基于硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程【技术领域】的硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增依次得到编码硝酸盐还原酶催化亚基及电子转移亚基的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列依次连接到共表达载体pETDuet‐1，最终获得重组共表达载体pETDuet‐NB‐NA；之后将该硝酸盐还原酶表达载体转化到大肠杆菌表达菌株。本发明针对现有技术存在的由于硝酸盐还原酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，应用基因工程手段实现硝酸盐还原酶体外的大量表达合成，对于次生盐渍化土壤的快速修复乃至实现精准农业具有重大意义。
【专利说明】基于硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种生物基因工程【技术领域】的基因及其工程菌株，具体是一种灰 略红链霉菌的基于硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法。
【背景技术】
[0002] 随着设施农业的发展，温室栽培面积不断扩大，氮素化肥的使用量大幅上升，大大 超过了植物的需求量。由于土壤中过量的硝酸盐未能及时被植物吸收并转化，造成大量的 盐分离子在土壤中积累，最终形成设施载体土壤次生盐渍化。
[0003] 研究表明，设施栽培次生盐渍化土壤中除HC03 _外，Na+、K+、Ca2+、Mg2+、C1 -、S042 一、 Ν〇Γ均有不同程度的积累。研究表明，该类型土壤中的阳离子组成，Na+已不是主要离子， 阳离子以Ca2+为主，其含量约占阳离子总量的60%以上，Mg 2+含量在15%-20%;阴离子以 N03_和S042 _为主，N03_含量约为阴离子总量的56% -76%。N03_可在植物体内累积，最终 通过食物链进入人体，过量的N03 +在体内易被还原成为N02' N02 +可使细胞组织缺氧，严重 时使人窒息死亡。因此治理设施栽培中过量的硝态氮已成为设施农业一项重要且刻不容缓 的工作。目前针对我国设施栽培大棚盐渍化，已经采取了一些治理措施，如灌水洗盐，土壤 改良剂法和半腐熟有机肥法等方法。虽然这些方法有不少成功应用的实例，但也存在较多 的不足：灌水洗盐会把硝态氮淋洗到地下，不仅造成土壤氮素的损失，且污染地下水；土壤 改良剂法成本比较高，易产生二次污染；半腐熟有机肥法则存在肥效慢，使用不便等缺点。
[0004] 与传统治理次生盐渍化方法相比，生物法尤其是生物酶法有许多突出优点，比如 见效快、能耗低、不会给周边环境带来负担。然而，硝酸盐还原酶在微生物体内的表达量普 遍很低，且多为胞内表达，因此应用的范围和效果十分有限，不能满足修复环境的需求。于 是构建一种高效的硝酸盐还原酶表达载体及工程菌株，对实现硝酸盐还原酶的高效表达及 设施栽培盐渍化土壤的快速修复就尤为关键。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术存在的由于硝酸盐还原酶在生物体内多为胞内酶且表达量 较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，提出一种基于硝酸盐还原酶的工程菌及其实 现方法，能够应用基因工程手段实现其体外的大量表达合成，对于次生盐渍化土壤的快速 修复乃至实现精准农业具有重大意义。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 本发明涉及一种硝酸盐还原酶的工程菌，该工程菌为外源表达硝酸盐还原酶的大 肠杆菌。
[0008] 所述的硝酸盐还原酶具体为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1 硝酸盐还原酶编码基因，由硝酸盐还原酶催化亚基SG - ΝΑ和电子转移亚基SG - NB构成，其 核苷酸序列分别为2394bp和2127bp，分别编码797和708个氨基酸。
[0009] 所述的硝酸盐还原酶催化亚基SG-ΝΑ的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，氨基 酸序列如SEQ ID No. 3所示；硝酸盐还原酶电子转移亚基SG - NB的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0010] 所述的硝酸盐还原酶编码基因通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得。
[0011] 所述的灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，现保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5706,保藏日期为 2012年1月9日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 邮编 100101。
