新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株反向遗传操作系统及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的反向遗传操作系统及其应用，该系统包含：转录质粒，该转录质粒包括所述受控于真核启动子的新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的全基因组cDNA序列；三个受控于真核启动子的转录辅助质粒，该辅助质粒分别包括编码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列以及编码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列。利用本发明建立的反向遗传操作系统，成功救获了野生型重组新城疫病毒，为进一步开展以该新城疫病毒为载体的疫苗研制、肿瘤溶瘤治疗病毒以及NDV病毒相关的基础研究奠定了基础。
【专利说明】新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株反向遗传操作系统 及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒遗传操作领域，更具体地，本发明涉及一种新城疫病毒Mukteswar 中等毒力疫苗株反向遗传操作系统及其应用。
【背景技术】
[0002] Angela Romer-Oberdo rfer 等与 ΒΕΝ Ρ· H. PEETERS 等于 1999 年分别首次 发 表文章 《Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA》（Journal of General Virology (1999),80,2987 - 2995)和《Rescue of Newcastle Disease Virus from Cloned cDNA:Evidence that Cleavability of the Fusion Protein Is a Major Determinant for Virulence》 （JOURNAL OF VIROLOGY, Junel999, p. 5001 - 5009)，公开了一种利用T7启动子控制转录系统，来拯救新 城疫病毒弱毒株，之后又有一些人陆续拯救了不同毒株的新城疫病毒，所有这些新城疫病 毒的拯救系统均是受控于T7启动子，该类新城疫病毒反向遗传操作系统均是利用表达 T7RNA聚合酶的特殊细胞系，并需要表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒额外提供T7RNA聚合 酶来有效拯救重组新城疫病毒。在这一类系统中，新城疫病毒的全基因组cDNA克隆于T7 启动子之下，其拯救病毒所需的必需蛋白NP、P和L的基因也多构建于受T7启动子控制的 质粒上。在拯救病毒的过程中，首先需要用表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒感染可以表达 T7RNA聚合酶的细胞系（如BHK-T7)，之后再将辅助质粒与全基因组质粒共转染该细胞系， 依靠细胞内生成的T7RNA聚合酶来转录出新城疫病毒的基因组RNA，并与辅助质粒表达的 NP、P和L装配成核衣壳，最后以出芽方式生成重组新城疫病毒。该种反向遗传操作系统存 在的问题是需要制备稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系，制备细胞系的过程复杂，技术要求 高，周期长，并且细胞系的培养过程中需要不断添加维持压力的抗生素以保持其稳定表达 T7RNA聚合酶，但是随着细胞传代次数的增加，其表达T7RNA聚合酶的能力会不断降低，直 至消失；另外在转染过程中感染的表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒会一直存在于细胞中， 不但在拯救重组新城疫病毒过程中需要添加阿拉伯糖苷以抑制此痘病毒的复制，而且在拯 救出重组病毒后还需要通过过滤或多次稀释传代的方式去除痘病毒，这不仅会降低新城疫 病毒的拯救效率，还存在有痘病毒污染的风险，在这种方法的研究中，如果不过滤转染的细 胞培养物，新城疫病毒的拯救效率较高，但是去除痘病毒很复杂，如果过滤转染的细胞培养 物，则新城疫病毒的拯救效率很低，甚至失败。
