利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法

利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法
【专利摘要】本发明属于作物标记辅助育种【技术领域】，具体涉及利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法。本发明的特征包括培育耐受化学杀雄剂的父本材料和无遮挡的化学杀雄步骤。利用化学诱变剂诱变甘蓝型油菜种子，在5-6叶期喷施除草剂苯磺隆，初步筛选得到抗除草剂的突变体材料，自交得到稳定遗传的抗除草剂油菜突变体株系，提取油菜突变体株系基因组DNA，扩增得到BnaAHAS1和BnaAHAS3基因片段，其中BnaAHAS3基因片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，在该基因BnaAHAS3第536bp处存在一个C/T突变。本发明还公开了抗除草剂的特异性标记的制备，以及在无遮挡化学杀雄制种中的应用。
【专利说明】利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法

【技术领域】
[0001]本发明属于农作物标记辅助育种【技术领域】，具体涉及利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法，包括利用化学诱变剂和除草剂筛选得到抗抗磺酰脲类除草剂的突变体，从该突变体中克隆得到抗除草剂的基因AHAS，利用该基因的片段作为分子标记辅助选择抗除草剂的油菜品系，从而达到改良油菜化学杀雄制种的方法。

【背景技术】
[0002]甘蓝型油菜是世界上广泛种植的重要油料作物。菜籽油不仅可以作为食用油，也是润滑油及生物柴油等工业原材料。从1975年到2012年的将近40年里，甘蓝型油菜的世界总产量已经增长了 8倍,2012年产总量达到64.8百万吨(http://faostat.fa0.0rg/)。甘蓝型油菜如此迅速的增长速度主要取决于品质的遗传改良(低硫苷和低芥酸)以及杂种优势的利用。
[0003]杂种优势是指杂交品种(F1)表现出的某些性状或综合性状对其亲本品种和其它常规自交系品种的优越性，在作物育种中主要是指以产量性状为主的育种目标性状。杂种优势是生物界的一种普遍现象。利用杂种优势已经成为现代农业中选育高产优质新品种的最成熟有效的途径之一，在玉米、水稻、高粱、小麦及油菜等重要农作物生产中已广泛应用。目前，油菜杂种优势利用主要是通过各种类型的雄性不育系实现的。油菜雄性不育系统主要包括细胞质雄性不育、细胞核雄性不育、生态型雄性不育，遗传改造的雄性不育以及化学诱导的雄性不育，它们在杂种优势利用中发挥了极其重要的作用(傅廷栋，1990)。
[0004]甘蓝型油菜化学诱导雄性不育系是利用杀配子剂或化学杂交剂(简称CHA)处理正常自交系的花蕾诱导产生的一种雄性不育，其不育性是不可遗传的，因此不需要保持系。化学诱导雄性不育系在油菜杂交种生产中具有很多优点，如所有品种都是其恢复系，杂交亲本选择自由，容易筛选强优势组合以及可以缩短育种周期等。由于化学诱导雄性不育系优势明显，近年来受到油菜育种家的高度关注，全国有很多科研单位已经开展了化学杀雄育种，化学诱导雄性不育系统已经成为油菜杂种优势利用的一种重要途径，化学杀雄制种时，母本行与父本行通常按2:1或3:1比例(简称行比)种植，即种植两行或三行母本配制一行父本。在喷施CHA时，为了避免父本因药害造成花粉量减少而导致降低制种产量，必须采取人工遮挡措施对父本行植株进行保护，既增加了生产成本，又制约了杂交种生产规模。因此获得具有CHA抗性的油菜品系可以简化油菜化学杀雄制种程序，降低制种风险和生产成本，在油菜杂种优势利用中具有重要意义。
