一种烟草NtGt1a基因单碱基替换突变的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草NtGt1a基因单碱基替换突变的检测方法，以烟草突变群体的DNA序列为模板，设计NtGt1a基因特异性引物，通过PCR仪进行扩增，扩增后PCR产物首先高温变性，缓慢降低温度复性，然后利用限制性内切酶CELI进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对酶切后产生3条电泳带的最高分子量电泳条带进行测序，将测序结果与NCBI发布的NtGt1a序列进行比对，确定发生突变的类型，本发明的检测方法具有准确快速，易操作，重复性高，通量大的优点。
【专利说明】-种烟草NtGtla基因单碱基替换突变的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种烟草NtGtla基因单碱基替换突变的检 测方法。
【背景技术】
[0002] 生物基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的物质基础，是生物多样性的基本 变异来源。单碱基替换突变指的是DNA分子中，一碱基对被另一碱基对所替换的现象，包 括转换和颠换两种方式，是DNA序列中最常见的的变异。当前，在烟草遗传育种中，使用分 子标记的新型育种技术是提高育种工作效率和加快获得优良品系的有效方法。应用分子标 记育种首先需要在DNA水平上筛选到与烟草经济性状密切相关的遗传标记，例如与多叶性 状，抗旱性，抗病性等性状相连锁的基因。其次是建立筛查基因多态性的检测平台，最终实 现分子标记辅助育种的最终目的。
[0003] 近年来，DNA单碱基多态性（SNP)检测方法的发展是日新月异。主要包括以测序为 基础的方法，基于分子杂交的方法，以及利用碱基突变引起的DNA片段差异作为SNP检测靶 标的方法。以测序为基础的方法是分析SNP的黄金标准，既能发现已知的SNP，也能检测到 未知的SNP。但是需要大规模的提取基因组，构建测序文库，上机测序。最后需要专业的技 术人员应用运算能力强大的计算机对测序结果分析。此方法步骤多而且分散，实验试剂昂 贵，工作量大，不适宜大群体的检测。而基于分子的方法需要短的核苷酸探针在和互补的目 的片段进行杂交时，在完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体稳定性的不同而将 SNPs位点检测出来。此方法价格昂贵，不是通用的方法，对于一般的分子实验室实用性不 大。利用碱基突变引起的DNA片段差异作为SNP检测靶标的方法的主要步骤是利用PCR扩 增遗传群体或突变群体中不同个体的某一 DNA片段，再使用限制性内切酶对扩增的DNA片 段进行酶切，产生不同类型的电泳图谱，最后对产生不同类型电泳图谱的DNA片段进行测 序，与原来序列进行比对分析，从而确定碱基突变的位置。此方法具有准确快速，易操作，重 复性高，通量大的优点。
【发明内容】
[0004] 本发明解决的问题是目前DNA单碱基多态性（SNP)检测方法步骤多而且分散，实 验试剂昂贵，工作量大，不适宜大群体的检测，本发明在于提供一种烟草NtGtla基因单碱 基替换突变的检测方法，本方法具有准确快速，易操作，重复性高，通量大，有益于推广。
[0005] 本发明采用的技术方案，包括以下步骤：以烟草突变群体的DNA序列为模板，设计 NtGtla基因特异性引物，通过PCR仪进行扩增，扩增后PCR产物首先高温变性，缓慢降低 温度复性，然后利用限制性内切酶CELI进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 其中未发生突变的样品为1条电泳带，发生突变的样品为3条电泳带，对酶切后产生3条 电泳带的最高分子量电泳条带进行测序，利用生物信息学方法，将测序结果与NCBI发布的 NtGtla序列进行比对，确定发生突变的类型，所述的烟草NtGtla基因特异性引物为： 上游引物NtGtla-F: 5' - CAACCTGAGACCTCTGTTAGTATG -3' 24bp 下游引物NtGtla-R: 5' - CCTTCTAATAACGCTGCTCTACT -3' 23bp 。