[0003] 为了更有效利用新城疫病毒这一良好载体，针对以上所述现有技术中的缺点，我 们建立的新城疫病毒中等毒力Mukteswar疫苗株反向遗传操作系统完全抛弃了原来使用 的T7启动子控制下的T7RNA聚合酶系统，而是利用所有培养细胞系具有的真核细胞启动 子，而且辅助质粒的表达也是受控于真核启动子，这一系统可以在多种细胞系上完成拯救 病毒的过程，效率不受影响（如Vero、BHK21、DFEI等细胞系），我们的拯救系统使用的细胞 系是广泛用于疫苗生产的Vero细胞，这对于今后开发本毒株为载体的疫苗奠定了安全基 础。目前国内研究者已经拯救出新城疫LaSota弱毒疫苗株（葛金英等，Newcastle Disease Virus-Based Live Attenuated Vaccine Completely Protects Chickens and Mice from Lethal Challenge of Homologous and Heterologous H5N1Avian Influenza Viruses)以 及新城疫病毒强毒株，这些反向遗传操作系统也均是建立在T7启动子控制下的，但是弱毒 株由于毒力低下，利用效果有限，而强毒株存在生物安全问题。目前还没有别人拯救出新城 疫病毒Mukteswar株，这株病毒是新城疫病毒中等毒力株，该毒株反向遗传操作系统的建 立，将为研究新城疫病毒低毒力株与高毒力株之间的遗传演变提供有力工具，也为开发以 此毒株为载体的疫苗奠定了基础。
[0004] 本发明克服了现有技术中必须由特定细胞系和重组痘病毒提供T7RNA聚合酶的 缺点，提供了一种可以使用多种细胞系来拯救重组新城疫病毒的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的反向遗 传操作系统，该系统包含：
[0006] (1)转录质粒，该转录质粒包括受控于真核启动子的新城疫病毒Mukteswar中等 毒力疫苗株的全基因组cDNA序列；
[0007] (2)三个转录辅助质粒，该辅助质粒分别包括编码所述新城疫病毒Mukteswar中 等毒力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列、编码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗 株的磷酸蛋白（P)的cDNA序列以及编码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大 聚合酶蛋白（L)的cDNA序列，三个辅助质粒均受控于真核启动子。
[0008] 在本发明所述的反向遗传操作系统中，优选的，所述转录质粒还包括包括编码具 有自我剪切功能的核酸酶的序列、编码丁肝核酶（Rbz)的序列以及位于全基因组cDNA序列 内部的遗传标签，所述全基因组cDNA序列位于真核启动子和编码具有自我剪切功能的核 酸酶的序列之后，编码丁肝核酶（Rbz)的序列之前，共同构成转录模板。
[0009] 在本发明所述的反向遗传操作系统中，优选的，其中所述具有自我剪切功能的核 酸酶是拳头状核酶（HamRz)，所述的遗传标签是位于全基因组cDNA序列内部的Notl酶切位 点以及Bgl II酶切位点，所述的真核启动子为CMV启动子。
[0010] 在本发明所述的反向遗传操作系统中，优选的，所述的转录质粒的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示，命名为 pCI-NDV。 toon] 在本发明所述的反向遗传操作系统中，优选的，所述三个转录辅助质粒是通过将 编码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列、编码所述新 城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的磷酸蛋白（P)的cDNA序列以及编码所述新城疫病 毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合酶蛋白（L)的cDNA序列分别克隆入载体pCI中得 到的。
[0012] 在本发明所述的反向遗传操作系统中，优选的，编码所述新城疫病毒Mukteswar 中等毒力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列如SEQ ID Ν0· 2所示，编码所述新城疫病毒 Mukteswar中等毒力疫苗株的磷酸蛋白（P)的cDNA序列如SEQ ID N0. 3所示，编码所述新城 疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合酶蛋白（L)的cDNA序列如SEQ ID N0. 4所示， 其中，编码核蛋白（NP)的cDNA序列与编码磷酸蛋白（P)的cDNA序列分别利用Nhel和Xbal 酶切位点构建于PCI载体上，编码大聚合酶蛋白（L)的cDNA序列是利用Nhel和Notl酶切 位点构建于PCI载体上，获得的三个转录辅助质粒分别命名为pCI-NP，pCI-P以及pCI-L。
[0013] 在本发明所述的反向遗传操作系统中，优选的，还包含用于病毒拯救的宿主细胞， 所述宿主细胞是Vero细胞，BHK21细胞或DFEI细胞，更优选为Vero细胞。
[0014] 本发明的另一个目的是提供了一种利用以上任一项所述的反向遗传操作系统拯 救重组新城疫病毒的方法，包括以下步骤：
[0015] (1)使用以上任一项所述的反向遗传操作系统中的转录质粒和转录辅助质粒共转 染用于病毒拯救的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；
