一种基于pcr的简易快速提取植物叶片dna的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于PCR的简易快速提取植物叶片DNA的方法。该方法是将采集的新鲜的植物叶片剪碎，置于盛有A液的离心管中，浸泡提取至少1min后，加入等体积的B液，混匀；混匀后的提取液可作为DNA模板用于PCR。其中A液为：2g：NaOH，0.7448g：EDTANa2，2.42gTris，加水定容到1L，灭菌，备用；B液为：0.05M的HCl溶液。相比传统技术，本发明需要的叶片少；采用的试剂简单，成本低；同时操作简单，不需要大型仪器，不需要液氮或冰盒保存样品，不需要研磨、抽提、沉淀和溶解；同时提取时间短且不污染环境。
【专利说明】—种基于PCR的简易快速提取植物叶片DNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种基于PCR的简易快速提取植物叶片DNA的方法。
【背景技术】
[0002]随着基因工程和生物技术的飞速发展，PCR分子标记技术已经广泛应用于基因定位、基因克隆及分子标记辅助育种等方面，这些研究中，需要进行大量DNA提取工作。而常规DNA提取过程比较复杂，是分子标记分析效率提高及成本降低的关键限制因素。因此，建立适合PCR分析的简便、高效、低成本的DNA提取方法是非常必要的。
[0003]传统的DNA提取方法主要包括SDS法和CTAB法，基本原理是:用液氮研磨裂解细胞，经酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)或氯仿-异戊醇的抽提与蛋白质分离，然后采用异丙醇或无水乙醇沉淀DNA,最后洗漆干燥和溶解DNA。上述操作方法具有操作复杂,耗时长,污染环境等缺点，无法满足大量植物叶片基因组DNA提取的需要。
[0004]同时在一般情况下，试验基地与试验室距离较远，为防止植物叶片DNA的降解，传统方法采取的样品必须放于液氮或冰盒中保存，如果需要大规模的提取DNA，就会加大试验的难度。
【发明内容】
[0005]为克服传统方法存在的缺陷，实现高通量提取植物叶片的DNA，满足SSR分析需要，本发明提供了一种简易、快速的提取植物叶片DNA的方法。该方法不需要使用液氮或冰盒保存样品，不需要研磨、抽提、沉淀和溶解，不需要任何仪器，不使用任何有毒试剂；只需要几种最常见的分析纯试剂即可提取叶片DNA，试验过程简单、快速，且不污染环境。同时，相比传统的DNA提取方法，该方法提取的DNA的浓度虽然较低，但其将其作为模板进行PCR扩增，都能扩增出来目的条带，并且条带清晰，与传统方法没有明显差别。
[0006]本发明的技术方案是:一种基于PCR的简易快速提取植物叶片DNA的方法，其特征是，将采集的新鲜的植物叶片剪碎，直接置于盛有A液的离心管中，浸泡提取至少Imin后，加入等体积的B液，混匀；混匀后的提取液中含有样品DNA，该提取液可作为DNA模板用于PCR。
[0007]其中A 液为:2g NaOH, 0.7448g EDTANa2 (乙二胺四乙酸二钠)，2.42g Tris (三羟甲基氨基甲烷)，加水定容到1L，灭菌，备用。B液为:0.05M的HCl溶液。
[0008]优选地，上述浸泡提取时间优选为30min。
[0009]本发明提取方法的基本原理是:在碱性条件下，植物膜结构破裂，基因组DNA暴露在碱性的缓冲环境中，氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，当用等量盐酸将其PH调到中性时，基因组DNA又可复性，作为PCR扩增的模板使用，但碱提的DNA溶液由于没有经过抽提纯化等措施，含有较少蛋白，糖类等杂质，但并不影响其后的PCR扩增。
[0010]同时，在田间取样，一般把样品放入液氮或冰盒保存，以防止叶片DNA降解，然后带回实验室提取DNA，并且传统方法磨样必须用液氮，因此不可避免的使用液氮。而采用本方法在田间采集叶片后，将叶片放入溶液A浸泡的过程就是DNA提取的过程，不需要使用液氮。
[0011]本发明的有益效果是:相比传统技术，本发明需要的叶片少(只需要Icm2大小的叶片，就能达到实验要求)；采用的试剂简单，成本低；同时操作简单，不需要大型仪器，不需要液氮或冰盒保存样品，不需要研磨、抽提、沉淀和溶解；同时提取时间短且不污染环境。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为实施例1采用本发明方法不同提取时间及采用CTAB法提取的玉米郑单958的 DNA 琼脂糖电泳检测图；图中，1-2:1min, 3-4:1Omin, 5-6:30min, 7-8:60min, 9-10:12h,ll-12:24h, 13-14:36h，15-16:48h，17-18:CTAB 法提取 DNA，M:2000bp Marker ；