[0012] 本发明涉及上述工程菌的实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有 酶切位点的引物进行PCR扩增依次得到编码硝酸盐还原酶催化亚基及电子转移亚基的核 苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列依次连接到共表达载体pETDuet - 1，最终重组共表 达载体pETDuet - NB - NA ;之后将该硝酸盐还原酶表达载体转化到大肠杆菌表达菌株内，获 得硝酸盐还原酶过表达重组菌株。
[0013] 所述的含有酶切位点的引物包括：
[0014] NA - Nde I - F:CCATATGGTGGACAGCTCGCCGGACCGCATC
[0015] NA - EcoR V - R:CGATATCTCAATGATGATGATGATGATGTGCCGTGCTCCCCGTCG
[0016] NB - Nco I - F:ACCATGGTGACGTCCACGCACTGCCCCTACTGC
[0017] NB - Hind III - R:CCAAGCTTTCAATGATGATGATGATGATGCGGGCGTACCGCCTCC
[0018] 所述的PCR扩增的条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，55°C退火15s，68°C延 伸2min ;30个循环后68°C终延伸5min。
[0019] 所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。
[0020] 本发明涉及一种硝酸盐还原酶的工程菌的应用，将其用于硝酸盐还原酶的体外高 效表达，并最终实现硝酸盐还原酶的工业发酵生产。 技术效果
[0021] 现有硝酸盐还原酶在灰略红链霉菌内为胞内酶且表达量很低，因此严重限制了其 使用范围和效果；与现有技术相比，本发明提供了一种全新的硝酸盐还原酶基因序列；在 特殊条件下（如高温以及碱性）具有更稳定的生物学活性；本发明通过构建外源表达载体， 实现了硝酸盐还原酶的体外过表达，并通过在表达重组蛋白C端添加聚组氨酸标签的方 法，维持蛋白活性的同时也最大程度的保证了蛋白纯度。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为硝酸盐还原酶催化亚基（A)及电子转移亚基（B)信号肽预测图；
[0023] 图2为硝酸盐还原酶催化亚基（A)及电子转移亚基（B) 3D模型预测图。
【具体实施方式】
[0024] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 实施例1
[0025] 本实施例中灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)分离自上海市浦江镇收 集的腐烂秸杆，保藏编号为CGMCC No. 5706。将该菌种接种于LB液体培养基，32 °C培养48h。
[0026] 上述LB液体培养基组分为：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCllO. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液体培养基中加入15. 0 - 20. Og/L琼脂即得LB固体培养基。
[0027] 1)灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)基因组 DNA 提取：收集 2. OmL 菌 液，12000rpm离心2min。弃上清，收集菌体沉淀，加入180 μ L溶菌酶（20mg/mL)和20 μ L 已0丁八溶液（0.51邛!18.0)，371：处理4511^11，加入4以1^8似86六（10011^/11^)，震荡混匀158，室 温放置5min，随后按照细菌DNA提取试剂盒（TIANGEN)操作说明完成剩余操作，得到高纯度 基因组DNA。通过0. 8 %琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量，确保无明显RNA条带，基因 组条带清洗、完整、无降解、无污染。
[0028] 2)灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)基因组测序：确定全基因组 鸟枪法（WGS)策略，采用第二代测序技术，构建不同插入片段长度的文库，采用Illumina Mise q(2X250bp)平台进行测序。收集测序的原始数据，对带接头、低质量的数据进行过滤， 随后采用Newbler v2. 8对去除接头的测序数据进行从头拼接，构建contig及scaffold，最 后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。