[0016] (2)从转染细胞的上清液中拯救重组新城疫病毒。
[0017] 在本发明所述的方法中，优选的，转录质粒pCI-NDV与辅助质粒pCI-NP，pCI-P以 及pCI-L按照质量比为4:2:2:1的比例进行转染。
[0018] 本发明的再一个目的是提供所述的反向遗传操作系统在拯救重组新城疫病毒 Mukteswar株中的应用。及所述的反向遗传操作系统在制备以新城疫病毒株为骨架的活载 体疫苗中的应用。
[0019] 相较于现有技术，本发明的有益效果是：
[0020] 本发明中新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株反向遗传操作系统的建立，完全 抛弃了现有技术所使用T7RNA聚合酶系统，没有繁琐的细胞系制备以及维持过程，也不需 要制备表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒的复杂技术，因此在重组病毒的拯救过程中不需要 使用重组痘病毒，也就没有抑制痘病毒过度复制和病毒拯救后清除痘病毒的繁琐过程。本 发明可以利用所有的培养细胞系来拯救重组新城疫病毒，这为今后建立并拯救该类副粘病 毒奠定基础。在本发明的重组新城疫病毒拯救系统中，我们使用的细胞系优选为在疫苗生 产领域广为应用的Vero细胞系，该细胞系是目前公认的疫苗生产的安全细胞系，这为今后 开发以这株新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株株为载体的疫苗奠定安全基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为新城疫病毒Mukteswar株全基因组cDNA的构建示意图；
[0022] 全基因组分为4段进行克隆，并在全基因组cDNA克隆中加入遗传标签，分别是位 于基因组4953的Notl酶切位点和位于8597的Bgl II酶切位点，基因组头部是拳头状核 酶（HamRz)，在核酶前是与pCI载体连接的酶切位点-Nhel，第一段与第二段之间通过酶切 位点SacII连接，第二段与第三段之间通过酶切位点Mlul连接，第三段与第四段之间通过 酶切位点Mlul连接，第四段尾部是丁肝核酶（Rbz)，NotI是全基因组cDNA克隆与pCI载体 连接的酶切位点；
[0023] 图2为新城疫病毒Mukteswar株反向遗传操作系统的质粒构成示意图；
[0024] 三个辅助质粒均构建于pCI载体上，受CMV启动子控制；
[0025] 图3为新城疫病毒Mukteswar株反向遗传操作系统转染Vero细胞，拯救出重组病 毒的不意图；
[0026] 代表细胞的圆圈中的多个小圆圈分别表示辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L表达 的三种蛋白，图中右下角的三个带有多个突起的圆圈表示拯救出的重组病毒；
[0027] 图4为转染上清接种细胞后，拯救出的重组新城疫病毒Mukteswar株感染细胞形 成合胞体的显微镜下图片，以及正常细胞的图片；
[0028] 图4A与图4B是将转染上清接种Vero细胞40h后在ΙΟΟχ物镜下观察的结果，图 4C图是200x物镜下观察的结果，图中的圆斑是形成的合胞体；图4D图是正常Vero细胞对 昭.
[0029] 图5为利用本病毒基因组特异性的引物对拯救得到的重组病毒进行PCR扩增的结 果。
【具体实施方式】
[0030] 以下通过实施例并结合附图来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅 用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
[0031] 实施例1新城疫病毒Mukteswar株反向遗传操作系统的构建
[0032] 1、材料来源
[0033] 新城疫病毒Mukteswar株购自哈尔滨维科生物技术开发公司；质粒pCI购自
[0034] PR0MEGA公司，pBluescript II ks(+/_)Phagemids购自上海捷瑞生物技术有限公 司；DNA聚合酶购自TAKARA公司，T4DNA连接酶及其它限制性内切酶均购自NEB公司；病毒 RNA提取试剂盒和中量制备试剂盒购自QIAGEN公司，M-MLV反转录试剂盒和脂质体2000试 剂盒购自IVENTR0GEN公司。
[0035] 2、方法
[0036] 2. 1含有新城疫病毒Mukteswar株全基因组cDNA序列的转录质粒的构建
[0037] 为建立新城疫病毒Mukteswar株的反向遗传操作系统，必须首先构建相应的全基 因组cDNA克隆，在新城疫病毒全基因组cDNA的头部为具有自我剪切功能的拳头装核酶， 之后是病毒的全基因组cDNA，按顺序依次核酸蛋白基因（NP)、磷酸蛋白基因（P)、基质基因 (M)、融合蛋白基因（F)、血凝素蛋白基因（HA)和大聚合酶蛋白基因（L)，在基因组的尾部连 接有丁肝核酶。在全基因组cDNA的克隆中，我们根据病毒Mukteswar疫苗株基因序列的酶 切位点将，分为4段完成全基因组cDNA的克隆，并在全基因组cDNA克隆中加入遗传标签， 分别是位于基因组4953的Notl酶切位点和位于8597的Bgl II酶切位点，整个基因组cDNA 位于PCI载体的Nhel和Notl多克隆位点间（图1)。具体地，实验步骤如下：