[0005]AHAS是植物中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等三种支链氨基酸合成途径的第一个关键酶，是磺酰脲类(SUs)、咪唑啉酮类(MIs)、三唑嘧啶类(TPs)、磺酰胺类(SCTs)和嘧啶硫代苯甲酸酯类(PTBs)等五类除草剂的靶标酶。这五类除草剂的主要作用机理是通过化学键的相互作用结合到乙酰乳酸合成酶(AHAS)的除草剂结合位点，阻止AHAS的底物与催化位点结合；最终抑制乙酰乳酸合成酶(AHAS)的活性，从而影响支链氨基酸的生物合成，破坏植物体内蛋白质的生物合成，进而导致植株死亡。目前生产中常用的化学杂交剂(CHA)一般是以乙酰乳酸合成酶(AHAS, acetohydroxyacid synthase)祀标的磺酰脲类除草剂，例如酸卩密横隆(Amidosulfuron)、单卩密横酯钠(Monosulphuron ester sodium,简称 MES)以及苯磺隆(Tribenuron-methyl)等都是优良的化学杂交剂(Cheng et al., 2013 ；Yu etal., 2006 ；Yu et al.，2009)。其中，苯磺隆具有价格便宜、毒性低、无残留、对环境无害和杀雄效果好等优点，已被广泛应用于诱导产生甘蓝型油菜雄性不育系的制种生产中。


【发明内容】

[0006]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法，该方法包括利用化学诱变剂和除草剂筛选得到抗抗磺酰脲类除草剂的突变体，从该突变体中克隆得到抗除草剂的基因AHAS，利用该基因的片段作为分子标记辅助选择抗除草剂的油菜品系，从而达到改良油菜化学杀雄制种，本发明提出了无遮挡、大规模生产杂交油菜种子的新方法；该方法能够简化化学杀雄制种程序，降低杂交种生产成本，保证了杂交种的质量和产量。
[0007]本发明通过如下技术方案实现:
[0008]一种利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法，包括化学杀雄步骤，它还包括培育耐受化学杀雄剂的父本材料和无遮挡的化学杀雄步骤，具体步骤如下:
[0009](I)利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理甘蓝型油菜华双5号种子，筛选得到M1代种子，种植M1代种子，于开花期分单株套袋自交，得到M2代种子；在第二个种植季节播种M2代种子，在M2植株4-6叶期时喷施2.5mg/L的除草剂苯磺隆溶液，每隔7d按同样的浓度连续喷施两次，20d后挑选未受伤害的植株作为抗除草剂的甘蓝型油菜突变体的初筛材料，于成熟期套袋收取自交种子，得到M3代种子；在第三个种植季节播种该M3代种子，考察M3代的除草剂抗性的稳定性，验证获得抗除草剂的突变株系M45 ；
[0010](2)提取步骤(I)所述的抗除草剂的突变株系M45基因组DNA，以特异性引物分别扩增BnaAHASl基因(基因登录号Z11524)和BnaAHAS3基因(基因登录号Z11526)，所述扩增 BnaAHASl 基因的引物的 DNA 序列为:BnaAHASl_F:TCAAGAACAGTTAGATCCAC,BnaAHASl-R:GATCACCAGCTTCATCTCT ；扩增 BnaAHAS3 基因的引物为:BnaAHAS3_F:CTCTCTCTCTCTCATCTAACCAT, BnaAHAS3-R:ACTGAAACTMGTCTTTTACCAT ;得到如序列表 SEQ IDNO:1所示片段，即在BnaAHAS3基因片段的第536位发生单碱基的错义突变(C/T)，由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，即氨基酸由脯氨酸(Ρι.ο)突变为亮氨酸(Leu)
