一种叶绿体铁转运基因NtPIC1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了烟草（Nicotianatabacumcv.SR-1）叶绿体铁转运基因NtPIC1及其编码蛋白在叶绿体铁转运中的应用。该基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示；其对应的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示；它包含849bp的开放阅读框，编码282个氨基酸，预测的分子量为29.7kDa。其开放阅读框核苷酸序列在GeneBank上的登录号为KF640606。通过GFP融合蛋白细胞定位分析NtPIC1蛋白定位在叶绿体膜上。酵母功能互补实验证明该基因在酵母中的表达可有效的转运铁离子。本发明将所述基因NtPIC1导入到烟草中，获得了叶绿体高铁含量的转基因烟草，研究结果表明NtPIC1基因参与叶绿体铁转运及叶绿体的发育过程。
【专利说明】-种叶绿体铁转运基因 NtPICI及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及烟草叶绿体铁转运基因 NtPICI的克隆及其在烟草叶绿体铁转运中的 应用，属于植物基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 铁是植物正常生命活动所必需的微量元素，位居植物必需微量元素的首位。铁参 与多种生命活动代谢过程，包括光合作用，呼吸作用，叶绿素合成，是亚铁血红素和铁硫蛋 白的重要成分。铁离子具有活跃的二价与三价的变化，是细胞内电子传递链所必需的组分。
[0003] 尽管地壳中的铁丰度很高，但土壤中可利用的Fe2+由于受土壤溶液pH值及氧分压 的影响会形成不可溶的Fe 3+，从而限制了土壤中铁的有效性，也限制了地球表面的大量金属 铁的可利用性。在许多国家的干旱、半干旱地区的石灰性土壤及盐碱土壤上广泛存在着植 物缺铁问题。植物缺铁失绿症是一个世界性植物营养失调问题，也是植物营养学研究的热 点之一。植物缺铁会导致叶绿素合成减少，光合速率降低，严重缺铁时叶绿素合成停止，新 叶变黄，生物量大幅度下降。植物缺铁不仅影响植物的生长发育，也造成巨大的经济损失， 而且影响动物和人类对铁的获取，从而导致许多缺铁性疾病的发生。人类铁营养的缺乏已 经成为当今世界最为严重的营养缺素症之一。当人体由于某种原因不能摄入足量的铁营养 时，就会引起如Wilson、Pakinson、Menken及贫血病（anemia)等许多生理功能异常疾病，危 及患者智力和体能的发育及身体健康。
[0004] 在高等植物中叶绿体是光合作用的位点，提供生命所必需的氧和碳。叶绿体含有 叶肉细胞80%以上的铁，而类囊体膜上含有叶子中的60%的铁，叶绿体作为植物细胞中铁含 量最丰富的系统，是金属铁离子主要的存在部位。因此，叶绿体中铁的吸收及利用与植物的 生长和发育息息相关。第一个叶绿体铁转运基因 PIC1首先在拟南芥中被发现，在其他物种 中未见报道。铁离子转运在铁代谢过程中起关键作用，对植物生长、发育和抗逆性具有重要 的意义。烟草（Nicotiana tabacum)作为世界上重要的经济作物，它的质量和产量受到铁的 严重影响。对于烟草叶绿体铁转运基因的获得与研究将为从基因工程培育高效铁吸收品种 提供重要的理论基础，具有深远的实践意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一个烟草（Nicotiana tabacum cv. SR-1)叶绿体铁转运基因 NtPICI及其在烟草叶绿体铁转运中的应用。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的： 本发明通过RT-PCR的方法从烟草中克隆得到了 NtPICI基因的全长cDNA，该基因的核 苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。
[0007] 本发明所述的基因 NtPICI，其在GeneBank中的登录号为KF640606。
[0008] 本发明提供的NtPICI基因结构特性分析表明：NtPICI基因 cDNA全长为849bp，该 基因编码282个氨基酸，蛋白分子量为29. 7kDa，NtPICI是疏水蛋白，含有基本的等电点，有 四个跨膜结构域，包含70个氨基酸的叶绿体定位转运肽。经Southern blot检测该基因 在烟草中为单拷贝基因。将其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，发现与AtPICl (拟南芥， AY057510)相比，氨基酸同源性为60%。采用GFP融合蛋白细胞定位的方法，分析表明该基 因定位在叶绿体膜上。酵母功能互补实验证明该基因在酵母中的表达可以有效的转运铁。