[0006] 所述的PCR反应体系为：PCR反应体系体积为20 μ L，体系包含14. 9 μ L ddH20， 2 μ L 10 倍 PCR 缓冲液，L 6 μ L dNTPs (10mM)，上游引物 NtGtla-F (λ 2 μ L，下游引物 NtGtla-R 0· 2 μ L (10 μ Μ )，ExTaq 酶为 0· 1 μ L ; 所述的PCR反应条件：预变性94°C 5min，40个扩增循环（94°C 30 s，58°C 30 s，72°C 30s)延伸72°C 10 min，然后95°C 10 min迅速变性，72°C 20s，每个循环降低0. 3°C直至 20°C，最终缓慢变性，形成错配杂合双链。
[0007] 所述的酶切是在PCR产物中加入从芹菜中提取出的CELI酶进行酶切，酶切体系 为 4.5yL ddH20，1.5yL 10倍 PCR缓冲液，lyL CELI，8yLPCR 产物，酶切条件是在 42°C 下酶切30分钟。
[0008] 所述的PCR产物酶切的琼脂糖凝胶浓度为3%。
[0009] 本发明达到的技术效果：本发明的技术方法在于采用一种烟草NtGtla单基因碱 基突变检测方法的应用，可用于烟草分子标记辅助育种，通过将不同的突变位点与烟草的 不同性状进行关联分析，确定基因点突变与性状的对应关系，最终达到烟草的良种选育。
[0010] 本发明能够准确快速检测突变群体中NtGtla的单碱基突变，研究表明DNA序列中 单碱基突变会造成较大的遗传效应，引起较大的表型性状改变，所以本发明在分子育种和 遗传多样性评价等方面的研究具有广大的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1 :本发明实施例1中烟草NtGtla基因第1外显子区域1172bp PCR产物经CELI 酶切前的3%琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】 [0012]
[0013] 下面结合【专利附图】
【附图说明】对本发明烟草NtGtla基因单碱基替换突变的检测方法做进一 步详细描述。本发明的实施例是为了更清楚的说明本发明，以使公众对
【发明内容】
从整体上 得到充分的理解，而非对本发明保护范围的限定。
[0014] 实施例1 (一）CELI核酸酶粗提物的获得 1、 取500g生殖生长期的泰国黄芯芹菜叶片，用冷的ddH20仔细清洗，然后擦干叶片上 的水滴，放入榨汁机后得到的匀浆经滤纸过滤备用， 2、 将获得的芹菜汁放入离心机；3100rpm离心20分钟，将上清转入新离心管， 3、 在上清液中加入Tris和PMSF，使其终浓度分别为0. 1 M Tris-HCl，pH 7. 7和100 μ M PMSF。向上清液中加入硫酸铵，溶液终浓度为25%， 4、 每升上清液需加入144g硫酸铵，搅拌30分钟，9000rpm离心50分钟，收集上清，再 加入固体硫酸铵，使上清液中硫酸铵最后浓度达到80%，缓慢搅拌30 min后9000rpm离心 70分钟，轻轻倒弃上清溶液，保留沉淀， 5、 将上一步获得的沉淀重悬于1/10初始体积的0. 1 M Tris-HCl pH 7. 7，0. 5 M KC1 和100 μ M PMSF缓冲液中，确保全部沉淀都溶解， 6、把重悬的蛋白溶液加入到透析袋（cutoff: lOOOODa)中置于Tris-HCl pH 7. 7，0. 5 M KC1和100 μ M PMSF透析缓冲液中进行透析，每小时换一次透析缓冲液，8小时透析结束 后，将透析袋内的溶液倒入干净的离心管，分装后在_80°C保存备用。
[0015] (二）烟草基因组DNA提取 收集贵烟1号突变群体的烟草叶片样品，_8〇°C保存。烟草基因组DNA提取过程具体步 骤如下： 1. 收集3g烟草叶片放于2ml离心管中，加入液氮，研磨成粉末状； 2. 加入800 yL DNA提取缓冲液，振荡器震荡均匀，加入5 yL RNA酶（10mg/ml); 37 °C水浴锅水浴30 min ; 3. 加入800 μ L苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1 )，震荡混匀，12000 rpm，离心10 min， 吸取上清约650 μ L至一个新的2ml管； 4. 加入650 μ L氯仿，混合均勻，12000 rpm，离心10 min,吸取上清约450 μ L至一 个新的1.5 ml管； 5. 加入45 μ L 3M乙酸钠 （pH = 4. 8)，450 μ L异丙醇；轻轻混匀，DNA析出，呈絮状 沉淀，-20°C放置30 min; 12000 rpm，离心10 min;弃上清,70%酒精600 μ L清洗沉淀 物；12000 rpm，离心 10 min ; 6. 倒掉上清，通风橱内干燥30 min; 7. 重悬在100 yLddH20中，轻轻吸打至溶解，-20°C保存。