[0011 ] (3)根据BnaAHAS3基因片段的第536位的SNP侧翼序列，设计一对基于PCR和酶切的dCAPS标记，该标记是由两条引物序列组成，其DNA序列如下所示:正向引物BnaAHAS3_dCAPS-F:5’ -CACAAACTCATTCATCATCTCTCTCTCATTTC-3’，反向引物 BnaAHAS3_dCAPS_R:5’ -ACGATTGGCGTCTCTTGGAACGCGTCAGTACCGATCATCCGGCCA-3’，通过PCR扩增得到如序列表 SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列；
[0012](4)通过杂交和分子标记辅助选择将SEQ ID NO:1所示的基因片段导入甘蓝型油菜品种或自交系中，得到抗除草剂的父本，该父本含有抗除草剂显性核基因Bnaahas3 ；
[0013](5)在田间无遮挡条件下，以甘蓝型油菜品种或自交系为母本，以携带有Bnaahas3抗除草剂基因片段的品种或自交系作父本，按父母本1:2或1:3的行比种植，在母本花蕾2-3mm长时喷施0.05mg/L的除草剂苯磺隆溶液,间隔7d连续喷施三次,于成熟期收获母本上的杂交种。
[0014]上述抗除草剂的突变株系M45被命名为甘蓝型油菜M45，Brassica napus L.M45，于2014年6月17日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCC NO:P201409o
[0015]本发明的上述方法可用于无遮挡油菜化学杀雄制种中。
[0016] 申请人:克隆得到核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示的基因片段，该片段能应用于无遮挡油菜化学杀雄制种中。
[0017] 申请人:分离得到的抗除草剂基因的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如下所示:
[0018]CACAAACTCATTCATCATCTCTCTCTCATTTC 和 ACGATTGGCGTCTCTTGGAACGCGTCAGTACCGATCATCCGGCCA。该分子标记可用于无遮挡油菜化学杀雄制种中。
[0019]更详细的技术方案参见《【具体实施方式】》。

【专利附图】

【附图说明】
[0020]序列表SEQ ID NQ:1是本发明克隆的BnAHAS3基因片段的核苷酸序列。片段长度为612bp，在该片段的第536位有一个等位基因突变(即:C/T)。
[0021]序列表SEQ ID NQ:2和SEQ ID NQ:3是本发明制备的分子标记的核苷酸序列。
[0022]序列表SEQ ID NQ:4是本发明制备的分子标记扩增出来的产物序列，片段长度为633bp，即BnaAHAS3_dCAPS标记产物的核苷酸序列(在该片段的588bp处存在一个等位基因突变，该突变位点就是SEQ ID NQ:1所示的基因片段的突变位点，本序列的l_52bp是在SEQ ID NQ:1所示的基因片段的基础上增加的序列，导致本序列的突变位点相对后移)。
[0023]图1、本发明的技术路线图。
[0024]图2、本发明TA克隆中应用的pGEM?-TT^\载体图。
[0025]图3、甘蓝型油菜野生型华双5号在苯磺隆不同浓度处理下的表型。华双5号种子播种于试验田，每5行喷施相同的苯磺隆浓度。图中标记说明:A:阴性对照(喷水处理)；B:苯磺隆 0.01mg/L ；C:苯磺隆 0.025mg/L ；D:苯磺隆 0.5mg/L ；E:苯磺隆 2.5mg/L ；F:苯磺隆 5.0mg/Lo
[0026]图4、甘蓝型油菜苯磺隆抗性株系M45的抗性表型。第一行:阴性对照(喷水处理);第二行:用浓度为2.5mg/L的苯磺隆溶液处理.。WT:野生型；M45:抗性品系(或称抗性株系、苯磺隆抗性株系)
[0027]图5、甘蓝型油菜苯磺隆抗性株系M45的抗性范围。图中标记说明:A:阳性对照(浓度为2.5mg/L的苯磺隆溶液处理WT) ；B:阴性对照(喷水处理WT) ;C_F:浓度为2.5mg/L、5.0mg/L、7.5mg/L和lOmg/L的苯磺隆溶液处理M45品系。
