检测脂环酸杆菌属微生物的组合物的制作方法
【专利摘要】检测脂环酸杆菌属微生物的组合物。本发明提供了核酸，核酸集合物，载体，试剂盒及用于食物中微生物的灵敏及特异检测的方法。所述核酸包括选自SEQ ID NOs：1-15的核苷酸序列，且长度至多为35个核苷酸。
【专利说明】检测脂环酸杆菌属微生物的组合物
[0001] 将电子提交的材料以引用方式并入本文
[0002] 同此一并提交的并标识如下：2013年6月4日，文件名为《712628ST25. TXT》的一 个13, 658字节ASCII (文本）的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表以引用方式全部并入本 文。
【背景技术】
[0003] 微生物（例如细菌）可能使生产过程中的或生产后的食物（例如果汁）变质。有 些微生物可能导致食物变质和几种不良作用之任一种或多种，例如难闻的气味，讨厌的味 道，以及食物食用不安全。未能准确而快速地检测使食物变质的微生物的存在可能增加食 物变质的风险。快速而准确检测使食物变质的微生物的障碍可能包括，例如：用于检测该微 生物的传统微生物学方法的持续时间冗长。该些传统方法可能需平均10-12天完成。准确 检测的另一个障碍可能包括，例如：一些使食物变质的微生物的基因组序列与不使食物变 质的微生物的基因组序列相似。
[0004] 据此，需求用于检测使食物变质的微生物的改良组合物及方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的实施方案提供了核酸，其包含选自SEQ ID NOs :1-15的核苷酸序列且长 度至多为35个核苷酸。
[0006] 本发明的另一实施方案提供了核酸集合物，包括两种或更多种核酸，其中，每种核 酸包含选自SEQ ID NOs :1-15的核苷酸序列且长度至多为35个核苷酸。
[0007] 本发明的又一实施方案提供了载体，包括固定在该载体上的本发明的核酸或核酸 集合物。
[0008] 本发明的另一实施方案提供了用于检测食物中一种或多种脂环酸杆菌属微生物 的存在的方法，该方法包括：(a)获得至少一种包含从食物中分离的微生物核酸的测试样 品；(b)在允许本发明的核酸与所述微生物核酸之间形成复合物的条件下使本发明的核 酸、核酸集合物或载体之任一种与所述至少一种测试样品接触；（c)检测所述复合物；以及 (d)比较所述复合物在所述至少一种测试样品中的存在与缺少微生物核酸的阴性样品中复 合物不存在，其中所述复合物的检测表明一种或多种脂环酸杆菌属微生物的存在。
[0009] 本发明的优选实施方案提供了用于检测食物中一种或多种使食物变质的脂环酸 杆菌属微生物的存在的方法，该方法包括：(a)获得至少一种包含从食物中分离的微生物 核酸的测试样品；(b)在允许本发明的核酸与所述微生物核酸之间形成复合物的条件下使 本发明的核酸、核酸集合物或载体之任一种与所述至少一种测试样品接触；(c)检测所述 复合物；以及（d)比较所述复合物在所述至少一种测试样品中的存在与缺少微生物核酸的 阴性样品中复合物不存在，其中所述复合物的检测表明一种或多种使食物变质的脂环酸杆 菌属微生物的存在。
【具体实施方式】
[0010] 本发明的实施方案提供了核酸，包括选自SEQ ID NOs :1-15的核苷酸序列且长度 至多为35个核苷酸。在本发明的实施方案中，核苷酸序列可能包括附加核苷酸以至于长 度至多为35个核苷酸。在这点上，本发明的实施方案提供了选自SEQ ID NOs :31-74且长 度至多为35个核苷酸的核苷酸序列。在本发明的又一实施方案中，核酸包括选自SEQ ID NOs :16-30的核苷酸序列且长度至多为35个核苷酸。核酸可能具有至多为35个核苷酸的 任何长度。例如：核酸可能具有至多为34,33,32,31，30,29,28,27,26,25,24,23,22,21， 20,19,18,17,16或15个核苷酸的长度。在本发明的又一实施方案中，核酸可能由选自SEQ ID NOs :1-74的核苷酸序列组成。
[0011] 在一实施方案中，核酸是分离或纯化的。本发明的核酸提供正向引物、反向引物以 及探针，其可有利地与微生物核酸特异地杂交，用于检测食物中一种或多种微生物的存在。 在一些实施方案中，引物与探针与特定的微生物属（此处称属特异性核酸）内的多个物种 的核酸特异地杂交。在其他实施方案中，引物与探针与特定的微生物种（此处称种特异性 核酸）的核酸特异地杂交。