[0038] 新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株接种9?11日龄SPF鸡胚的尿囊腔扩增 病毒，接种3天后，收获尿囊液，封装置于低温冰箱保存。利用QIAGEN的病毒RNA提取试 剂盒提取病毒RNA，按照说明书操作，之后利用IVENTR0GEN的M-MLV反转录试剂盒进行反 转录，再利用合成的特异性引物进行PCR，胶回收PCR产物并克隆到载体pBluescript II ks(+/_)Phagemids的EcoR V位点处。将新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的全基 因组cDNA序列依据酶切位点分为4段，各段克隆质粒经测序证实序列无误后，按照克隆策 略通过酶切、连接的方式将各段连接在一起克隆到PCI载体上，构建得到含有新城疫病毒 Mukteswar株全基因组cDNA序列的转录质粒，该质粒的完整核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 示,命名为pCI-NDV。
[0039] 2. 2新城疫病毒Mukteswar株中三个转录辅助质粒的构建
[0040] 编码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列如 SEQ ID N0. 2所示，编码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的磷酸蛋白（P)的cDNA 序列如SEQ ID NO. 3所示，编码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合酶蛋 白（L)的CDNA序列如SEQIDN0·4所示，其中，编码核蛋白（NP)的CDNA序列与编码磷酸 蛋白（P)的cDNA序列分别利用Nhel和Xbal酶切位点构建于pCI载体上，编码大聚合酶蛋 白（L)的cDNA序列是利用Nhel和Notl酶切位点构建于pCI载体上，获得的三个转录辅助 质粒分别命名为pCI-NP，pCI-P以及pCI-L (图2)。
[0041] 2. 3将上述含有新城疫病毒Mukteswar株全基因组cDNA序列的转录质粒和三个辅 助质粒分别转化感受态细胞ToplO,之后大体积摇菌，利用QIAGEN的质粒中量制备试剂盒 制备转染用的质粒，并测定各质粒的浓度。
[0042] 实施例2利用实施例1构建得到的反向遗传操作系统进行重组病毒的拯救
[0043] 1、方法：
[0044] 将Vreo细胞接种于6孔细胞培养板，待细胞单层长至60 %?80 %左右时开始 转染。用无血清DMEM培养基，洗涤细胞2遍，之后加入0pti-MEM，2ml/孔；转染试剂为 Invitrogen公司的脂质体2000试剂盒，转染按照试剂盒说明书进行，转录质粒pCI-NDV与 辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L按照质量比为4:2:2:1的比例，以每孔4ug的量进行转染， 转染6h?8h后，弃掉转染上清，加入含5% FBS的DMEM，在转染细胞基本全部死亡时，吸取 上清接种新的培养瓶内的Vero细胞，之后逐日观察细胞病变，当有显著的合胞体生成时， 表明拯救出重组病毒（图3)，之后可以接种拯救出的重组病毒于Vero细胞以扩增病毒，并 用1%的鸡红血球检测血凝价。
[0045] 2、结果
[0046] 为了鉴定获救的病毒，将转染过程中的上清液接种培养瓶内培养的Vero细胞，以 扩增病毒，野生型毒株产生显著的细胞病变，即有合胞体生成，可以进行血凝或RT-PCR试 验以检测重组病毒。显微镜观察结果发现：拯救出的重组新城疫病毒Mukteswar株感染 Vero细胞均有合胞体产生（图4A、图4B和图4C)，而正常的Vero细胞没有合胞体产生（图 4D)。将救获的病毒利用Trizol提取总RNA，利用随机引物进行反转录，之后利用本病毒基 因组特异性的引物进行PCR扩增，结果扩增出特异性目的条带（图5)。以上实验结果显示， 通过反向遗传操作技术，利用含有新城疫病毒Mukteswar株全基因组cDNA的转录质粒和三 个辅助转录质粒的克隆，成功拯救了重组新城疫病毒。
[0047] 本发明利用新城疫病毒Mukteswar株的反向遗传操作系统成功地拯救了重组新 城疫病毒，在本发明的重组新城疫病毒拯救系统中，我们使用的细胞系是在疫苗生产领域 广为应用的Vero细胞系，该细胞系是目前公认的疫苗生产的安全细胞系，这为今后开发以 这株新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株株为载体的疫苗奠定安全基础。
