能源作物荻抗盐基因MsVP2及其植物表达载体和构建方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学领域，涉及荻耐盐基因MsVP2及其表达载体和构建方法。MsVP2基因的序列为SEQ?ID?NO.1，所构建的表达载体pEarleyGate103-MsVP2是由MsVP2基因插入到克隆载体pMD19-T?simple?vector，经Sal?I和Not?I双酶切后连接到gateway入门载体pENTR1A的Sal?I和Not?I位点，pENTR1A-MsVP2质粒经线性化后与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应得到的。本发明提供的荻MsVP2是一个新的抗盐基因，该基因可提高植物抗盐性，可在创造抗盐新种质、植物品种改良中应用。
【专利说明】能源作物荻抗盐基因MsVP2及其植物表达载体和构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及荻耐盐基因MsVP2及其植物表达载体和构建方法。
【背景技术】
[0002]盐胁迫是影响植物生长发育的重要胁迫因子，是限制我国盐碱地高效利用的关键因子。因此开展抗盐性的研究成为热点领域。荻(Miscanthus saccharif1ra)为禾本科(Gramineae)芒属(Miscanthus Anderss.)植物,作为原产我国的重要能源植物,具有很高的开发利用价值，然而由于目前生产上常用的奇岗(Miscanthus x giganteus)等材料的耐盐性相对有限，极大影响了其在盐碱地的栽培应用。鉴于抗盐性是是一个多基因控制的数量性状，杂交育种等常规育种方法效率低。已有研究表明，转高效抗盐基因的分子育种对提高植物抗盐性有积极作用。
[0003]氢离子焦磷酸酶(H+-PPase, VP)是位于液泡膜上的一种质子泵，通过调节细胞内外的氢离子转运，改变其酸碱度，为其他物质运输提供动力，从而影响植物的生长发育。目前从植物中鉴定到两个类型:钾离子敏感性VPl和钾离子不敏感型VP2，大量的研究集中在VPl基因上，其通过建立的氢离子梯度，诱导钠氢反向转运蛋白将钠离子导入液泡，缓解钠毒害，提高抗盐性。而钾离子不敏感型VP2的功能尚不明确，研究发现拟南芥VP2定位于高尔基体，可能参与高尔基体上质子转运，进而可以起到缓解植物在盐胁迫下的受害程度的作用。
[0004]在植物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将抗盐基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有抗盐特性的新种质。对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。
【发明内容】
[0005]针对【背景技术】提出的解决提高荻耐盐性的问题，本发明的目的在于提供一个新的荻抗盐基因MsVP2，该基因的序列为SEQ ID N0.1。
[0006]本发明的另一目的在于该抗盐基因MsVP2的植物表达载体。
[0007]本发明所构建的植物表达载体可确定MsVP2的抗盐功能，为植物品种改良提供优异的抗盐基因。
[0008]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
[0009]获抗盐基因MsVP2，该基因的序列为SEQ ID N0.1。
[0010]荻抗盐基因MsVP2的植物表达载体，由本发明所述的荻抗盐基因MsVP2(序列为SEQ ID N0.1)与中间表达载体pEarleyGatel03构成。
[0011]上述的荻抗盐基因MsVP2的植物表达载体，是由Sal I和Not I双酶切MsVP2后插入到gateway入门载体pENTRlA,经NsiI单酶切线性化与pEarleyGatel03表达载体质粒进行重组反应得到。
[0012]荻抗盐基因pEarleyGatel03植物表达载体，其构建方法如下:
[0013]I)荻抗盐基因MsVP2的克隆
[0014]以提取的荻幼嫩叶片为材料，提取总RNA,反转录为cDNA，设计引物扩增MsVP2基因，
[0015]上游弓丨物MSVP2-F: 5' -ATGATGGAAGAAGACGTGGA-3'
[0016]下游引物MsVP2-R: 5' -CAAGAATATTGGTGCCATGACC-3'
[0017]以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-TSimple载体，转化T0P10感受态细胞，测定的序列为SEQ ID N0.1 ；
[0018]2)植物表达载体 pEarleyGatel03_MsVP2 的构建
[0019]设计引物以荻cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在MsVP2基因的上游和下游分别引入Sal I和Not I酶切位点，
