP2 各 0.8 μ L，2 μ L2.5mmol.L-1的 dNTP, 2 μ L25mmol.L-1 的 MgCl2,0.2 μ L5U.μ T1Taq 酶，模板 DNA 提取液 I μ L,加灭菌双蒸水补足25 μ L，以灭菌水代替模板DNA设置阴性对照；将反应混合液于MastercyclerPersonal PCR 仪，PCR 反应程序为:94°C预变性 4min ;94°C变性 40sec，60°C退火 30sec，72°C延伸40sec，共35个循环；72°C延伸7min ;反应结束后取5 μ L PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在紫外灯或凝胶成像系统下观察条带，如果存在462bp的条带，则判断所检测组织样品中含有板栗疫病菌，反之则不存在该菌。
【文档编号】C12Q1/68GK103966325SQ201410181681
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】朱天辉, 麻文建, 朱涵明月, 李姝江, 谯天敏, 张静, 彭艳, 罗蓉 申请人:四川农业大学