[0009] 将本发明的烟草NtPICl应用于叶绿体铁转运，具体为将含有本发明NtPICl基因 的植物表达载体导入到烟草中，培育筛选得到NtPICl过表达植株转基因植物。
[0010] 具体步骤为：1)将烟草叶绿体铁转运基因 NtPICl核苷酸序列置于CaMV35S启动 子之下，构建植物表达载体；2)将表达载体转入农杆菌LBA4404感受态细胞；3)利用2)获 得的转化子转化烟草，获得转基因烟草植株。
[0011] 通过Real-time PCR方法对NtPICl在过表达转基因烟草中的表达量进行了检测。 结果显示，所获得的转基因植株中NtPICl的表达量显著提高。对获得的转基因烟草进行叶 绿体铁含量和叶绿素含量的测定，经分析表明，转基因植株与野生型相比较，叶绿体铁含量 和叶绿素含量显著升高，叶片颜色呈明显深绿色。并且通过叶绿体亚显微观察，NtPICl过 表达转基因植株的叶绿体中类囊体膜堆叠更加密集且含有大量的淀粉粒，反应了更强的光 合作用。综上所述，本发明获得的NtPICl是一个叶绿体铁转运蛋白，位于叶绿体膜上，不仅 对铁在叶绿体中的转运及叶绿体的发育起到重要作用，还具有重要的经济价值。
[0012] 本发明首次公开了一种烟草叶绿体铁转运基因 NtPICl，并获得了编码该基因的蛋 白氨基酸序列，同时运用分子生物学及基因工程技术证实了烟草NtPICl参与叶绿体铁转 运及叶绿体的发育。同时基于此研究结果，为通过基因工程或分子育种提高叶绿体铁吸收 利用和富集提供了必要的理论依据和技术支持，具有较大的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 序列表SEQ ID NO: 1是本发明克隆的NtPICl基因的核苷酸序列，序列长度为 849bp。
[0014] 序列表SEQ ID NO: 2是NtPICl基因编码的氨基酸序列。
[0015] 图1为NtPICl蛋白的叶绿体膜定位结果。a-d表示GFP空载体转化原生质体；e-h 表示GFP-NtPICl融合蛋白定位在叶绿体膜上。
[0016] 图2为表达NtPICl的酵母转化株的异源功能互补结果。
[0017] 图3为qRT-PCR分析过表达株系的NtPICl表达量。
[0018] 图4为转基因烟草表型及叶绿体铁含量和叶绿素含量的测定。a为转基因植株的 表型；b为转基因植株叶绿体的铁含量；c为转基因植株的叶绿素含量。WT，烟草野生型；0X， 过表达株系。
[0019] 图5为转基因烟草叶绿体透射电镜显微观察。a-c野生型对照；d-f NtPICl过表 达植株。c，f分别是b，e中矩形部分的放大图像；S，淀粉颗粒。
【具体实施方式】
[0020] 下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0021] 下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0022] 实施例1、一种烟草叶绿体铁转运基因 NtPICl全长cDNA克隆。
[0023] 从 NCBI 数据库中（（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)搜索烟草的 EST 序列并保 存，用数据库中已知的拟南芥AtPICl序列在BioEdit软件中对保存的烟草EST序列文本文 件进行Local Blast，这样就获得了烟草中PIC1基因 EST序列。利用该序列设计引物，引物 为： NtPICl-Fl :5'-CGAACAAAACTAGCTATGCAAAC-3' ； NtPICl-Rl :5'-GACTCCCAATCACTTCATGC-3'。
[0024] 具体流程如下： RNA的提取：利用TRIZ0L试剂盒提取烟草（Nicotiana tabacum cv. SR-1)幼叶RNA，反 转录为cDNA，并以此cDNA为模板RT-PCR扩增NtPICl全长序列。
[0025] RT-PCR反应：用KOD-plus DNA聚合酶（Toyobo)进行RT-PCR反应，反应程序： 94°C 预变性 2min ;94°C 变性 15sec ;57°C 退火 30sec ;68°C 延伸 50sec ;25 个循环；72°C 延伸10min。将RT-PCR产物5'末端磷酸化，将磷酸化后的片段克隆到pBluescriptll sk+(Stratagene, California, USA)质粒载体中的EcoRV位点。重组质粒转化到大肠杆菌 DH5a (Toyobo)中，将插入的核苷酸序列利用 CEQ8000 DNA Sequencer (Beckman Coulter, California, USA)进行测序。
