基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法
【专利摘要】一种基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法，包括以下步骤：（1）将黑曲霉孢子液接种至种子培养基，培养制备成熟的种子液；（2）成熟的种子液经过分散器处理，得到分散菌丝种子液；（3）将步骤（2）得到的部分分散菌丝种子液以5~15%接种量转接至发酵培养基发酵，当发酵培养基还原糖浓度低于0.5%时发酵结束；（4）将步骤（2）得到的部分分散菌丝种子液以5~15%接种量接种至种子培养基，培养制备得到下一级成熟的种子液，然后回到步骤（2），即实现黑曲霉种子连续培养。本发明提供的黑曲霉种子连续培养方法，能直接减少黑曲霉孢子繁琐的培养过程，同时可以有效缩短成熟种子培养时间，提高原料利用率。
【专利说明】基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及发酵工程【技术领域】，尤其是涉及一种基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑 曲霉种子连续培养方法。
【背景技术】
[0002] 柠檬酸（Citric Acid)又名枸橼酸，化学名称是2-羟基丙烷三羧酸，无色晶体，常 含有一分子结晶水，无臭，具有很强的酸味，易溶于水，在冷水中比热水中更容易溶解，常用 来鉴定和分离。在食品化妆医药、建筑、印染、洗涤等行业具有广泛的用途，因其具有令人愉 悦的酸味，入口爽快，无后酸味，安全无毒，已成为当前世界上生成量和消费量最大的食用 有机酸。柠檬酸在新兴行业的应用需求呈现出逐渐增长的趋势。柠檬酸在环境可持续发展 方面有广泛应用，可以有效清除焊接残留，在生物聚合物、药物运输、组织工程中培养细胞 方面也具有巨大的潜力。
[0003] 柠檬酸发酵普遍采用黑曲霉二级发酵方式，即首先培养成熟的种子，然后成熟的 种子液转接发酵培养。传统种子培养过程是采用黑曲霉孢子接种方式，需要大量成熟的黑 曲霉孢子，黑曲霉孢子制备过程比较复杂。一批成熟的黑曲霉孢子需要经过平板筛选，斜面 培养，茄子瓶培养，最后麸曲桶培养等逐级扩大培养过程，制备过程繁琐，活性筛选复杂，工 作量大，制备周期需要30d以上。同时，采用孢子接种方式培养种子工艺，仅孢子萌发需要 至少12h，因而成熟种子培养时间较长。
[0004] 传统黑曲霉孢子逐级扩大培养过程存在流程长且复杂、筛选工作量大、周期长等 缺点，需要消耗大量的原料成本以及运行成本。因而，如何改进黑曲霉孢子制备过程，缩短 成熟种子培养时间，降低生产成本，是柠檬酸发酵生产亟待解决的一个重要问题。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术存在的上述问题，基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培 养方法。本发明提供的黑曲霉种子连续培养方法，能直接减少黑曲霉孢子繁琐的培养过程， 同时可以有效缩短成熟种子培养时间，提高原料利用率。
[0006] 本发明的技术方案如下： 一种基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法，包括以下步骤： (1) 将黑曲霉孢子液接种至种子培养基，培养20~32h，制备成熟的种子液； (2) 成熟的种子液经过分散器处理，得到分散菌丝种子液； (3) 将步骤（2)得到的部分分散菌丝种子液以5~15% (v/v)接种量转接至发酵培养基 发酵，当发酵培养基还原糖浓度低于〇. 5%时发酵结束； (4) 将步骤（2)得到的部分分散菌丝种子液以5~15% (v/v)接种量接种至种子培养基， 培养16~24h，制备得到下一级成熟的种子液，然后回到步骤（2)，即实现黑曲霉种子连续培 养。
[0007] 步骤（1)中接种后黑曲霉孢子液浓度为4(Γ55万个/ml接种。步骤（1)和步骤（4) 中的种子培养基的总糖8~12%，总氮0. 15~0. 4%。
[0008] 步骤（2)中成熟的种子液经过分散器处理，菌体的菌球或菌块平均直径 4(Tl00um。步骤（3)中的发酵培养基的总糖14?16%，总氮0. 05?0. 15%。
[0009] 所述种子培养基、发酵培养基为淀粉质原料液化液配制的培养基，原料包括玉米 粉，木薯，红薯。其他菌丝经过分散处理的微生物发酵，均适用本技术。