[0028]图6、BnaAHASl和BnaAHAS3基因扩增的PCR产物检测和回收检测(以M45为例)。图中标记说明:A 图:泳道M，lkb marker ; 1-2，BnaAHAS3 基因扩增 WT 和 M45 ；3-4,BnaAHASl基因扩增WT和M45 ;左右箭头分别指向2.0kb BnaAHAS3基因和2.2kb BnaAHASl的特异扩增片段。B图:泳道M，Ikb 1^4虹；1-2，切胶回收后的訂和1458的4通51基因片段；箭头指向2.2kb BnaAHASl的片段。
[0029]图7、BnaAHAS3基因核苷酸及部分氨基酸片段比对结果。图中标记说明:箭头所指的是存在差异的氨基酸残基;At3g48560:拟南芥AHAS氨基酸序列(基因登录号At3g48560, http://www.arabidopsis.0rg/) ；BnaAHAS3:野生型氨基酸序列；Bnaahas3:抗性株系M45氨基酸序列。
[0030]图8、苯磺隆抗性等位基因特异性标记BnaAHAS3_dCAPS的多态性检测。图中标记说明:(A)亲本和F1的扩增检测；(B)F2群体中的扩增检测；P1；M45 ；P2,中双11 ；M, Ikb分子量标记O
[0031]图9、甘蓝型油菜化学杀雄处理后花粉育性特征。图中标记说明:(A)开花期雄蕊形态特征；(B)醋酸洋红染色检测花粉粒活性；(C)雄蕊长度比较。
[0032]图10、以抗苯磺隆品系M45为父本进行杂种优势利用(应用)的技术流程图。
[0033]图11、以抗苯磺隆品系的衍生自交系或品系为父本进行进行杂种优势利用(应用)的流程图。

【具体实施方式】
[0034]以下为本发明的具体实施例，但本发明并不限于以下实施例。
[0035]实施例1:抗苯磺隆甘蓝型油菜品系的获得
[0036](I)称取100g优质纯合的华双5号种子(该材料由华中农业大学油菜遗传育种研究室提供，为中国大面积推广的甘蓝型油菜新品种)，将种子置于双蒸水中浸泡8个小时。将浸泡后的种子置于0.30%的化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)中适时搅拌使其充分诱变。在诱变18小时完成后用自来水冲洗3-4小时，微微晾干诱变过的种子。
[0037](2)将未处理的华双5号播种于华中农业大学实验田中，每行播种8株，待4-6片真叶时隔周两次喷施 Omg/L,设计 0.01mg/L,0.025mg/L,0.5mg/L, 2.5mg/L, 5.0mg/L 的不同浓度的除草剂苯磺隆溶液，20天后观察表型，明确其致死浓度为2.5mg/L(图3)。
[0038](3)同时也将诱变的种子(M1)播种于华中农业大学试验田中，随机撒播，待出现4-6片真叶时，用2.5mg/L的苯磺隆溶液隔周喷施两次，20天后观察表型，选择未受到任何伤害的植株进行套袋自交即为M2代。
[0039](4)将M2代种子以单行区种植，每行点播8-10株，按照上述相同的喷药(2.5mg/L的苯磺隆溶液，方法同上)筛选获得M3代抗性植株。
[0040](5)将M3代种子以双行区种植，每行点播8-10株，按照上述相同的喷药筛选的方法筛选获得了 I个纯和的抗性株系，将其命名为M45 (图4)。
[0041](6)以抗性株系M45为研究对象以三行区播种，每行8-10株，待出现5_6片真叶时,用2.5mg/L, 5mg/L, 7.5mg/L, I Omg/L的不同浓度的苯磺隆隔周喷施两次,20天后观察表型，可发现M45品系在浓度为7.5mg/L的苯磺隆处理下生长状况受到了明显的影响(图5)，结果表明抗性品系可以耐受浓度为5mg/L的苯磺隆。
[0042]实施例2:甘蓝型油菜苯磺隆抗性基因的克隆