[0026] 最终鉴定得到NtPICl基因0RF的全长序列。NtPICl基因 cDNA全长为849bp,该 基因编码282个氨基酸，蛋白分子量为29. 7kDa，NtPICl是疏水蛋白，含有基本的等电点， 有四个跨膜结构域，包含70个氨基酸的叶绿体定位转运肽。经Southern blot检测该基因 在烟草中为单拷贝基因。将其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，发现与AtPICl (拟南芥， AY057510)相比，氨基酸同源性为60%。
[0027] 实施例2、烟草叶绿体铁转运基因 NtPICl亚细胞定位。
[0028] 一、载体构建 首先PCR获得含NtPICl基因编码区全长的序列（不含终止子)，所用引物为含有BamHI 和Sac I酶切位点： NtPICl-BamHI ：CGCGGATCCATGCAAACTCTACTCTTG ； NtPICl-SacI-1: CGAGCTCTGCAATCCTTGGTAC。
[0029] 将PCR产物用SacI酶切，回收片段进行平滑处理：DNA 2WL，K0D 1. 5μ?， 10 XBlunting Buffer 4μ?，Η20 5μ?。平滑反应条件：72°C保温5min，立即4°C冷却以停止 平滑反应。酚氯仿回收平滑产物。然后再用BamHI酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收 酶切产物；PBI221 (Biovector)载体先用Smal酶切，产生平末端，酚氯仿回收酶切产物；再 用BamHI酶切，回收酶切产物。通过T4 DNA连接酶16°C保温连接PCR酶切产物与载体，过 夜。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子质粒，送去测序，得到NtPICl-GFP 表达载体。
[0030] 二、原生质体瞬时转化 1、原生质体转化主要试剂如下： 酶解液：纤维素酶 Rl〇〇.2g、离析酶 R10 (YakultHonsha, Tokyo, Japan) 0.015g、甘露 醇 1. 09g、水 7mL、0. 3M KC1 lmL、0. 3M MES lmL (pH 5· 7)，以上药品混匀 55°C加热 10min，冷 却至室温后加入 〇· 15M CaCl2 lmL、L 5% BSA lmL。
[0031] PEG 溶液（40%，v/v) :PEG4000 (Fluka, #81240) lg、H20 0· 75mL、0. 8M 甘露醇 0· 625mL、1M Ca (N03) 2 或 CaCl2 0· 25mL。
[0032] W5 溶液（pH 5. 8) :NaCl 9. 0g、CaCl2 18. 4g、KC1 0· 37g、葡萄糖 0· 9g、MES 0· 3g，力口 入蒸馈水并用蒸馈水定容至lOOOmL。
[0033] 1&11%溶液（？!15.6):说1%(：121.51^、1^5 0.18、甘露醇7.38，加入蒸馏水并用蒸馏 水定容至lOOmL。
[0034] 2、原生质体瞬时转化具体操作如下： MS培养基上萌发烟草（Nicotiana tabacum cv. SR-1)种子，取4周苗龄烟草的叶片，约 90片，切成1mm宽的长条。准备好一个90mm培养皿，称1. 82g D -甘露醇于20ml双蒸水 中。培养皿的盖子用来切叶片。将切好的长条，置于甘露醇溶液中。可以一边切一边从植 株上取。将切好的细条从甘露醇溶液中捞出，置于酶解液中。黑暗，23°C，40-50rpm酶解3 小时。酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15mL离心管(直径约lcm) 中，均分为两管。4°C，60g，15min。弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4mL。4°C， 100g，lmin。弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4mL。冰上放置30min。23°C， 100g，lmin。弃上清，每管沉淀用0. 5mLMaMg重悬，即为得到的原生质体溶液。取约10-20ug GFP-NtPICl质粒于1. 5mLEP管中，加100uL提取的原生质体。用200uL枪头(剪去前端)轻 柔混匀。加入110uLPEG/Ca2+溶液，轻柔混匀。放置20-30min。加入0. 44mLW5溶液，来回 颠倒混匀。23°C，100g，lmin。弃上清，加 lmL W5,混匀。上述混合液体置于六孔板内，23°C， 弱光，孵育6-18小时。利用激光共聚焦扫描显微镜TCS-SP5 (Leica Lasertechnik GmbH, Heidelberg, Germany)进行突光观察。