[0010] 本发明有益的技术效果在于： 传统的柠檬酸生产菌种的黑曲霉孢子逐级扩大培养存在流程复杂、周期长、孢子活力 筛选工作量大、种子培养周期长等问题，本发明基于菌丝球分散技术，采用分散菌丝替代传 统孢子接种实现黑曲霉种子连续培养，直接减少传统种子培养方式中孢子逐级扩大培养工 艺，缩短种子培养周期，降低原料与能量消耗；同时分散菌丝颗粒缠绕的菌丝较稀薄，利于 传质与溶氧，提高糖酸转化率。
[0011] 本发明具有以下优点： (1) 黑曲霉种子连续培养，直接减少孢子逐级扩大培养过程，减少此过程的原料消耗成 本与运行成本； (2) 采用分散的菌丝接种培养种子液，直接缩短孢子接种方式的孢子萌发时间，减少成 熟种子培养时间，减少过程运行成本； (3) 与传统菌丝球接种发酵相比，采用相对分散的菌丝接种发酵方式，增大与介质接触 的比表面积，利于传质与溶氧，提高糖酸转化率。
[0012] 本发明中种子连续培养10批次以上，从种子发酵结果看，糖酸转化率> 98%，发酵 周期6(T70h，柠檬酸发酵水平正常。
【具体实施方式】
[0013] 在下面所有的实施方案中，总糖、还原糖采用菲林试剂滴定法，柠檬酸的测定采用 0. 1429mol/L的NaOH滴定，孢子计数采用血球计数板。菌丝分割采用高速分散机处理。其 它无特殊说明，均采用本领域常用的知识和方法。下面实施例中的黑曲霉种子的来源是宜 兴协联生物化学有限公司生产菌种。
[0014] 实施例1 : 葡萄糖与豆柏粉分别配制种子培养基（总糖为8%，总氮0. 15%)与发酵培养基（总糖为 16%，总氮0. 15%);移种后孢子液浓度为55万个/ml接种；培养20h，得到成熟的种子液，种 子液菌丝经分散器分散，处理后的菌球平均直径为l〇〇um，分别接入下一级种子培养基与发 酵培养基，接种量均为5%。其中接入下一级种子培养基的，种子培养24h，种子液经分散器 分散，处理后的菌球平均直径80um，分别接入下一级种子培养基与发酵培养基；其中接入 下一级发酵培养基的，当发酵培养基中还原糖浓度降至0. 5%以下时发酵结束，如此循环。
[0015] 发酵第一批次结束时，发酵酸度15.65% (v/v)，糖酸转化率97. 8%，发酵周期64h ; 循环8次时，发酵酸度15. 74% (v/v)，糖酸转化率98. 4%，发酵周期65h。如此循环10次，糖 酸转化率> 98%，发酵周期< 65h，柠檬酸发酵水平正常。
[0016] 实施例2: 玉米粉与去离子水按1:3比例在60°C左右的配料罐中混合均匀，加入氢氧化钙将pH调 至6. 0,按25U/g玉米粉加入高温α -淀粉酶，经过二次喷射液化，经碘试合格(浅棕色)，得 到玉米液化混液；80%的混液经过板框过滤得到玉米液化清液。玉米液化混液与清液按照 一定的比例混合配制种子培养基（总糖10%，添加一定量的硫酸铵调节总氮0.4%)与发酵 培养基（总糖14%，总氮0. 05%)。移种后孢子液浓度为58万个/ml接种；培养26h，得到成 熟的种子液，种子液菌丝经分散器分散，处理后的菌球平均直径为55um，分别接入下一级种 子培养基与发酵培养基，接种量分别为15%(v/ v)，10%(v/v)。其中接入下一级种子培养基 的，种子培养16h，种子液经分散器分散，处理后的菌球平均直径lOOum，分别接入下一级种 子培养基与发酵培养基；其中接入下一级发酵培养基的，当发酵培养基中还原糖浓度降至 0. 5%以下发酵结束，如此循环。
[0017] 发酵第一批次结束时，发酵酸度13. 78% (v/v)，糖酸转化率98. 4%，发酵周期65h ; 循环7次时，发酵酸度13. 8% (v/v)，糖酸转化率98. 6%，发酵周期65h。如此循环10次，糖酸 转化率> 98%，发酵周期< 65h，柠檬酸发酵水平正常。
[0018] 实施例3: 同实施例2,玉米粉与水按照一定的比例混合均匀，经过二次喷射液化得到玉米液化混 液，玉米液化混液与水按照一定的比例混合，添加一定量的硫酸铵配制种子培养基（总糖 8%，总氮0. 2%)。木薯粉与水按照1:4比例在60°C左右的配料罐中混合均匀，加入氢氧化钙 将pH调至5. 8,按25U/g木薯粉加入高温α -淀粉酶，经过二次喷射液化，经碘试合格，得到 木薯液化液；木薯液化液与水按照一定的比例混合，添加一定量的硫酸铵，配制发酵培养基 (总糖15. 6%，总氮0. 076%)。移种后孢子液浓度为48万个/ml接种；培养32h，得到成熟的 种子液，种子液菌丝经分散器分散，处理后的菌球平均直径为68um，分别接入下一级种子培 养基与发酵培养基，接种量分别为1〇%(ν/ν)，15%(v/v)。其中接入下一级种子培养基的，种 子培养24h，种子液经分散器分散，处理后的菌球平均直径51um，分别接入下一级种子培养 基与发酵培养基；其中接入下一级发酵培养基的，当发酵培养基中还原糖浓度降至〇. 5%以 下发酵结束，如此循环。