[0043](I)利用CTAB法(为本领域常用方法)提取甘蓝型油菜华双5号(野生型)和抗性株系的基因组DNA，用特异性引物(如下所示)对可能与抗性关联的甘蓝型油菜2个AHAS 同源基因(AHAS1，AHAS3)的 Open-reading frame (ORF)分别进行扩增。BnaAHASl基因(基因登录号Zl 1524)的扩增引物为BnaAHASl-F(TCAAGAACAGTTAGATCCAC)和BnaAHASl-R(GATCACCAGCTTCATCTCT) ;BnaAHAS3 基因(基因登录号 Z11526)的扩增引物为 BnaAHAS3-F(CTCTCTCTCTCTCATCTAACCAT)和 BnaAHAS3_R(ACTGAAACTAAGTCTTTTACCAT)。
[0044](2)基因扩增采用KOD-pIus-标准反应体系(Τ0Υ0Β0)，50 μ I PCR反应体系包括:100ng 基因组 DNA 模板、5μ 110XPCR buffer for K0D-plus_、5 μ I dNTPs (2mM)、2 μ IMgS04(25mM)、3y I PCR primers (正向和反向引物各L 5 μ 1，浓度各为10 μ M)和I μ IKOD-plus- (IU/ μ I)，补充 ddH20 至 50 μ I。
[0045](3) PCR 反应程序:94°C 预变性 3min ;94°C变性 30sec，55°C 复性 30sec，68°C 延伸
2.5min，共32个循环；68°C延伸lOmin，4°C保存。取扩增产物I μ 1，加入2 μ I上样缓冲液(98%去离子甲酰胺、1mM EDTA、0.005%二甲苯青FF和0.005%溴酚蓝)，经过1%的琼脂糖凝胶(含0.1 %溴化乙锭)电泳后，凝胶成像系统(B1-Rad，Gel DocTM XR+)照相并观察结果(图6)。
[0046](4)BnaAHASl基因扩增产物在紫外灯下切取目的大小的片段，凝胶回收采用Axygen DNA凝胶回收试剂盒(Axygen B1sciences),回收产物检测采用上述相同的方法(图 4)。
[0047]BnaAHASl和BnaAHAS3基因片段加A尾巴，反应体系包括:7 μ I PCR产物、I μ 110XTaqbuffer、0.4μ I dNTPs (1mM) ,0.6μ I MgC12 (25mM)、I μ I Taq DNApolymerase(MBI Fermentas,5U/μ I)。
[0048](5)将目标片段连接到Easy载体(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司代理，即美国Promega公司),连接反应体系包括5 μ 12Χ Rapid Ligat1n Buffer>I μ I VectorU μ I T4DNA Ligase (3U/μ I)，125ng 加 A 产物，补充 ddH20 至 10 μ 1，反应条件为4°C过夜。连接产物通过电击转化到大肠杆菌DH5ci，通过氨苄青霉素LB筛选阳性克隆，提取质粒；
[0049](6)阳性克隆质粒在DNA测序仪(型号ABI3500)上测序，BnaAHASl基因测序所用的引物为 SP6 (ATTTAGGTGACACTATAG)、T7 (TAATACGACTCACTATAGGG)、BnaAHASl-Fl(GCTCCTCCACCATCCGTAA)及 BnaAHASl-Rl (ATTGCCTTCCCTTCGGTTA),BnAHAS3 基因测序所用的引物为SP6(序列同上)、T7(序列同上)及BnaAHAS3-Rl (ATTGCCTTCCCTTGGGTTAG)。
[0050]步骤(I)中，引物序列来源于“油菜乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性突变体M9的遗传和基因克隆”(胡茂龙等，2012)。
[0051]步骤(I)中，通过PCR扩增的BnAHASI和BnAHAS3基因目标片段大小分别为2.2kb和 2.0kb。
[0052]实施例3:甘蓝型油菜苯磺隆抗性基因突变位点的鉴定
[0053](I)利用 Clustal Omega (http://www.eb1.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对野生型和抗性品系的BnaAHASl和BnaAHAS3基因序列进行比对。