[0012] 本发明的属特异性核酸可用于检测食物样品中一种或多种可能或不可能使食物 变质的微生物的存在。在本发明的实施方案中，该属特异性核酸可以特异地检测脂环酸 杆菌属内的多种不同的微生物菌种之两种或更多种的存在。采用本发明的属特异性核酸 检测的脂环酸杆菌属菌种的数量不限于且可包括，例如，2,3,4,5,6,7,8,9，10，11，12，13， 14,15,16,17,18,19, 20, 21，22, 23或更多的脂环酸杆菌属菌种。采用本发明的属特异性 核酸检测的脂环酸杆菌属菌的数量不限于且可包括，例如，10, 20, 30,40, 50,60, 70,80,90， 100,110,120,130,140,150,160,170,180,190, 200或更多的脂环酸杆菌属菌。通过本发明 的属特异性核酸特异地检测的微生物示例菌种包括酸热脂环酸杆菌（Alicyclobacillus acidocaldarius)，污染脂环酸杆菌（Alicyclobacillus contaminans)，二硫化物氧化脂环 酸杆菌（Alicyclobacillus disulfidooxidans)，苛求污染脂环酸杆菌（Alicyclobacillus fastidiosus)，氧化铁脂环酸杆菌（Alicyclobacillus ferrooxydans)，橘皮苷脂环酸杆 菌（Alicyclobacillus hesperidum),果实脂环酸杆菌（Alicyclobacillus pomorum), 糖脂环酸杆菌（Alicyclobacillus sacchari)，嗜酸耐热异养菌（Alicyclobacillus sendaiensis),静网市脂环酸杆菌（Alicyclobacillus shizuokensis)，抗逆性脂 环酸杆菌（Alicyclobacillus tolerans)，火神脂环酸杆菌（Alicyclobacillus vulcanalis)，腾冲市脂环酸杆菌（Alicyclobacillus tengchongenesis)，酸 土脂环 酸杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris)，嗜酸脂环酸杆菌（Alicyclobacillus acidiphilus)，环庚基脂环酸杆菌（Alicyclobacillus cycloheptanicus)以及草脂环酸杆 菌（Alicyclobacillus herbarius)的一种或多种。在优选实施方案中，本发明的属特异 性核酸特异地检测酸土脂环酸杆菌，嗜酸脂环酸杆菌，环庚基脂环酸杆菌以及草脂环酸杆 菌的一种或多种。在本发明的实施方案中，本发明的属特异性核酸可包含或由选自SEQ ID NOs :1-3,16-18及31-41的核苷酸序列组成。
[0013] 本发明的种特异性核酸可能用于检测一种或多种使食物样品变质的微生物的存 在。在本发明的实施方案中，本发明的核酸可能特定地检测使食物样品变质的脂环酸杆菌 属内的多种不同的微生物菌种之任一种或多种的存在。可通过本发明的核酸特异地检测的 使食物样品变质的微生物示例菌种包括酸土环脂酸杆菌，嗜酸脂环酸杆菌，环庚基脂环酸 杆菌以及草脂环酸杆菌的一种或多种。在本发明的实施方案中，该种特异性核酸可能包含 或由选自SEQ ID N0s:4-15,19-30及42-74的核苷酸序列组成。表1-4列出了本定明的属 特异性核和种特异性核酸以及可采用本发明的核酸特异地检测的微生物的示例菌种。
[0014] 表 1
[0015]
【权利要求】
1. 核酸，其包含选自SEQ ID NOs :1-15的核苷酸序列，且长度至多为35个核苷酸。
2. 权利要求1的核酸，其包含选自SEQ ID NOs :31-74的核苷酸序列，且长度至多为35 个核苷酸。
3. 权利要求1的核酸，其包括选自SEQ ID NOs :16-30的核苷酸序列，且长度至多为35 个核苷酸。
4. 权利要求1-3之任一项的核酸，由选自SEQ ID NOs :1-74的核苷酸序列组成。
5. 核酸集合物，包括两种或更多种权利要求1-3之任一项的核酸。
6. 权利要求5的集合物，其中，所述两种或更多种核酸包括两种或更多种不同的核酸。