[0048] 以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的； 本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改 变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1. 一种新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的反向遗传操作系统，该系统包含： (1) 转录质粒，该转录质粒包括受控于真核启动子的新城疫病毒Mukteswar中等毒力 疫苗株的全基因组cDNA序列； (2) 三个转录辅助质粒，该辅助质粒分别包括编码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒 力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列、编码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的 磷酸蛋白（P)的cDNA序列以及编码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合 酶蛋白（L)的cDNA序列，三个辅助质粒均受控于真核启动子。
2. 根据权利要求1所述的反向遗传操作系统，其中所述转录质粒还包括编码具有自我 剪切功能的核酸酶的序列、编码丁肝核酶（Rbz)的序列以及位于全基因组cDNA序列内部的 遗传标签，所述全基因组cDNA序列位于真核启动子和编码具有自我剪切功能的核酸酶的 序列之后，编码丁肝核酶（Rbz)的序列之前，共同构成转录模板。
3. 根据权利要求2所述的反向遗传操作系统，其中所述具有自我剪切功能的核酸酶是 拳头状核酶（HamRz)，所述的遗传标签是位于全基因组cDNA序列内部的Notl酶切位点以及 Bgl II酶切位点，所述的真核启动子为CMV启动子。
4. 如权利要求1-3任一项所述的反向遗传操作系统，其中所述的转录质粒的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示，命名为pCI-NDV。
5. 根据权利要求1所述的反向遗传操作系统，其中所述三个转录辅助质粒是通过将编 码所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列、编码所述新城 疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的磷酸蛋白（P)的cDNA序列以及编码所述新城疫病毒 Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合酶蛋白（L)的cDNA序列分别克隆入载体pCI中得到 的。
6. 根据权利要求5所述的反向遗传操作系统，其中编码所述新城疫病毒Mukteswar 中等毒力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列如SEQ ID NO. 2所示，编码所述新城疫病毒 Mukteswar中等毒力疫苗株的磷酸蛋白（P)的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，编码所述新城 疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合酶蛋白（L)的cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示， 其中，编码核蛋白（NP)的cDNA序列与编码磷酸蛋白（P)的cDNA序列分别利用Nhel和Xbal 酶切位点构建于PCI载体上，编码大聚合酶蛋白（L)的cDNA序列是利用Nhel和Notl酶切 位点构建于PCI载体上，获得的三个转录辅助质粒分别命名为pCI-NP，pCI-P以及pCI-L。
7. 根据权利要求1-4中任何一项的反向遗传操作系统，其中还包含用于病毒拯救的宿 主细胞，所述宿主细胞是Vero细胞，BHK21细胞或DFEI细胞，优选为Vero细胞。
8. -种利用权利要求1-7任一项所述的反向遗传操作系统拯救重组新城疫病毒的方 法，包括以下步骤： (1) 使用权利要求1-7任一项所述的反向遗传操作系统中的转录质粒和转录辅助质粒 共转染用于病毒拯救的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞，优选的，转录质粒PCI-NDV与辅 助质粒口(：1-即，？(：1-?以及？(：1-1^按照质量比为4 :2:2:1的比例进行转染； (2) 从转染细胞的上清液中拯救重组新城疫病毒。
9. 根据权利要求1-7任一项所述的反向遗传操作系统在拯救重组新城疫病毒 Mukteswar株中的应用。
10. 根据权利要求1-7任一项所述的反向遗传操作系统在制备以新城疫病毒株为骨架 的活载体疫苗中的应用。
【文档编号】C12N7/01GK104195154SQ201410373399
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】王永 申请人:哈尔滨医科大学