[0054]结果如图7所示，在抗性株系M45中，BnaAHAS3基因有2个突变位点，即96位和536位碱基发生突变，由胞嘧啶(C)突变成胸腺嘧啶(T)。
[0055](2)将野生型华双5号和抗性株系M45的两个基因的氨基酸序列采用上述相同的方法进行比对分析并展示。
[0056]结果如图7所示，抗性株系M45的BnaAHAS3基因的第197位的脯氨酸(Pro)突变成了亮氨酸(Leu)(使用拟南芥氨基酸位置命名法，见:基因登录号At3g48560，http://WWW.arabidopsis.0rg/);这个突变位点与已经报道的AHAS基因的17个除草剂结合位点是一致(Duggleby et al.2008);因此，我们将突变的BnaAHAS3基因作为抗性品系的功能基因。
[0057]实施例4:甘蓝型油菜苯磺隆抗性等位基因特异性标记的开发及检测
[0058](I)针对BnaAHAS3基因片段的536位SNP (C>T)，我们利用dCAPSFinder2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/)设讨条等位特异性的正向引物:BnaAHAS3_dCAPS-F(5’ -ACGATTGGCGTCTCTTGGAACGCGTCAGTACCGATCATCCGGCCA-3’)，反向引物 BnaAHAS3_dCAPS-R(5’ -CACAAACTCATTCATCATCTCTCTCTCATTTC-3’ )位于 5’ UTR 区域。
[0059](2)利用常用的CTAB法提取抗性株系M45、敏感性品种中双11 (来自中国农业科学院油料作物研究所，一个公开推广的甘蓝型油菜新品种)以及利用两亲本(M45、中双11)所构建的F1株系、F2群体(抗性单株和敏感单株各17个)的DNA。
[0060](3) PCR 反应体系及程序。20 μ I 体系包括:75ng DNA 模板、2 μ IlOXTaq buffer、
1.6μ I MgCl2(25mM)、0.4μ I dNTPs (1mM)、2 μ I PCR primers (正向和反向引物各 I μ 1，浓度各为 10 μ Μ)和 5U Taq DNA polymerase (recombinat, Fermentas),补充 ddH20 至 2O μ I。反应程序:94°C预变性3min ;94°C变性30sec，65°C复性30sec，72°C延伸40sec，共40个循环；72°C延伸5min，4°C保存。
[0061](5)酶切反应体系及程序:30μ I反应体系:10μ I PCR产物、2 μ 110 X FastDigestGreen buffer, I μ I FastDigcst? MvaI (Fermentas, EcoR II ),补充 ddH20 至 30 μ I。反应程序:37°C孵育30min。取酶切产物10 μ 1，经过3%的琼脂糖凝胶(含0.1 %溴化乙锭)电泳后，凝胶成像系统(B1-Rad，Gel DocTM XR+)照相并观察结果。
[0062]结果如图8的A所示，通过PCR和酶切检测表明该标记在亲本M45和中双11之间表现出很好的多态性。敏感性亲本中双11的PCR产物能够被FastDigestMvaI所切割所表现出的带型被命名为等位基因S ;而1145突变体的PCR产物不能被FastDigestMvaI所切割所表现出的带型被命名为等位基因R ;该标记在F1中出现了预期的两条带即表现为杂合基因型，被命名为基因型H。利用BnaAHAS3_dCAPS标记F2分离群体中选取的抗性和敏感性单株进行了基因型分析，结果如图8的B所示，17个抗性单株与抗性亲本M45或F1的带型相同，即基因型为R或H ;而17个敏感性单株则与敏感性亲本中双11的带型相同，即基因型均为S。这些结果显示等位基因特异性标记BnaAHAS3_dCAPS与苯磺隆抗性表型共分离，即表明M45抗性株系中的BnaAHAS3基因第536位发生的单碱基的错义突变(C/T)以及该核苷酸突变所导致的氨基酸突变(脯氨酸(Pro)突变为亮氨酸(Leu))是该突变株系产生除草剂抗性的功能位点，同时该结果也表明可用于分子标记辅助培育甘蓝型油菜苯磺隆抗性自交系或品系。