7. 权利要求5的集合物，其中，所述两种或更多种核酸包括： (a) 包含选自 SEQ ID NOs :1，4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-34,42-45,53-57,67 及 71-72的核苷酸序列的第一核酸；以及 (b) 包含选自 SEQ ID NOs :2, 5,8,11，14,17, 20, 23, 26, 29, 35-41，46-52, 58-66,68-70 以及73-74的核苷酸序列的第二核酸； 其中，所述两种或更多种核酸之每种的长度至多为35个核苷酸。
8. 权利要求5的集合物，其中，所述两种或更多种核酸包含： (a) SEQ ID NOs :1-2 ; (b) SEQ ID NOs :4-5 ; (c) SEQ ID NOs :7-8 ; (d) SEQ ID NOs :10-11 ;或 (e) SEQ ID NOs :13-14 ; 其中，所述两种或更多种核酸之每种的长度至多为35个核苷酸。
9. 权利要求5的集合物，其中，所述两种或更多种核酸包含： (a) SEQ ID NOs :16-17 ； (b) SEQ ID NOs :19-20 ; (c) SEQ ID NOs :22-23 ; (d) SEQ ID NOs :25-26 ;或 (e) SEQ ID NOs :28-29。
10. 权利要求5的集合物，其中，所述两种或更多种核酸包含： (a) 选自 SEQ ID NOs :1，4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-34,42-45,53-57,67及71-72 的第一核酸； (b) 选自 SEQ ID NOs :2, 5,8,11，14,17, 20, 23, 26, 29, 35-41，46-52, 58-66,68-70 以及 73-74的第二核酸： (c) 选自 SEQ ID NOs :3,6,9,12,15,18, 21，24, 27 以及 30 的第三核酸； 其中，所述两种或更多种核酸之每种的长度至多为35个核苷酸。
11. 权利要求5的集合物，其中，所述两种或更多种核酸包含： (a) SEQ ID NOs ：1-3 ； (b) SEQ ID NOs :4-6 ; (c) SEQ ID NOs :7-9 ; (d) SEQ ID NOs :10-12 ;或 (e)SEQ ID NOs :13-15 ; 其中所述核酸之每一种的长度至多为35个核苷酸。
12. 权利要求5的集合物，其中，所述两种或更多种核酸由如下组成： (a) SEQ ID NOs :16-18 ； (b) SEQ ID NOs :19-21 ; (c) SEQ ID NOs :22-24 ； (d) SEQ ID NOs :25-27 ;或 (e) SEQ ID NOs :28-30。
13. 载体，包括根据权利要求1-3之任一项的且固定在该载体上的核酸。
14. 根据权利要求13的载体，进一步地包括可检测标记。
15. 检测食物中一种或多种脂环酸杆菌属微生物存在的方法，该方法包括： (a) 获得至少一种包含从食物中分离的微生物核酸的测试样品； (b) 在允许权利要求1-3之任一项的核酸与所述微生物核酸之间形成复合物的条件下 使所述权利要求1-3之任一项的核酸与所述至少一测试样品接触； (c) 检测所述复合物；以及 (d) 比较所述复合物在所述至少一种测试样品中的存在与缺少微生物核酸的阴性样品 中复合物不存在，其中所述复合物的检测表明一种或多种脂环酸杆菌属微生物的存在。
16. 根据权利要求15的方法，包括检测一种或多种使食物变质的微生物的存在。
17. 根据权利要求15的方法，包括检测一种或多种选自酸土脂环酸杆菌 (Alicyclobacillus acidoterrestris)，嗜酸脂环酸杆菌（Alicyclobacillus acidiphilus)，环庚基脂环酸杆菌（Alicyclobacillus cycloheptanicus)及草脂环酸杆菌 (Alicyclobacillus herbarius)的微生物的存在。
18. 根据权利要求15的方法，其中所述食物是饮料。
19. 根据权利要求15的方法，其中所述食物是果汁。
【文档编号】C12R1/01GK104232629SQ201410354031
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2013年6月6日
【发明者】王彧, 包赟 申请人:帕尔公司