三个抗草丁膦水稻细胞质型谷氨酰胺合成酶突变体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及草丁膦的抗性显著增强的谷氨酰胺合成酶，其是由野生型水稻细胞质型谷氨酰胺合成酶经体外定向分子进化得到的突变体。突变体编号、氨基酸序列和对应氨基酸突变位点分别为：OsGS1m1，SEQIDNo2，G245S/G318V；OsGS1m2，SEQIDNo4，N54S/S115F/G245S；OsGS1m3，SEQIDNo6，V200A/T293A/R295K。对比草丁膦对酶活抑制常数Ki，突变体OsGS1m1、OsGS1m2、OsGS1m3分别比野生型谷氨酰胺合成酶的抗性提高了43.7、19、87.5倍。通过这三个突变基因在酿酒酵母中的功能验证，进一步证明了这三个基因中的表达能提高酿酒酵母对草丁膦的耐受性（从10mM提高到100mM以上）。因为酵母表与植物表达模式非常接近，所以在酵母中的功能验证结果表明三个突变体在培育抗草丁膦植物方面有很好的应用潜力。
【专利说明】三个抗草丁膦水稻细胞质型谷氨酰胺合成酶突变体
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，具体涉及一组由人工合成的野生型水稻谷氨酰胺合成酶经DNA改组(DNA shuffling)技术得到的突变基因，该组基因编码的谷氨酰胺合成酶对草丁膦的抗性显著增强。该发明所述的基因可用于构建转化植物的表达载体。
【背景技术】
[0002]转基因抗草丁膦作物是仅次于抗草甘膦作物的第二位抗除草剂作物，已商业化的耐草丁膦作物有玉米、油菜、甜菜、棉花等。2001年加拿大种植的400万公顷油菜中，80%是抗除草剂品种，其中抗草甘膦油菜占47 %，抗草丁膦油菜占13 %。草丁膦的杀草原理是它能抑制谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS),使氨在植物体内迅速积累,光合作用和光呼吸停止，叶绿体受损，从而导致杂草死亡。常规作物不具有降解草丁膦的能力，如果直接接触，草丁膦会杀死常规作物。耐草丁膦作物(商品名叫Liberty Link作物)含有来源于微生物的ifer或基因。这两个基因编码的草丁膦乙酰转移酶(PAT)能够催化乙酰辅酶A与草丁膦游离氨基结合，降解被植物吸收的草丁膦，从而消除草丁膦对谷氨酰胺合成酶抑制和植物氨代谢的干扰，赋予植物对草丁膦的耐性。Bar基因来自于潮湿链霉菌(5:hygroscopicus'),板pat基因则来自于绿色产色链霉菌(51 Viridochromogenes')。尽管两个基因来源不同，但它们很相似。耐草丁膦作物之所以能够抗草丁膦是因为这种作物具有分解草丁膦的能力，也就是说，草丁膦在接触谷氨酰胺合成酶之前就被草丁膦乙酰转移酶分解掉。为了提高ifer 基因在植物的表达，大多数生产上利用的基因都经过了密码子偏爱改造，但是氨基酸序列没有变化。虽然，小鼠喂毒试验结果表明草丁膦乙酰转移酶能在胃和肠道中彻底分解，在食用过程中不会出现潜在的危害。但是，由于该基因来源于微生物，而不是来源于农作物本身，不同程度上都会造成消费者的抵触心理。
[0003]由于谷氨酰胺合成酶是草丁膦的靶标酶，尽管Bar能快速降解草丁膦，但是草丁膦在接触谷氨酰胺合成酶之前很难彻底将其分解，因为很多谷氨酰胺合成酶分布在细胞膜上，因此草丁膦在转Bar基因农作物上应用时，会不同程度地干扰植物的氮代谢，同时影响植物正常的生长和发育。目前抗草甘膦除草剂农作物的培育大多使用对除草剂不敏感的
基因。但是尚未见对草丁膦不敏感的谷氨酰胺合成酶基因及其商业应用的研究报道或专利，推测可能的原因是自然界缺乏草甘膦分解酶，而bar则对草丁膦具有很强的分解效果。植物中过量表达野生型谷氨酰胺合成酶只能部分缓解草丁膦伤害，如将豌豆来源的野生型^基因转化小麦，转基因植株可以缓解草丁膦的伤害，但耐性程度不足以商业化应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供三个草丁膦抗性提高的水稻细胞质型谷氨酰胺合成酶突变基因及其制备方法，所述突变基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No K SEQ ID No3、SEQID No 5所示；所述突变基因的氨基酸序列分别如SEQ ID No 2, SEQ ID No4、SEQ ID No 6所示；其对应的氨基酸突变位点分别为:G245S/G318V、N54S/S115F/G245S、V200A/T293A/R295K。这三个突变基因编码的谷氨酰胺合成酶对草丁膦的抗性显著增强。通过所述的突变基因在酿酒酵母中的表达和草丁膦耐受性的验证，表明改组基因具有构建植物表达载体，获得耐草丁膦植物的应用潜力。