[0013]图2为实施例1采用本发明方法不同提取时间及采用CTAB法提取的DNA的PCR扩增玉米郑单958的产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图中，1-2:1min, 3-4:1Omin,5-6:30min，7-8:60min，9-10:12h，ll-12:24h，13-14:36h，15-16:48h，17-18:CTAB 法提取DNA, M:20bp Marker ；
[0014]图3为利用引物phi308707 PCR扩增玉米先玉335的扩增结果的非变性聚丙烯酰胺凝胶图;1-16:本方法提取的DNA，17-18:CTAB法提取DNA，M:20bp Marker.；
[0015]图4为利用引物umcl655PCR扩增玉米先玉335的扩增结果的非变性聚丙烯酰胺凝胶图；1-16:本方法提取的 DNA，17-18:CTAB 法提取 DNA，M:20bp Marker.。
【具体实施方式】
[0016]实施例1:提取时间对DNA浓度和PCR的影响
[0017]2014年6月15日在大田中种植玉米郑单958，等幼苗长至三叶期，剪取Icm2大小的叶片(两次重复，每次均取一片Icm2大小的叶片)放入盛有200mLA液的2mL离心管中，在室温下提取:lmin, 1min, 30min, lh，6h，12h，24h，36h，48h，到提取时间后加入B液，混匀，即为样品DNA。同时采用传统的CTAB法提取玉米郑单958的DNA进行对照。
[0018]本发明方法中A液为:2g NaOH, 0.7448g EDTANa2 (乙二胺四乙酸二钠)，2.42gTris (三羟甲基氨基甲烷)，加水定容到1L，灭菌，备用。B液为:0.05M的HCl溶液。
[0019]CTAB法所需试剂的配制和器材:
[0020](I)IM Tris-HCl (pH8.0):称取60.57g Tris溶于去离子水中，等完全溶解后定容到500ml，并调节pH到8.0 ；
[0021](2) CTAB 分离缓冲液:2gCTAB,8.18g NaCl，0.74g EDTA.Na2.2H20,加 Λ 1mLlmol/L 的 Tris-HCL(pH8.0),0.2mL 巯基乙醇，加水定容到 10mL ；
[0022](3)抽提液(24:1氯仿/异戊醇):96mL氯仿中加入4mL异戊醇；
[0023](4) TE 缓冲液:10mmol/L Tris-HCL (pH7.4)，lmmol/L EDTA ；
[0024](5)液氮。
[0025](6)研钵，恒温水浴锅(37_100°C )，离心机，离心管。
[0026]CTAB法操作方法:
[0027]1.取l_2g新鲜植物叶片，置于冷冻的研钵中，用液氮将其研成粉末，将细胞裂解，使核酸游离出来。
[0028]2.将冻粉转入预冷的离心管中，加入等体积的2 X CTAB缓冲液，65 °C保温30-60min，其间不时摇动，使提取液和核酸充分结合。
[0029]3.加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min离心10min。吸取上清转移到新离心管中，重复以上步骤。抽提可将蛋白质变性沉淀于有机相，核酸留在水相，从而达到分离核酸的目的。
[0030]4.沉淀DNA:吸取上清液至新的离心管中，加入0.6_1倍体积的异丙醇，混匀，冰箱中放置30min。12000r/min离心10分钟，得至Ij DNA沉淀。
[0031]5.洗涤:用70%乙醇清洗DNA沉淀，在室温条件下晾干。
[0032]6.溶解:风干后加入10ul的TE缓冲液溶解DNA，_20°C保存备用。
[0033]注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。
[0034]利用本方法提取玉米郑单958的基因组DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量(见图1)。结果发现，本方法所提的玉米基因组DNA浓度很低，电泳检测无条带(泳道1-16)，而利用传统CTAB法提的DNA有条带(泳道17-18)。但是通过蛋白质/核酸分析仪检测发现(表1)，随着提取时间的加长，浓度有所提高，但是提取时间到30min，浓度变化不大。
[0035]表1蛋白质/核酸分析仪检测结果
[0036]
【权利要求】
1.一种基于PCR的简易快速提取植物叶片DNA的方法，其特征是，将采集的新鲜的植物叶片剪碎，直接置于盛有A液的离心管中，浸泡提取至少Imin后，加入等体积的B液，混匀；混匀后的提取液作为DNA模板用于PCR;其中A液为:2g NaOH, 0.7448g乙二胺四乙酸二钠，2.42g三羟甲基氨基甲烷，加水定容到1L，灭菌，备用；B液为:0.05M的HCl溶液。
2.如权利要求1所述的基于PCR的简易快速提取植物叶片DNA的方法，其特征是，所述浸泡提取时间为30min。
【文档编号】C12N15/10GK104164420SQ201410374176
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】刘强, 汪黎明, 秦保平, 刘铁山, 董瑞, 刘春晓 申请人:山东省农业科学院玉米研究所