[0019] 发酵第一批次结束时，发酵酸度15. 41% (v/v)，糖酸转化率98. 8%，发酵周期64h ; 循环8次时，发酵酸度15. 47% (v/v)，糖酸转化率99. 2%，发酵周期63h。如此循环10次，糖 酸转化率> 98%，发酵周期< 65h，柠檬酸发酵水平正常。
[0020] 实施例4 : 同实施例2,玉米粉与水按照一定的比例混合均匀，经二次喷射液化得到玉米液化混 液，玉米液化混液与水按照一定的比例混合，添加一定量的硫酸铵配制种子培养基（总糖 9%，总氮0. 18%)。同实施例3,木薯粉与水按照1:4比例混合经二次喷射液化，得到木薯液化 液；木薯液化液、玉米液化混液与水按照一定的比例混合，配制发酵培养基（总糖15. 8%，总 氮0. 09%)。移种后孢子液浓度为40万个/ml接种；培养25h，得到成熟的种子液，种子液菌 丝经分散器分散，分散后的菌球平均直径为72um，分别接入下一级种子培养基与发酵培养 基，接种量分别为15%(v/v)，15%( v/v)。其中接入下一级种子培养基的，种子培养20h，种 子液经分散器分散，处理后的菌球平均直径66um，分别接入下一级种子培养基与发酵培养 基；其中接入下一级发酵培养基的，当发酵培养基中还原糖浓度降至〇. 5%以下发酵结束， 如此循环。
[0021] 发酵第一批次结束时，发酵酸度15. 46%(v/v)，糖酸转化率97. 89%，发酵周期63h ; 循环10次时，发酵酸度15. 66% (v/v)，糖酸转化率99. 1%，发酵周期64h。如此循环10次，糖
【权利要求】
1. 一种基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法，其特征在于包括以下 步骤： (1) 将黑曲霉孢子液接种至种子培养基，培养20~32h，制备成熟的种子液； (2) 成熟的种子液经过分散器处理，得到分散菌丝种子液； (3) 将步骤（2)得到的部分分散菌丝种子液以5~15% (v/v)接种量转接至发酵培养基 发酵，当发酵培养基还原糖浓度低于〇. 5%时发酵结束； (4) 将步骤（2)得到的部分分散菌丝种子液以5~15% (v/v)接种量接种至种子培养基， 培养16~24h，制备得到下一级成熟的种子液，然后回到步骤（2)，即实现黑曲霉种子连续培 养。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)中接种后黑曲霉孢子液浓度为 40?55万个/ml接种。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)和步骤（4)中的种子培养基的总 糖8?12%，总氮0· 15?0· 4%。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2)中成熟的种子液经过分散器处理， 菌体的菌球或菌块平均直径4(Tl00um。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3)中的发酵培养基的总糖14~16%， 总氮 0· 05?0· 15%。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子培养基、发酵培养基为淀粉质原 料液化液配制的培养基，原料包括玉米粉，木薯，红薯。
7. 根据权利要求1飞任一项所述的方法，其特征在于其他菌丝经过分散处理的微生物 发酵，均适用本技术。
【文档编号】C12R1/685GK104099253SQ201410329652
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】石贵阳, 王宝石, 张 杰, 胡志杰, 蒋小东, 孙福新, 李赢, 张梁, 李由然, 丁重阳, 顾正华 申请人:江南大学, 宜兴协联生物化学有限公司