[0063]实施例5:抗苯磺隆甘蓝型油菜品系在无遮挡化学杀雄生产杂交种的应用
[0064](I)将常规甘蓝型油菜品种华双5号和抗除草剂突变体株系M45于播种华中农业大学试验田，每行种植8株，按常规方法进行田间管理。
[0065](2)当油菜植株现蕾时(最大花蕾不超过2-3_)，在晴朗无风的天气叶面喷施
0.05mg/L的苯磺隆溶液(每升溶液加2-3g洗衣粉可保证溶液更好的粘附在叶面上)，每隔7天左右再喷施一次，共喷施3次即可。
[0066](3)在盛花期天气晴好时，分别取华双5号和抗苯磺隆甘蓝型油菜突变体株系M45的花药，用醋酸洋红染色后在光学显微镜下观察，花药大而圆并能着色的为可育花粉，花药小而瘪并不能着色的为不育花粉，并记录结果。
[0067]实验结果如图9中的A和图9中的C所示，与对照组(未喷施处理)相比，苯磺隆处理后华双5号的雄蕊发育受到了抑制(雄蕊明显变短，P < 0.0001)，花药基本不发育，表现为不育；而145株系处理后与对照组(未喷施处理)相同，表现为雄蕊发育正常(P =
0.2264)且育性正常。如图9B所示，对照组野生型华双5号的花粉粒未处理时呈现红色，活性正常，处理后花粉出现了 100%的不育；而145株系处理后与未处理时花粉粒着色相同均呈现红色，表示M45株系经苯磺隆处理后花粉活性仍然保持正常。
[0068]根据该实验结果，本发明提出了一个改良程序，能够简化的、安全的以及经济的利用化学杀雄制种的方法:即在无遮挡措施条件下，利用除草剂苯磺隆的同时处理(喷施相同浓度的苯磺隆溶液)父母本，允许母本植株雄性不育，父本植株雄性可育。该程序主要特点是既可以保证优良杂交种的安全生产，又可以允许CHA苯磺隆规模化喷施(不需要在遮挡条件下保护父本)可以降低生产成本，提高杂种优势利用在生产甘蓝型油菜杂交种的效率。
[0069]具体可通过以下途径来实现:
[0070]A、如图10所示，直接利用本发明中的苯磺隆抗性株系M45的化学杀雄制种方法，即以苯磺隆抗性株系M45为测验种，通过配合力测定选择强优势的杂交组合(杨光圣等，2009);然后采用本发明提出无遮挡的化学杀雄制种方法制备甘蓝型油菜杂交种。
[0071]B、如图11所示，利用携带有Bnaahas3抗除草剂基因片段的苯磺隆抗性株系M45为供体亲本，对优良的、高配合力的自交系进行改良；每个世代结合BnaAHAS3_dCAPS标记进行辅助选择(标记辅助选择的方法为本领域的常用方法)，在保留优系全部或大部分性状并保持高配合力特性的前提下，将苯磺隆抗性基因转育到目标自交系中。然后通过配合力测定选择选择强优势的杂交组合(杨光圣等，2009);然后采用本发明提出的无遮挡的化学杀雄制种方法生产杂交种。
[0072]C、利用转基因的方法将Bnaahas3抗除草剂基因片段通过农杆菌介导遗传转化方法转化至油菜宿主细胞，得到转Bnaahas3抗除草剂基因的油菜植株，然后采用本发明提出的无遮挡的化学杀雄制种方法生产杂交种。
[0073]根据本发明，化学杀雄制种过程中CHA苯磺隆的喷施处理可以在田间像杀虫剂喷施一样进行无保护(即不需要遮挡措施)规模化喷施。在这种简化栽培情况下，既可以保证母本雄性不育，也可以保证父本100%可育，因为不再考虑父本的安全问题，本发明在原有的化学杀雄制种的基础上提供了更为经济简便的程序。再者，本领域的技术人员可以结合传统的自交系回交改良方法及分子标记(除草剂)进行辅助选择的应用，在这种应用中，甘蓝型油菜父本在获得除草剂抗性的同时，并没有改变其他优良农艺性状及较高的配合力特性。
[0074]主要参考文献
[0075]1.傅廷栋，中国油菜杂种优势利用研究概况.作物研究，1990，4 (3):1_4.