[0020]上游引物MsVP2-gateway-F:5' -GCGTCGACATGATGGAAGAAGACGT-3'
[0021]下游引物MsV P2-gateway-R:5/ -TTGCGGCCGCGACAAGAATATTGGTGCCAT-3'
[0022]PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒，SalI和Not I双酶切的MsVP2片段与Sal I和Not I双酶切的pENTRlA连接，转化，提取的阳性质粒经NsiI单酶切线性化,与pEarleyGatel03载体质粒进行LR重组反应,转化,提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQ ID N0.1，植物表达载体PEarleyGatel03-MsVP2构建成功。
[0023]3)ZmVPl的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化，提高植物抗盐性，方法如下:
[0024]农杆菌菌株GV3101感受态制备及冻融法转化
[0025]拟南芥花序浸染及种子筛选
[0026]抗盐评价
[0027]本发明的有益效果:
[0028]1.本发明提供的获MsVP2是Iv新的抗盐基因，该基因可提闻植物抗盐性。
[0029]2.本发明构建的荻MsVP2植物表达载体为首次报道，可直接用于植物的遗传转化，提高植物的抗盐性，可进行植物品种改良。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1:MsVP2琼脂糖凝胶电泳分析，从左至右依次为M:DNA Marker ；MsVP2全长PCR电泳图；pMD19-T Simple-MsVP2 质粒 Sal I 和 Not I 双酶切；pEarleyGatel03-MsVP2 表达载体电泳检测图
[0031]图2:植物表达载体 pEarleyGatel03_MsVP2 图谱
[0032]图3:转基因拟南芥抗盐鉴定
[0033]图4:植物表达载体pEarleyGatel03_MsVP2构建方法示意图
【具体实施方式】
[0034]实施例1植物表达载体pEarleyGatel03_MsVP2的构建与转化
[0035]1.MsVP2 的克隆:
[0036]选用荻(Miscanthus sacchariflora)作为材料,选取健康的插条,扦插成活的幼苗(20天)于盐(200mM NaCl)连续胁迫处理3天，取0.05g幼嫩叶片，参照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书方法，提取叶片总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取IygS RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照拟南芥VP2序列信息(NCBI登录号:AT1G16780)，经01igo6.0软件分析设计引物扩增MsVP2 ；
[0037]上游引物MsVP2-F: 5' -ATGATGGAAGAAGACGTGGA-3'
[0038]下游引物MsVP2-R: 5' -CAAGAATATTGGTGCCATGACC-3'
[0039]以提取的叶片cDNA为模板，进行PCR反应，
[0040]50yL 反应体系:10 X RCR Buffer 5.0 μ L，MsVP2_F、MsVP2_R 引物各l.0yL (20 μ mo 1-L1), dNTP mix 4.0 μ L (2.5mmo 1-L1), Taq DNA Polymerase 0.2 μ L,cDNA 模板 I μ L，d dH20 37.8 μ L ;反应程序:95°C 预变性 4min，然后 94°C 解链 30sec，55°C 退火30sec，72°C延伸Imin 30sec，反应33个循环，72°C延伸1min ;PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化，用 T4DNA 连接酶(TaKaRa)连接到 pMD19_T Simple 载体(TaKaRa)，转化T0P10感受态细胞，序列测定为SEQ ID N0.1 ；
[0041]2.植物表达载体 pEarleyGatel03_MsVP2 的构建
[0042]设计引物进行PCR反应，在目的基因MsVP2的上游和下游分别引入酶切位点SalI和Not 1沖0?产物连接到？1?191 Simple载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒，Sal I和Not I双酶切的MsVP2片段与Sal I和Not I双酶切的pENTRlA连接，转化，提取的阳性质粒经线性化后，与pEarleyGatel03载体质粒进行LR重组反应(Invitrogen,USA),转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQ ID N0.1。