[0005]为达到上述目的，本发明主要采用如下技术方案:
根据已知的水稻细胞质型谷氨酰胺合成酶基因{OsGS\, Genbank登录号AB037595)为基础，人工合成了该基因并构建到大肠杆菌表达载体PYM4807，进一步采用DNAshuffling技术建立随机突变文库，并转化缺陷型菌株JW3841-1，通过在不同浓度草丁膦(20-200 mM) M9固体培养基上的培养，筛选得到对草丁膦抗性提高的突变体。经序列测定，得到如SEQ ID No 1-6所示的核苷酸和氨基酸序列。突变体的编号和对应氨基酸突变位点分别为:0sGSlml，G245S/G318V ；0sGSlm2, N54S/S115F/G245S ；0sGSlm3, V200A/T293A/R295K。对比草丁膦对酶活抑制常数4，突变体OsGSlml、0sGSlm2、0sGSlm3分别比野生型谷氨酰胺合成酶的抗性提高了 43.7、19、87.5倍。通过这三个突变基因在酿酒酵母中的功能验证，进一步证明了这三个基因中的表达能提高酿酒酵母对草丁膦的耐受性(从10 mM提高到100 mM以上)。因为酵母菌iSeiccheiromycGS cerevisiae)不仅具有原核系统生长快、容易培养和易于遗传操作等优点，而且具有典型真核系统的特性，具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠等翻译后加工等过程，其表达模式与植物表达模式非常接近，所以在酵母中的功能验证结果表明三个突变体在培育抗草丁膦植物方面有很好的应用潜力。
[0006]与现有技术相比，本发明的创造性在于:
利用生长快、容易培养和易于遗传操作的原核系统筛选对草丁膦抗性提高的突变体，避免了因植物生长周期过长带来的麻烦，提高了筛选效率；同时本发明还采用与植物表达模式接近的酿酒酵母验证了突变体的功能。
[0007]有益效果
本发明提供的对草丁膦的抗性显著增强的突变基因，具有用于构建转化植物的表达载体，培育抗草丁膦转基因作物的应用潜力。
[0008]
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1转化突变与OsGSl的大肠杆菌在不同浓度草丁膦M9固体培养基的生长情况的比较。草丁膦的浓度分别为0、10、25、75、100、200 mM。
[0010]图2突变与OsGSl核苷酸序列比对。
[0011]图3突变与OsGSl氨基酸序列比对。
[0012]图4突变体和OsGSl序列和酶活特性的比较。
[0013]图5转化突变与OsGSl的酿酒酵母在不同浓度草丁膦SD-Trp固体培养基的生长情况的比较。草丁膦的浓度分别为0、10、20、50、100禮。
[0014]
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
[0016]本发明实施中未注明的实验方法，如连接、转化、相关培养基的配制等参照分子克隆实验指南第三版(黄培堂等译，中国，科学出版社，2002)中方法进行。大肠杆菌谷氨酰胺合成酶缺陷型菌株JW3841-1 (glnA732::Kan)由美国耶鲁大学大肠杆菌菌株保存中心(CGSC#10775)提供;质粒 pBluescrip SK+购自美国 Stratagene 公司；pYM4807 载体由实验室自行构建保存(徐虎等，Characterizat1n of a Glucose-, Xylose-, Sucrose-,and D-Galactose -Stimulated b-Glucosidase from the Alkalophilic BacteriumBacillus, Curr Microb1l, 2011, 62:833-839);扩增使用的 KOD FX taq 酶购自日本Toyobo公司；所需引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，PYF1274载体购自上海永业农科生物工程有限公司；其它未注明的化学药品为分析纯级，购自上海国药集团有限公司。
实施例
[0017]1、构建含有重组的细胞质型水稻谷氨酰胺合成酶基因的表达质粒
以细胞质型水稻谷氨酰胺合成酶基因基因(GenBank Access1n N0.AB037595)为模板，在南京金斯瑞生物科技有限公司合成野生细胞质型水稻谷氨酰胺合成酶基因，该基因经及丽TI和fee I双酶切后，以正确的阅读框插入到大肠杆菌表达载体PYM4807中，获得含有野生细胞质型水稻谷氨酰胺合成酶基因的质粒，定义为pYM4807-0sGSl。
[0018]2 DNA改组方法构建野生细胞质型水稻谷氨酰胺合成酶基因OsGSl基因突变文库
2.1突变文库的构建