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[0077]3.杨光圣等，2009.作物育种原理.北京:科学出版社.
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【权利要求】
1.一种利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法，包括化学杀雄步骤，其特征在于，它还包括培育耐受化学杀雄剂的父本材料和无遮挡的化学杀雄步骤，包括如下步骤: (1)利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理甘蓝型油菜华双5号种子，筛选得到M1代种子，种植M1代种子，于开花期分单株套袋自交，得到M2代种子；在第二个种植季节播种M2代种子，在M2植株4-6叶期时喷施2.5mg/L的除草剂苯磺隆溶液，每隔7d按同样的浓度连续喷施两次，20d后挑选未受伤害的植株作为抗除草剂的甘蓝型油菜突变体的初筛材料，于成熟期套袋收取自交种子，得到M3代种子；在第三个种植季节播种该M3代种子，考察M3代的除草剂抗性的稳定性，验证获得抗除草剂的突变株系M45 ； (2)提取步骤(I)所述的抗除草剂的突变株系M45基因组DNA，以特异性引物分别扩增BnaAHASl基因(基因登录号Zl 1524)和BnaAHAS3基因(基因登录号Zl 1526)，所述扩增 BnaAHASl 基因的引物的 DNA 序列为:BnaAHAS 1-F: TCAAGAACAGTTAGATCCAC,BnaAHASl-R:GATCACCAGCTTCATCTCT ；扩增 BnaAHAS3 基因的引物为:BnaAHAS3_F:CTCTCTCTCTCTCATCTAACCAT,BnaAHAS3-R:ACTGAAACTAAGTCTTTTACCAT ;得到如序列表 SEQ IDNO:1所示的片段，在该片段的第536位存在一个C/T突变；' (3)根据BnaAHAS3基因片段的第536位的SNP侧翼序列，设计一对基于PCR和酶切的dCAPS标记，该标记是由两条引物序列组成，其DNA序列如下所示:正向引物BnaAHAS3_dCAPS-F:5’ -CACAAACTCATTCATCATCTCTCTCTCATTTC-3’，反向引物 BnaAHAS3_dCAPS_R:5’ -ACGATTGGCGTCTCTTGGAACGCGTCAGTACCGATCATCCGGCCA-3’，通过PCR扩增得到如序列表 SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列； (4)通过杂交和分子标记辅助选择将SEQID NO:1所示的基因片段导入甘蓝型油菜品种或自交系中，得到抗除草剂的父本，该父本含有抗除草剂显性核基因Bnaahas3 ； (5)在田间无遮挡条件下，以甘蓝型油菜品种或自交系为母本，以携带有Bnaahas3抗除草剂基因片段的品种或自交系作父本，按父母本1:2或1:3的行比种植，在母本花蕾2-3mm长时喷施0.05mg/L的除草剂苯磺隆溶液，间隔7d连续喷施三次，于成熟期收获母本上的杂交种子。
2.权利要求1所述的方法在无遮挡油菜化学杀雄制种方法中的应用。
3.核苷酸序列如序列表SEQID NO:1所示的基因片段在无遮挡油菜化学杀雄制种中的应用。
4.一种分离的抗除草剂基因的分子标记，其特征在于，该分子标记的核苷酸序列如下所示:
CACAAACTCATTCATCATCTCTCTCTCATTTC 和 ACGATTGGCGTCTCTTGGAACGCGTCAGTACCGATCATCCGGCCA。
5.权利要求4所述的分子标记在无遮挡油菜化学杀雄制种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104126496SQ201410314435
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】刘克德, 吴江生, 刘超, 李海涛, 李娟娟, 赵波 申请人:华中农业大学