[0016] (三）NanoDrop微量紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度 以100ng/ μ L作为标准DNA浓度，若测定的DNA浓度在90-110ng/ μ L之间，表明DNA浓 度符合实验要求；浓度高于ll〇ng/μ L需要稀释成标准浓度；浓度过低的需重新提取DNA。
[0017] (四）构建8倍DNA混合池 用NanoDrop微量紫外分光光度计测定1712个已提取的烟草DNA浓度，均一化处理，使 得烟草DNA浓度为100ng/ μ L，8个DNA样品中各取5 μ L构建8倍DNA混合池。
[0018] (五）烟草NtGtla编码序列的PCR扩增 1、引物设计 根据烟草NtGtla基因在NCBI数据库上的基因序列（登录号：AB052557. 1)，利用 PRMER 5设计烟草NtGtla基因特异性PCR引物，引物序列如下： 上游引物 NtGtla-F: 5' - CAACCTGAGACCTCTGTTAGTATG -3' 24bp 下游引物 NtGtla-R: 5' - CCTTCTAATAACGCTGCTCTACT -3' 23bp 该引物对扩增烟草NtGtla第1外显子区域，片段大小为1172bp。
[0019] 2、PCR 扩增 (1) PCR反应体系如表1所示 表1 PCR反应体系
【权利要求】
1. 一种烟草NtGtla基因单碱基替换突变的检测方法，其特征在于：以烟草突变群体的 DNA序列为模板，设计NtGtla基因特异性引物，通过PCR仪进行扩增，扩增后PCR产物首先 高温变性，缓慢降低温度复性，然后利用限制性内切酶CELI进行酶切，对酶切产物进行琼 脂糖凝胶电泳检测，对酶切后产生3条电泳带的最高分子量电泳条带进行测序，将测序结 果与NCBI发布的NtGtla序列进行比对，确定发生突变的类型，所述的烟草NtGtla基因特 异性引物为： 上游引物NtGtla-F: 5' - CAACCTGAGACCTCTGTTAGTATG -3' 24bp 下游引物NtGtla-R: 5' - CCTTCTAATAACGCTGCTCTACT -3' 23bp 。
2. 根据权利要求1所述的烟草NtGtla基因单碱基替换突变的检测方法，其特征在于： 所述的PCR反应体系为：PCR反应体系体积为20 μ L，体系包含14. 9 μ L ddH20, 2 μ L 10倍 PCR缓冲液，1.6yL dNTPs，上游引物 NtGtla-F 0.2yL，下游引物 NtGtla-R 0.2yL，ExTaq 酶为0. lyL。
3. 根据权利要求1所述的烟草NtGtla基因单碱基替换突变的检测方法，其特征在 于：所述的PCR反应条件：预变性94°C 5min，40个扩增循环：94°C 30 s，58°C 30 s，72°C 30s，延伸72°C 10 min，然后95°C 10 min迅速变性，72°C 20s，每个循环降低0. 3°C直至 20°C，最终缓慢变性，形成错配杂合双链。
4. 根据权利要求1所述的检测烟草NtGtla基因单碱基突变的检测方法，其特征在于： 利用限制性内切酶CELI进行酶切的具体条件为在PCR产物中加入从芹菜中提取出的CELI 酶进行酶切，酶切体系为4. 5yL ddH20，1.5yL 10倍PCR缓冲液，lyL CELI，8yLPCR产 物，酶切条件是在42°C下酶切30分钟。
5. 根据权利要求1所述的检测烟草NtGtla基因单碱基突变的检测方法，其特征在于： 其特征在于，所述的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测的琼脂糖凝胶浓度为3%。
【文档编号】C12Q1/68GK104232749SQ201410208059
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年5月18日 优先权日:2014年5月18日
【发明者】付强, 邹颉, 陈洪 申请人:贵州省烟草科学研究院