I)基因的扩增:根据已知的PYM4807载体序列，用Primer 5.0设计Pl(GAGACGGTCACAGCTTGTCTG)和 P2(ATGCCTGGCAGTTCCCTACTC)两条引物用于 PCR 反应。反应体系包括:1 μ L质粒pYM4807-0sGSl ；4 μ L 2.5 mmol/L dNTPs ；5 μ L 1XPCR Buffer ；0.3μ L rTaq ;引物各IyL ;补充ddH20至50 μ L0 PCR反应条件为，94预变性1min; 94 °C变性30s，72°C退火30s和延伸1.5 min，共35个循环，1.5%琼脂糖胶回收1.5 Kb的基因片段，回收产物用入 100 μ L DNase I 缓冲液(50mmol/L Tris-Cl pH7.4+1 mmol/L MgCl2)溶解。
[0019]2)DNase I酶解:在回收的基因片段里加入0.1 U DNase I, 30°C酶解3 min，经80°C处理1min失活DNase I后，用12%丙烯酰胺凝胶电泳对酶解产物进行分离，最后用透吸袋法回收50-1OObp的小片段。
[0020]3)无引物 PCR (Primerless PCR):反应体系包括 25 μ L 小片段 DNA ；4 μ L 2.5mmol/L dNTPs ;5 μ L 1XPCR Buffer ；0.3 μ L rTaq ；15.7 μ L ddH20;反应程序为，94 预变性 2 min; 94°C变性 30s, 42°C退火 30s ；72 °C延伸 2 min，共 45 个循环，1% Agrose 电泳检测PCR扩增结果。
[0021]4)有引物PCR(Primer PCR):用I μ L无引物PCR扩增产物为模板，其它参照步骤I)进行PCR扩增，回收1.5 kp扩增产物。
[0022]5)扩增产物经3W//I和feci双酶切后，以正确的阅读框插入到大肠杆菌表达载体PYM4807中，通过电击转化大肠杆菌DH5 α感受态，获得水稻谷氨酰胺合成酶基因AsM的首轮突变文库。
[0023]2.2突变文库的多轮构建和筛选
将实施例2.1所述的突变文库转化到缺陷型菌株JW3841-1后，涂布在含有20 mM草丁磷的M9平板上，28 ° C培养48 h。用牙签挑取10个正常生长的单菌落，抽取质粒作为模板按照实施例2.1继续建第二轮突变文库；将第二轮突变文库涂布在含有50 mM草丁磷的M9平板上筛选，同样挑取10个正常生长的单菌落，抽取质粒作为模板建第三轮的突变文库；在此基础上，建立第四轮的突变文库，涂布在200 mM草丁磷的M9平板上筛选，经回转验证，最终得到能抵抗此浓度的3个突变体(图1)，编号分别为:0sGSlml、0sGSlm2、0sGSlm3。经序列测定，得到所述突变体的核苷酸序列，分别如SEQ ID No K SEQ ID No3、SEQ ID No5所示，通过比对发现核苷酸发生了如图2所示的改变；经翻译得到其编码的氨基酸序列，分别如SEQ ID No 2、SEQ ID No4、SEQ ID No 6所示，通过氨基酸序列比对发现其对应的氨基酸突变位点分别为:G245S/G318V、N54S/S115F/G245S、V200A/T293A/R295K (图 3，图 4)。
[0024]3突变体酶活特性研究
3.1蛋白表达和纯化
将野生型和实施例2.3得到的含有谷氨酰胺合成酶突变基因的质粒分别转入大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)中，涂布于含有Ap (氨苄青霉素，100 Pg/ml)的2YT固体培养基中，37 1:培养过夜至长出菌落。挑取新鲜转化的的3-4个克隆，接入100 ml含有Ap (100Kg/ml)抗生素的LB液体培养基中，用250ml摇瓶，37°C震摇培养至0D600值达到0.6-1.0。将摇瓶置于冰上5分钟，5000g 4°C离心5分钟收集菌体。重悬细胞于5ml预冷的破碎缓冲液(100 mM This-盐酸缓冲液，0.5M NaCl,0.5mg/ml 溶菌酶，ImM PMSF, ImM MgC12)中。把混合菌体在冰水中用超声破碎仪破碎。破碎好的菌液经12000 rpm，4°C离心30分钟后，收集上清。用0.45 μ m的滤膜过滤后，滤液用N1-NTA柱进行亲和层析纯化。