[0035] 图1结果表明NtPICl-GFP融合蛋白荧光信号在叶绿体边缘，说明NtPICl蛋白定 位在叶绿体膜上。
[0036] 实施例3、烟草叶绿体铁转运基因 NtPICl功能分析。
[0037] 一、酵母表达载体的构建 利用以下一对引物，在NtPICl 5'和3'端分别引入BamHI，SacI酶切位点： NtPICl-BamHI ：CGCGGATCCATGCAAACTCTACTCTTG ； NtPICl-SacI-2: CGAGCTCTCATGCAATCCTTGGTAC。
[0038] 将PCR产物用SacI酶切，回收片段进行平滑处理：DNA 2WL，K0D 1. 5μ?， 10 XBlunting Buffer 4μ?，Η20 5μ?。平滑反应条件：72°C保温5min，立即4°C冷却以停止 平滑反应。酚氯仿回收平滑产物。再用BamHI酶切，得到的PCR产物用1%凝胶电泳鉴定， 胶回收。酵母表达载体PYES2. 0 (购自Invitrogen)先用Notl酶切，经过平滑处理（同上)， 再用BamHI酶切，胶回收酶切产物。将PCR酶切产物与载体通过T4 DNA连接酶16°C保温 连接过夜，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子质粒。经鉴定，得到含有 NtPICl基因的酵母表达载体。
[0039] 二、酵母的转化及鉴定。
[0040] 1、酵母转化主要试剂如下： (1) lXPEG/LiAc :50% (w/v)PEG3350 8mL、10XTE buffer lmL、10XLiAc lmL。
[0041] (2) 10XTE Buffer :100mM Tris-HCl、10mM EDTA，pH=7. 5,121°C高压灭菌，室温保 存。
[0042] (3) ΙΧΤΕ/LiAc :10XTE buffer lmL、10XLiAc lmL、ddH20. 8mL。
[0043] (4) YPD培养基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，若制固体培养基，加入2%琼脂 粉。121°C，20min，高压灭菌。
[0044] 注：葡萄糖，酵母膏，蛋白胨溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养 基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。葡萄糖可以过滤除菌，也可以115°C，15min灭菌。
[0045] (5) SC-minaral medium 培养基：参照 pYES2. 0 user Manual (Invitrogen，Cat. no.V825 - 20)。
[0046] 2、酵母转化使用常规醋酸锂转化方法(参照clontech《Yest Protocols Handbook》），构建好的酵母表达载体pYES-NtPICl转化高亲和和低亲和铁转运的双突变体 DEY1453 (由中国农业大学，左元梅教授惠赠)，和野生菌株BY4741 (由浙江大学，郑绍健教 授惠赠)。转化子在SC-minaral medium平板上进行筛选。28?培养2天，挑取单克隆，进行 菌落PCR鉴定。
[0047] 三、异源互补功能验证 具体操作如下：挑DEY1453和BY4741 YPD单菌落到SC培养基中，28°C过夜摇菌。向 20mL新的SC培养基中加适量菌液，调节0D600值为0. 2,接着摇4小时左右，取lmL菌液离 心30S，去上清，加 lmLIO X TE涡旋混匀，离心30S，去上清，重复2遍后加 lmL灭菌水重复洗 两遍，最后加30〇μ?灭菌水涡旋混匀，测定0D600值，用灭菌水将0D600值稀释调节为1，然 后依次稀释10倍，得到0D600值分别为0. 1，0. 01，0. 001浓度梯度的菌液，然后分别将该菌 液依次点1〇μ?于SC-ura-(分别含有〇μΜ，1〇μΜ，15μΜ，2〇μΜ FeC13)平板，放置30°C培养 室，培养3-4天，比较酵母的生长情况。DEY1453 (fet3fet4)是酵母铁吸收的低亲和系统 FET4,以及高亲和系统FET3-FTR的基因发生了突变，但当外源相应基因 pYES-NtPICl转入 并表达后可以弥补它们的功能，使得酵母能够生长。如图2所示，在不同浓度FeCl3的培养 基中，转入pYES-NtPICl的fet3fet4酵母长势明显好于转入空载体pYES的fet3fet4酵母 生长，说明NtPICl能够有效转运铁。
[0048] 实施例4、NtPICl的应用。
