耐氧梭菌及其在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108，保藏号为CGMCCNo.9550及其在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用。属于微生物【技术领域】。应用包括以下步骤：（1）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的培养；（2）底物黄豆苷原与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108共培养：将耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108种子液转接到BHI液体培养基中，同时加入黄豆苷原进行共培养；（3）代谢产物的分离纯化。本发明耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108使黄豆苷原可在有空气氧条件下高效转化，转化性能稳定，且方法简单，解决了去氧甲基安哥拉紫檀素难于在有空气氧条件下规模化生产的难题。
CGMCC No9550
20140826
【专利说明】耐氧梭菌及其在去氧甲基安哥拉紫擅素有氧合成中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物【技术领域】，尤其是一种梭菌及其在去氧甲基安哥拉紫檀素生物 合成中的应用。
【背景技术】
[0002] 大豆异黄酮（soy isofIavones)是大豆等少数豆科植物在其生长过程中形成的一 类次生代谢产物，迄今已从大豆中分离了 12种异黄酮成分，包括游离型苷元（aglycone)和 结合型糖苷（glucosides)两大类，天然大豆中95%以上的异黄酮为结合型糖苷，共9种；另 外3种为大豆异黄酮苷元，包括黄豆苷原（daidzein)、染料木素（genistein)和黄豆黄素 (glycitein)，其中黄豆苷原和染料木素占大豆异黄酮总苷元的95%以上，为大豆异黄酮苷 元的主要成分。大量流行病学研究证实，大豆异黄酮具有抗氧化、抗癌、降低心脑血管发病 率、减少骨质流失以及缓解妇女更年期综合症等多种生理功能。
[0003] 动物实验结果表明，大部分以结合型糖苷存在的异黄酮在胃肠道微生物菌群作用 下被水解，脱去糖基转变为游离型苷元才被胃肠粘膜直接吸收，被吸收的染料木素和黄豆 苷原再进一步被细菌代谢为各种不同产物。与染料木素相比，黄豆苷原在人体内的代谢研 究更为详尽，迄今从人体尿液和血液中已检测到的黄豆苷原的代谢产物包括：二氢黄豆苷 原（dihydrodaidzein，简称 DHD)、四氢黄豆苷原（tetrahydrodaidzein，简称 THD)、去氧甲 基安哥拉紫檀素（〇_desmethylangolensin简称6H)ma)和雌马酌'(equol)等，其中6H)ma 和雌马酚是黄豆苷原体内代谢的两个终产物。由于雌马酚的强抗氧化和抗癌活性，以往对 雌马酚研究报道最多。大量流行病学研究表明，人群中只有大约30?50%的个体，其肠道 微生物菌群能将摄入体内的黄豆苷原转化为雌马酚，而80?90%的个体则是将摄入体内的 黄豆苷原转化为〇-Dma。因而，最近几年研究人员开始关注0-Dma这一开环产物。
[0004] Axelson等最早于1982年在人体尿液中检测到黄豆苷原代谢产物0-Dma(Biochem J 1982)其后又在血清和血楽（Setchell et al, Am J Clin Nutr 1998)、乳汁（Franke & Custer, Clin Chem 1996)、羊水和胳带血（Adlercreutz et al, Am J Obstet Gynecol 1999)以及前列腺液（Hedlund et al，J Nutr 2005)等中检测到0-Dma。不同人群或不同个 体体内0-Dma含量差异较大。根据Valentin等报道，受试的美国人尿液和血液组织中0-Dma 含量分别为 4.34 mg/L 和 1.0 mg/L( J Expo Anal Environ Epidemiol 2003)，而 Kunisue 等发现受试的日本人尿液中的O-Dma含量则高达110 mg/L (J Agri Food Chem 2010)。
[0005] 体外研究结果表明，0-Dma不仅与人体雌激素受体ERa和ERb的亲和力明显高于其 前体黄豆苷原，而且与ER a结合后在诱导基因转录上0-Dma也强于黄豆苷原。此外，当浓度 高于10微摩尔/升时，O-Dma能明显抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长（Kinjo et al，Biol Pharm Bull 2004) ;Hedlund等研究结果证实，0-Dma可明显抑制前列腺癌细胞的增长 (Prostate 2006)。2008年日本学者比较了 0-Dma与雌马酚在体内外对切除子宫小鼠的骨 密度及脂类代谢的影响，发现O-Dma与雌马酚一样，均能促进脂类物质的正常代谢，但在体 外破骨细胞生长方面，O-Dma则只表现轻微抑制作用（Ohtomo et al，Eur J Nutr 2008)。 此外，0-Dma还被报道有免疫调节作用（Gredel et al, Food Chem Toxicol 2008)以及抑 制瘦素分泌的功能（Niwa et al, phytochem Lett 2010)。我们通过对比黄豆苷原和0-Dma 对二苯代苦味酰基自由基（DPPH)的体外清除作用时发现，较低浓度（0. 33-1. 33毫摩尔/ 升）下，0-Dma和黄豆苷原对DPPH自由基的清除作用无显著差异；但当浓度升高到3. 33毫 摩尔/升时，O-Dma对DPPH自由基的体外清除作用极显著高于其亲本化合物黄豆苷原（XL Lianget al, J Agric Food Chem 2010)。