[0043]上游引物MsVP2-gateway-F:5' -GCGTCGACATGATGGAAGAAGACGT-3'
[0044]下游引物MsVPhgateway-R:5/ -TTGCGGCCGCGACAAGAATATTGGTGCCAT-3'
[0045]①以荻叶片cDNA作为模板，用高保真酶(PrimeSTAR? HS DNA Polymerase,TaKaRa)进行 PCR 反应，50 μ L 反应体系:10 X HS RCR Buffer 5.0 μ L, MsVP2_gateway_F、MsVP2-gateway-R 引物各 1.0μL(20μηιο1.L-1)，dNTP mix4.0 μ L(2.5mmol.L-1)，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase0.4 μ L，cDNA 模板 I μ L, ddH2037.6 μ L ;反应程序:95°C预变性4min，然后94°C解链30sec，55°C退火30sec，72°C延伸Imin 30sec,反应30个循环，72°C延伸1min ;PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN，USA)回收，连接到pMD19_T Simple载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-T Simple-MsVP2 ；
[0046]②取gateway 入门载体 pENTRlA (Invitrogen, USA)和 pMD19-TSimple_MsVP2 用Sal I 和 Not I 双酶切，双酶切体系(50 μ L):10 X H Buffer 5 μ L, BSA 5 μ L，质粒 pENTRlA或 PMD19-T Simple-MsVP2 15 μ L，Sal I 2 μ L, Not I 2 μ L, ddH20 21 μ L ;37°C 反应 3h ;双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pENTRlA大片段和pMD19-TSimple-MsVP2小片段。用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物，连接反应体系(1yL): 10 X T4Iigase Buffer I μ L，pENTRlA 大片段 2 μ L，pMD19-TSimple_MsVP2小片段6 μ L，T4DNA连接酶I μ L ; 16°C过夜连接反应，取5 μ L连接产物转化Τ0Ρ10感受态细胞。37°C过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pENTRlA-MsVP2。
[0047]③取质粒pENTRlA-MsVP2 用 Pvu I 单酶切，酶切体系(40 μ L): 10 X K Buffer4 μ L,0.1 % BSA 4μ L，质粒 pENTRlA-MsVP2 15 μ L，Pvu I 2 μ L, ddH20 15 μ L ;37°C 反应 2h，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pENTRlA-Pvu I片段。将回收的片段与pEarleyGatel03载体质粒进行LR重组反应，反应体系(6 μ L):pENTRlA-ZmVPl大片段4 μ L，pEarleyGatel03质粒 I μ L, LR Clonase? IIenzyme mix I μ L ;25 °C 反应 lh,力卩入 I μ L Proteinase K,37°C反应1min ;重组产物转化TOPlO感受态细胞，37 °C过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pEarleyGatel03-MsVP2，电泳和测序验证为SEQ ID N0.1。植物表达载体pEarleyGatel03-MsVP2 的构建成功。
[0048]3.植物表达载体pEarleyGatel03-MsVP2的遗传转化及其抗盐性鉴定
[0049]①农杆菌菌株GV3101感受态制备及冻融法转化
[0050]从YEB (50ug/mL利福平)平板上挑取GV3101单菌落，接种于50mL含50ug/mL利福平的YEB液体培养基中，220rpm，28°C培养至OD值0.6，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的的10mM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200uL/管分装，待用。