[0049] 一、表达载体的构建 重组过表达载体pBI121-NtPICl的构建 利用含有BamHI，SacI酶切位点的引物： NtPICl-BamHI :5'-CGCGGATCCATGCAAACTCTACTCTTG-3' ； NtPICl-SacI-2 :5'-CGAGCTCTCATGCAATCCTTGGTAC-3' 扩增整个NtPICl蛋白的cDNA片段，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。PCR产物序列 进行鉴定然后用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切上述PCR产物，回收酶切产物，将该 酶切产物与经过同样酶切植物表达载体PBI121得到的载体骨架连接，得到连接产物。将 连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子质粒，送去测序，将该载体命名为 pBI121-NtPICl，得到重组表达载体。
[0050] 二、转基因植物的获得及鉴定 1、转基因株系的获得 将重组过表达载体pBI121-NtPICl经农杆菌介导的圆盘法转化转入烟草（Nicotiana tabacumcv. SR-1)中。
[0051] 2、转基因烟草株系的NtPICl基因荧光定量PCR (qRT-PCR)检测 将上述转基因烟草用qRT-PCR的方法进行检测，所用的引物为： NtPIClup :5'-GCAGCGGCTTTCGTTTCAGT-3' ； NtPICllow :5'-CAGCAGCACCCATTCCCAGA-3'。
[0052] 作为内参的GAPDH引物为： GAPDHup :5'-GGAAAGTCCTACCAGCATTG-3' ； GAPDHlow :5'-ATCTATTGTCTCCCACGAAG-3'。
[0053] RNA的提取：用植物RNA抽提试剂盒(天根生化科技有限公司，上海）提取烟草总 RNA，然后利用Revertra Ace (Toyobo)试剂盒反转录合成cDNA。
[0054] qRT-PCR 体系：荧光定量 qRT-PCR 利用 7300 Biosystem，根据 SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)说明书进行操作。反应体系：总体积2〇μ?包括SYBRPremix ExTaq II 1〇μ? ;反转 录 cDNA 2μ? ;1〇μΜ 的引物各 0· 8μ? ;水 6· Ομ? ;R0X Reference Dye (50χ) 0· 4μ?。利用 2-AAct 方法计算表达量。
[0055] 结果如图3所示，筛选出NtPICl表达量显著升高的阳性过表达NtPICl转基因烟 草植株 6 个株系分别是 0X1，0X11，0X13, 0X19, 0X30, 0X33。
[0056] 上述株系均为阳性转基因植物。分别选择其中的三个株系作为以下实验材料，过 表达株系为0X1, 0X13, 0X33。
[0057] 三、转基因株系的叶绿体铁含量及叶绿素含量的测定 1、 叶绿体铁含量测定 所用试剂： MCBI (pH 8. 0):0· 3M 甘露糖、50mM HEPES、2mM EDTA*2Na、β -巯基乙醇 348μ?、0· 6% PVP (聚乙烯吡咯烷酮)、0. 1%BSA。
[0058] MCBII (pH 8. 0) :0· 32M 甘露糖、0· 5mM HEPES、2mM EDTA-2Na。
[0059] 具体操作如下： 取1. 0g新鲜叶片，用剪刀将其剪碎，研磨成匀浆，加入5mL预冷提取缓冲液MCBI，匀浆 搅拌直到成为均匀的混合物。用4层纱布过滤掉残渣，收集滤过液。200g4°C离心lmin，弃 沉淀。转移上清至干净的管中，3000g离心7min，弃上清。每管加入2mLMCBI重悬，轻轻地 上下颠倒混匀，避免气泡，可用枪将沉淀吸打混匀。小心地将悬液平铺在50〇μ? 40% Percoll 溶液上。缓慢贴管壁加入，分层。3000g 4°C离心6min，小心去上清，用枪头吸净深绿色物质 并将其转移至干净的管中。加入等体积MCBI，3000g4°C离心lmin。弃上清，向沉淀中加入 lmL MCBII溶液，溶解沉淀，即获得完整的叶绿体溶液。在获得的lmL叶绿体溶液里，加入 95%的乙醇4mL，2000r/min处理5min，A652测定其叶绿素含量。然后取lmL加入lmL邻二 氮杂菲和lmL对苯二酚处理半个小时，A510测定总铁含量。（单位g+ugGhir^FWr 1)。