[0025]具体纯化过程为:用1.5 mL平衡缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 300mM NaCl,and 10 mM imidazole)平衡N1-NTA柱5次；吸取1.5 mL滤液上样，待完全流出N1-NTA柱后，1.5 mL 清洗缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5，300mM NaCl, and 20 mM imidazole)清洗五遍；最后用 I mL 洗脱缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5，300mM NaCl, and 250 mMimidazole)洗脱2次。含有目的蛋白的洗脱液置于透析液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5，0.1mM EDTA, and 10% glycerol)透析12 h后，用于SDS-PAGE电泳和测定酶活。
[0026]32酶活测定
谷氨酰胺合成酶酶活测定反应液组分为:100 mM Tris-HCl (pH 7.5)，20 mM ATP, 10mM L-glutamate, 30 mM hydroxylamine, 20 mM MgCl20 190 Μ.1 反应液 35。C 预热分钟后，加入10 μL酶液开始反应，反应30 min后，加入200 μL显色液(55 g/L FeCl3.6H20,20 g/L三氯乙酸，2.1%浓盐酸)终止反应。测定在540nM的光吸收值。酶活定义为每分钟释放出I Mmol Y-谷氨酰羟肟酸所需要的酶量。
[0027]3.3抑制常数&测定
在含不同浓度的草丁膦(0、20、50、100 μΜ)的测活体系中，改变底物L-glutamate的浓度(2、4、8、12、16、32、50 mM),测定不同底物下的酶促反应速度，通过Lineweaver - Burk双倒数作图，分别计算草丁膦对水稻野生型谷氨酰胺合成酶和突变体的抑制常数，结果祥见图4。
[0028]4.突变体在酿酒酵母中的功能验证4.1酿酒酵母表达载体的构建和转化
将上述突变体连接入酵母表达载体pYF1274(此载体为大肠杆菌一酿酒酵母的穿梭载体，带有大肠杆菌的colEl复制起点和氨苄(Ap)抗生素筛选标记；同时带有酵母复制起点(centromere，CEN)，和编码TRP合成酶的标记基因，因此在不含色氨酸的培养基上筛选酵母转化子。PYF1274酵母表达载体带有酵母PGK强启动子和ADCl基因终止子，在启动子下游插入了 630 bp的Cm抗性基因，可以替换成其他的外源基因，实现外源基因在酿酒酵母中的高效表达)，连接后得到的质粒分别用于酿酒酵母EGY48 (MATa, his3, trpl,ura3-52, leu::pLeu2_LexAop6)的转化。
[0029]酿酒酵母转化选用醋酸锂法。5 ml酿酒酵母于30°C过夜培养至0D600为0.5左右，扩大培养至50ml，再生长4个小时后，5000rpm/分离心8分钟收集细胞。以20ml无菌水洗，然而把离心收集的酵母以1ml现配的TE/LiAc (100 mM LiAc in TE)洗一次。7000转/分离心8分钟后,最终将酵母悬于0.5ml的TE/LiAc中。50 μ I的酵母悬液中加入Iyg的质粒DNA、50 μ g的鲑鱼精DNA及300 μ I含40%PEG3350的TE/LiAc溶液，充分混匀后于30°C保温30分钟。接着于42°C热激15分钟。离心收集的酵母重悬于TE溶液中，并涂于不含色氨酸的酵母选择培养基。
[0030]4.2功能验证
挑取在不含色氨酸的酵母选择培养基生长正常的克隆，接种到SD液体培养基中，28 ° C培养过夜，收集菌样，分别稀释到相同的浓度，取50 μ L转接到含有不同浓度草丁膦的I mlSD-Trp液体培养基中。28 ° C振荡培养36 h后观察生长情况。结果表明这三个基因中的表达能提高酿酒酵母对草丁膦的耐受性(从10通提高到100 mM以上)(图5)，因酿酒酵母和植物的表达模式类似，表明三个突变体在培育抗草丁膦植物方面有很好的应用潜力。
[0031]以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
【权利要求】
1.三个对草丁膦抗性显著提高的水稻谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，其由如SEQID No USEQ ID No3, SEQ ID No 5所示的核苷酸酸序列编码。
2.权利要求1所述突变体，其特征在于，其氨基酸序列分别如SEQID No 2,SEQ ID No4、SEQ ID No 6 所示。
3.含有权利要求 1所述突变基因的酵母和植物表达载体及其应用。
【文档编号】C12N15/81GK104164441SQ201410207844
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年5月17日 优先权日:2014年5月17日
【发明者】赵伟, 姚泉洪, 彭日荷 申请人:上海市农业科学院