[0029] 3)蛋白编码基因功能预测：采用Glimmerf. 0软件对全基因组序列进行基因预测。 基因预测模型选取自我训练基因预测模型，即提取拼装序列中最长的序列，以该序列作为 基因预测模型训练的序列。然后以该序列构建的基因预测模型，对所有序列进行基因预测， 设定开放阅读框的长度为ll〇bp，其余参数为Glimmerf. 0的默认设置。
[0030] 4)效果检测
[0031] 硝酸盐还原酶膜定位预测：采用SignalP4. 1分别对硝酸盐还原酶催化亚基及电 子转移亚基序列进行信号肽模拟预测，如图1所示。结果表明硝酸盐还原酶催化亚基及电 子转移亚基均不存在明显的信号肽序列，推测该酶为胞内酶。
[0032] 硝酸盐还原酶3D模型预测：运用PHYRE2在线程序对硝酸盐还原酶催化亚基及电 子转移亚基的3D空间模型进行预测，结果如图2所示。结果表明硝酸盐还原酶催化亚基及 电子转移亚基与PDB数据库中已有蛋白模型的最高相似度分别可达33%和34%，预测结果 具有100%可信度。
[0033] 硝酸盐还原酶催化亚基及电子转移亚基序列验证：根据全基因组测序结果，设计 PCR引物如下：
[0034] NA - F:GTGGACAGCTCGCCGGACCGCATC
[0035] ΝΑ - R:TCATGCCGTGCTCCCCGTCGTCGC
[0036] NB - F:GTGACGTCCACGCACTGCCCCTAC
[0037] NB - R:TCACGGGCGTACCGCCTCCAGGCG
[0038] 以灰略红链霉菌JSD - 1基因组DNA为模板，进行PCR扩增并通过琼脂糖凝胶电 泳检测，结果表明片段约为2. 4kb及2. lkb，将PCR产物切胶回收，使用DNA A - Tailing Kit (TaKaRa)加 A后连接到T - Vector PMD?19 - T (TaKaRa)，并将连接产物转入DH5 α大肠 杆菌，在氨苄（50 μ g/mL)抗性平板挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。测序结果证实插入 片段与基因组测序结果完全吻合，即为本发明序列表中的SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2。
[0039] 上述PCR扩增条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，55°C退火15s，68°C延伸 lmin ;30个循环后68°C终延伸5min。
[0040] 上述 PCR 反应使用的 DNA 聚合酶为 PrimeSTAR? GXL Polymerase (TaKaRa)。 实施例2
[0041] 硝酸盐还原酶表达载体构建
[0042] 1)根据硝酸盐还原酶序列，设计含有酶切位点的引物，序列如下：
[0043] NA - Nde I - F:CCATATGGTGGACAGCTCGCCGGACCGCATC
[0044] NA - EcoR V - R:CGATATCTCAATGATGATGATGATGATGTGCCGTGCTCCCCGTCG
[0045] NB - Nco I - F:ACCATGGTGACGTCCACGCACTGCCCCTACTGC
[0046] NB - Hind III - R:CCAAGCTTTCAATGATGATGATGATGATGCGGGCGTACCGCCTCC
[0047] 2)以灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)基因组DNA为模板，用含有 Nco I和Hind III酶切位点引物进行PCR扩增获得硝酸盐还原酶电子转移亚基基因序列， 使用DNA A - Tailing Kit加 A后连接到T - Vector PMD?19 - T(TaKaRa)，并将连接产物转 入DH5a大肠杆菌内。挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。若无误，Nco I和Hind III进行 双酶切（37°C )，回收硝酸盐还原酶电子转移亚基DNA片段NB。用相同内切酶酶切共表达载 体pETDuet - 1并回收载体DNA片段。将NB与载体片段混合，T4DNA Ligase (TaKaRa)过夜 连接（16°C)，将连接产物转入DH5a大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板及菌落PCR筛 选含有质粒pETDuet - NB的阳性克隆。挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素（50 μ g/mL) 的LB液体培养基中，180rpm、37°C培养16小时后提取质粒。