[0060] Chl=A652* (26/34. 5) *5 叶绿体铁含量（g+ugGhiri^WrOz (A510+0. 00069)八0· 0975*FW*chl) 注：全部为冰上操作 2、 参照《现代植物生理学实验指南》，采用丙酮法测定烟草的叶绿素含量： (1)叶绿素提取：称取叶片0. lg，剪碎后液氮研磨，粉末转移至大离心管中，lmL 80%丙 酮洗研钵，重复2-3次，直至研钵无色，洗液均转至大离心管中，13000rpm，离心3min，取上 清至15mL离心管，避光保存。沉淀再加 lmL 80%丙酮吹打混勻，13000rpm，离心3min，取上 清，重复此步骤直至沉淀为白色。
[0061] (2)样品测定：混匀上述上清，测量体积，取3ml，紫外分光光度计645nm和663nm 下分别测量其吸光值，80%丙酮做空白对照。
[0062] (3)结果计算：Ca=12. 72XA663 - 2· 59XA645 ;Cb=22. 88XA645 - 4· 67XA663 ; Ca+b=8. 02XA663+20. 21XA645 叶绿素含量（mg/g*FW) =色素浓度（mg/L) X提取液总量（mL) Χ1(Γ3/样品鲜重（g) 如图4所示，过表达NtPICl转基因烟草叶绿体铁含量和叶绿素含量显著高于野生型。 说明NtPICl参与叶绿体铁的转运。并且从表型上观察发现，NtPICl过表达植株的叶片呈 现深绿色。
[0063] 四、叶绿体亚显微结构分析 具体操作如下： 分别取野生烟草和转基因烟草叶片，切成横切面为小于0.5mm的细长条；通过抽 真空浸泡在2. 5 %戊二醛中固定，清洗后，再用1 %锇酸后固定；经常规方法用系列乙 醇脱水后，用Epon812树脂包埋，超薄切片；经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色；于Hitachi H7650FA(100kVTEM, http://www.hitachi_hta.com)透射电镜观察、拍照。
[0064] 结果如图5 :NtPICl过表达植株的叶肉细胞中含有大量的叶绿体并且类囊体片层 结构堆叠更加密集，叶绿体中含有大的淀粉颗粒，间接反映了 NtPICl过表达植株的光合作 用更强。这些说明NtPICl影响了叶绿体的发育。 〈110>哈尔滨师范大学 〈120> -种叶绿体铁转运基因 NtPICl及其应用 <130> <160> <210> 1 <211> 849 <212> DNA 〈213> 烟草（Nicotiana tabacum) <400> 1 atgcaaactc tactcttgcc gtcggctcac tccgtcaccg gcagtgcgcc atcagctctt 60 tcctcggccg gaaaaccatg tcggcataat ttccttggac gccaaattac cctaatttct 120 tcgccctcat cattatcttt atctccctta aagacaaagc ctctttcttt gccccagttt 180 agtctcataa acaaacggtc cagaatatta gcttctgctc ccctttctcc accctacact 240 tccccaaatg acgagtctga aaaagctaaa ttagctcagg ttgcgaaaag actacagaat 300 actgcaaggt acttcaagag attgggtagt ctagggtttt ggggacagct ggtatgtacg 360 cttgttgctg cggtgatcct ttcattttct gttgttatta cggggaatat tacatctccc 420 ttcacattct actcaactgc gggtggaatt gcagcggctt tcgtttcagt tttttggtca 480 ttcggctata ttcgcttgtc tgaaaagctt cggaggacag ctaatgagcc ttcaaaggct 540 cctcctcgtg ctgacgttgt gaaaagcttg aagaatggaa tagtggtgaa ccttctggga 600 atgggtgctg ctgtacttgg catgcaagca actgtcggat cgttggtggc taaggctctt 660 accacctcag ctaatccata tagtattact cctggaagta gccccgtgct tgctttggat 720 gtatttctgg ttcaggcatc agcaaatact atcgttgcac actttctagg tctagtattc 780 tcattggagc tgttgcgctc tgtcaccttg ccaccttcag aaggcattcc ggtaccaagg 840 attgcatga 849 〈210〉 2 〈211〉282 〈212〉PRT 〈213> 