[0006] 专利文献CN102391969A公开了一种梭菌AUH-JLC140及其在去氧甲基安哥拉紫檀 素生物合成中的应用，其利用肠道梭菌菌株AUH-JLC140转化底物黄豆苷原合成0-Dma，由 于细菌菌株AUH-JLC140为严格厌氧细菌菌株，该菌株只能在严格厌氧条件下完成转化过 程。而长期维持厌氧环境需要大量的经济投入。文献"大豆异黄酮转化菌株的分离、耐氧驯 化及耐氧机制研究"（李慧2013硕士论文，河北农业大学)对菌株AUH-JLC140进行了长期 耐氧驯化，得到AUH-JLC140耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140,其能在有空气氧条件下生长 和转化底物黄豆苷原为〇-Dma，但由于菌株AUH-JLC140耐氧突变株Aeroto-AUH-JLCHO在 菌体外壁存在较厚的以多糖为主要成分的抗氧化"保护膜"结构(李慧2013硕士论文，河北 农业大学)，导致耐氧菌株Aeroto-AUH-JLCHO在有空气氧条件下的转化效率较低，不具有 可应用性。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108及其在去氧 甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用，上述菌株能将底物黄豆苷原（daidzein)在自然条 件（即有空气氧条件下）下高效转化为去氧甲基安哥拉紫檀素（0-desmethylangolensin，简 称0-Dma)，且转化性能稳定，解决了 0-Dma在有空气氧条件下的规模化生物合成的问题，对 0-Dma新药理活性及新药研发具有极大的推动作用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是： 一种耐氧梭菌sp. ) Aeroto-AUH-JLC108,保藏号为 CGMCC No. 9550。
[0009] 耐氧梭菌 sp. Aeroto-AUH-JLC108 是严格厌氧梭菌 sp. AUH-JLC108 (KM277367)经过耐氧驯化后得到的、既能在有空气氧条件下生长又能高效 转化黄豆苷原为O-Dma的耐氧突变株。梭菌菌株sp. AUH-JLC108是从鸡粪 样中分离得到的一株革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株，该菌株在厌氧工作站内能将底物黄豆 苷原开环转化为〇-Dma。有关0-Dma微生物生物合成途径如下所示：
【权利要求】
1. 一种耐氧梭菌（C/iostrit/itt? sp. ) Aerot〇-AUH_JLC108,保藏号为 CGMCC No. 9550。
2. 权利要求1所述的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLCIOS在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合 成中的应用。
3. 根据权利要求2所述的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLCIOS在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧 合成中的应用，其特征在于包括以下步骤： (1)耐氧菌株Aerot〇-AUH-JLC108的培养 将低温冷冻保存的耐氧梭菌Aer〇t〇-AUH-JLC108融化并按10?15%接种量接种到盛 有新鲜BHI液体培养基的试管中，37°C下培养24小时；再以10%接种量将试管中的耐氧菌 株Aer〇t〇-AUH-JLC108重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，培养12?18小时作为种 子液； 底物黄豆苷原与耐氧菌株Aer〇t〇-AUH-JLC108共培养 将耐氧菌株Aer〇t〇-AUH-JLC108的种子液转接到BHI液体培养基中，同时加入黄豆苷 原进行共培养； (3)代谢产物的分离纯化。
4. 根据权利要求3所述的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLCIOS在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧 合成中的应用，其特征在于所述步骤（2)中种子液按10?15%的量接种，加入黄豆苷原母 液使黄豆苷原的终浓度为1. 6?2. 0毫摩尔/升，37°C恒温培养箱内培养2?3天。
5. 根据权利要求4所述的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLCIOS在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧 合成中的应用，其特征在于黄豆苷原母液浓度为40?60毫摩尔/升。
6. 根据权利要求3所述的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLCIOS在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧 合成中的应用，其特征在于所述步骤（3)中分离纯化方法为：用等体积的乙酸乙酯将培养 物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代 谢产物去氧甲基安哥拉紫檀素。
【文档编号】C12N1/20GK104371950SQ201410426881
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】王秀伶, 李梦, 彭文涛, 李慧 申请人:河北农业大学