[0048] 以含有Nde I和EcoR V酶切位点引物进行PCR扩增获得硝酸盐还原酶电子转移 亚基基因序列，加 A后连接到T-Vector PMD?19-T，将连接产物转入DH5a大肠杆菌内。 挑选阳性克隆摇菌并回收质粒测序验证。若无误，用Nde I和EcoR V双酶切该质粒，回收 硝酸盐还原酶电子转移亚基DNA片段NA。相同内切酶处理重组表达载体pETDuet - NB并 回收载体DNA片段。将NA与pETDuet - NB载体片段混合，T4DNA Ligase过夜连接，将连接 产物转入DH5 α大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板和菌落PCR筛选含有重组共表达载 体pETDuet - NB - ΝΑ的阳性克隆。挑取阳性克隆，摇菌并提取其质粒即得硝酸盐还原酶表 达载体。
[0049] 上述PCR扩增条件为：98°C预变性3min ;98°C变性10s，68°C延伸lmin ;30个循环 后68°C终延伸5min。
[0050] 3)硝酸盐还原酶过表达转基因菌株的构建
[0051 ] 将上述硝酸盐还原酶表达载体pETDuet - NB - NA转入Transetta (DE3)大肠杆菌， 并在含有氨苄青霉素（50 μ g/mL)和氯霉素（34 μ g/mL)的LB固体培养基上筛选，获得硝酸 盐还原酶过表达菌株。
[0052] 上述的Transetta (DE3)具有以下特征：该菌株具有氯霉素（Canf)，且含有大肠杆 菌缺乏的6种稀有密码子（AGA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)对应的tRNA，可有效提高外源基因， 尤其是真核生物及链霉菌等高GC含量生物基因在原核系统中的表达水平。
【权利要求】
1. 一种硝酸盐还原酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为外源表达硝酸盐还原酶的大 肠杆菌； 所述的胞内硝酸盐还原酶具体为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD-l 硝酸盐还原酶编码基因，由硝酸盐还原酶催化亚基SG - ΝΑ和电子转移亚基SG - NB构成，其 核苷酸序列分别为2394bp和2127bp，分别编码797和708个氨基酸，其中：硝酸盐还原酶 {隹化亚基SG _ NA的核昔酸序列如SEQ ID No. 1所不，氣基酸序列如SEQ ID No. 3所不；硝 酸盐还原酶电子转移亚基SG -NB的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
2. 根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD - 1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，保藏编号为 CGMCC No. 5706,保藏日期为2012年1月9日。
3. -种根据权利要求1或2中所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红链霉 菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增依次得到编码硝酸盐还原酶催 化亚基及电子转移亚基的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列依次连接到共表达载体 pETDuet - 1，最终获得重组共表达载体pETDuet - NB - NA ;之后将该硝酸盐还原酶表达载体 转化到大肠杆菌表达菌株内，获得硝酸盐还原酶过表达重组菌株。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点的引物包括： NA - Nde I - F:CCATATGGTGGACAGCTCGCCGGACCGCATC NA - EcoR V - R:CGATATCTCAATGATGATGATGATGATGTGCCGTGCTCCCCGTCG NB - Nco I - F:ACCATGGTGACGTCCACGCACTGCCCCTACTGC NB - Hind III - R:CCAAGCTTTCAATGATGATGATGATGATGCGGGCGTACCGCCTCC。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为：98°C预变性 311^11;981：变性1〇8,681：延伸1111丨11 ;30个循环后681：终延伸511^11。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为 Transetta(DE3)大肠杆菌。
7. -种根据上述任一权利要求所述的硝酸盐还原酶的工程菌的应用，其特征在于，将 其用于硝酸盐还原酶的体外高效表达，并最终实现硝酸盐还原酶的工业发酵生产。
【文档编号】C12N9/06GK104140944SQ201410373906
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】周培, 冯海玮, 孙玉静, 支月娥, 唐冬, 卫星, 罗艳青, 毛亮 申请人:上海交通大学