烟草（Nicotiana tabacum) 〈400〉 2 Met Gin Thr Leu Leu Leu Pro Ser Ala His Ser Val Thr Gly Ser Ala 15 10 15 Pro Ser Ala Leu Ser Ser Ala Gly Lys Pro Cys Arg His Asn Phe Leu 20 25 30 Gly Arg Gin lie Thr Leu lie Ser Ser Pro Ser Ser Leu Ser Leu Ser 35 40 45 Pro Leu Lys Thr Lys Pro Leu Ser Leu Pro Gin Phe Ser Leu lie Asn 50 55 60 Lys Arg Ser Arg lie Leu Ala Ser Ala Pro Leu Ser Pro Pro Tyr Thr 65 70 75 80 Ser Pro Asn Asp Glu Ser Glu Lys Ala Lys Leu Ala Gin Val Ala Lys 85 90 95 Arg Leu Gin Asn Thr Ala Arg Tyr Phe Lys Arg Leu Gly Ser Leu Gly 100 105 110 Phe Trp Gly Gin Leu Val Cys Thr Leu Val Ala Ala Val lie Leu Ser 115 120 125 Phe Ser Val Val lie Thr Gly Asn lie Thr Ser Pro Phe Thr Phe Tyr 130 135 140 Ser Thr Ala Gly Gly lie Ala Ala Ala Phe Val Ser Val Phe Trp Ser 145 150 155 160 Phe Gly Tyr lie Arg Leu Ser Glu Lys Leu Arg Arg Thr Ala Asn Glu 165 170 175 Pro Ser Lys Ala Pro Pro Arg Ala Asp Val Val Lys Ser Leu Lys Asn 180 185 190 Gly lie Val Val Asn Leu Leu Gly Met Gly Ala Ala Val Leu Gly Met 195 200 205 Gin Ala Thr Val Gly Ser Leu Val Ala Lys Ala Leu Thr Thr Ser Ala 210 215 220 Asn Pro Tyr Ser lie Thr Pro Gly Ser Ser Pro Val Leu Ala Leu Asp 225 230 235 240 Val Phe Leu Val Gin Ala Ser Ala Asn Thr lie Val Ala His Phe Leu 245 250 255 Gly Leu Val Phe Ser Leu Glu Leu Leu Arg Ser Val Thr Leu Pro Pro 260 265 270 Ser Glu Gly lie Pro Val Pro Arg lie Ala 275 280
【权利要求】
1. 一种烟草叶绿体铁转运基因 NtPICl，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO :1所 /_J、1 ο
2. 根据权利要求1所述的烟草叶绿体铁转运基因 NtPICl，其特征在于：该核苷酸序列 编码的氨基酸序列为SEQ ID NO : 2所不。
3. 含有权利要求1所述基因的表达载体。
4. 按照权利要求3所述的表达载体，其特征在于：该表达载体是植物表达载体 pBI121-NtPICl及酵母表达载体pYES2. 0-NtPICl ;其中，所述的NtPICl核苷酸序列为SEQ ID NO :1 所示。
5. 扩增权利要求1所述基因全长或其任意片段的引物对。
6. 权利要求1所述基因、权利要求2所述蛋白在烟草叶绿体铁转运中的应用。
7. 根据权利要求6所述应用，其特征在于：构建所述烟草NtPICl基因的过表达载体并 转化烟草，获得叶绿体铁含量升高的转基因烟草。
8. 根据权利要求7所述转基因烟草，其特征在于：1)所述转基因植物的叶绿体铁含量 多于所述目的植物；2)所述转基因植物的叶绿素含量多于所述目的植物；3)所述转基因植 物的叶肉细胞中含有大量叶绿体，类囊体膜堆叠更加紧密并含有大量淀粉颗粒，所述目的 植物具体为野生型烟草。
【文档编号】C12N15/81GK104120136SQ201410225697
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】郭长虹, 龚勋, 于典司 申请人:哈尔滨师范大学