[0051]取5uL pEarIeyGate 103-MsVP2载体质粒,加入10uL感受态细胞,冰浴30min,液氮冷冻5min，37°C 5min,加入800uLYEB液体培养基，28°C 200rpm预培养3h，菌液涂板于YEB(50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)固体培养基上，28°C暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。
[0052]②拟南芥花序浸染及种子筛选
[0053]将阳性单克隆接到50mL的YEB (50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)液体培养基中，培养36小时，5000rpm离心20分钟，然后用转化液(5 %蔗糖+500uL/L的Si Iwet L-77)剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中I分钟，然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿，放回培养室培养24小时，打开保鲜膜，待种子成熟时采收。
[0054]种子消毒与播种:将种子放入5mL的离心管中，加入50 %巴斯消毒液，添加0.1 %的Triton X-100摇晃15分钟，然后在超净台中用无菌水洗5次，而后直接把种子倒在灭菌过的滤纸上，吹干种子(放置I小时)，轻轻敲击滤纸将干种子均匀撒播到筛选培养基(l/2MS+20mg/L草胺磷+25mg/L氨苄青霉素)筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的盖子覆盖幼苗I周以保湿。
[0055]③抗盐评价
[0056]经PCR鉴定的T1代转基因苗继续生长，采收T2代种子。对野生型和T2代抗性转基因拟南芥种子分别播于MS(0mM，120mM NaCl)的固体培养基上生长20天后，观察其生长情况，发现转基因拟南芥抗盐性显著高于高于野生型拟南芥(图4)。
[0057] 综上所述，本发明构建了含有抗盐基因的植物表达载体PEarleyGatel03-MsVP2，其中MsVP2首次报道。所构建的载体可导入植物中，提高植物的抗盐特性。
【权利要求】
1.荻耐盐基因MsVP2，其特征在于该基因的序列为SEQID N0.1。
2.荻耐盐基因MsVP2的植物表达载体，其特征在于由权利要求1所述的荻耐盐基因MsVP2与植物表达载体构成。
3.根据权利要求2所述的荻耐盐基因MsVP2的植物表达载体，其特征在于所述的植物表达载体为Sal I和Not I双酶切MsVP2后插入到gateway入门载体pENTRlA，经线性化后与pEarleyGatel03表达载体质粒进行重组反应得到。
4.权利要求2或3所述的荻耐盐基因MsVP2植物表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤: 1)荻耐盐基因MsVP2的克隆 以荻幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为eDNA，设计引物扩增MsVP2基因，上游引物MsVP2-F: 5' -ATGATGGAAGAAGACGTGGA-3'
下游引物 MsVP2-R: 5' -CAAGAATATTGGTGCCATGACC-3' 以反转录的eDNA为模板，以MsVP2-F和MsVP2_R为引物，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOPlO感受态细胞，测定的序列为SEQ ID N0.1 ； 2)植物表达载体PEarleyGatel03-MsVP2的构建 设计引物以荻eDNA为 模板，用高保真酶进行PCR反应，在MsVP2基因的上游和下游分别引入Sal I和Not I酶切位点，
上游弓 I 物 MsVP2-gateway-F: 5' -GCGTCGACATGATGGAAGAAGACGT-3'
下游引物 MsVP2-gateway-R:5/ -TTGCGGCCGCGACAAGAATATTGGTGCCAT-3' PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOPlO感受态细胞，提取阳性质粒，Sal I和Not I双酶切的MsVP2片段与Sal I和Not I双酶切的pENTRlA连接，转化，提取的阳性质粒经NsiI单酶切线性化后与pEarleyGatel03载体质粒进行LR重组反应,转化,提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQ ID N0.1，植物表达载体PEarleyGatel03-MsVP2构建成功。
5.权利要求1所述的荻耐盐基因MsVP2在创建耐盐新种质中的应用。
6.权利要求2所述的植物表达载体在创建耐盐新种质中的应用。
【文档编号】C12N15/55GK104178503SQ201410311794
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】宗俊勤, 刘建秀, 陈煜 , 陈静波, 李兰兰, 郭爱桂 申请人:江苏省中国科学院植物研究所