特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置的构建方法，包括：构建质粒hUPII-pSpCas9、构建质粒hTERT-gRNA-BAM、构建质粒pRL-SV40-LacI、构建质粒pcDNA3-LacO-hRluc和构建质粒pcDNA3-LacO-E-cadherin。构建的分子遗传装置能够有效特异控制膀胱癌细胞并显著影响其恶性生物学行为，并能够有效检测膀胱癌细胞并增强荧光素酶基因的表达，便于科学研究。
【专利说明】特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置的构建方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及一种特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置。
【背景技术】
[0002] 在我国，膀胱癌发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤首位。美国肿瘤协会2011年的 统计资料显示，全世界每年新增膀胱癌患者38万，死亡人数15万。近十多年来，膀胱癌发 病有逐年上升和年轻化等趋势。许多患者就诊时已属中晚期，缺乏有效治疗手段，预后差， 死亡率高。膀胱移行上皮细胞癌占膀胱癌的90%以上，其分为非肌层浸润性和肌层浸润性， 前者易发生复发，主要采用经尿道膀胱肿瘤切除术进行治疗，术后辅以膀胱灌注治疗，减少 复发；后者易发生转移，主要采用根治性膀胱切除术进行治疗，术后辅以化疗或放疗。膀胱 癌转移是患者的主要死因。骨盆淋巴结是膀胱癌转移的首选部位，其次为肺、骨、肝脏和脑 组织。膀胱癌发生转移患者的中位生存时间为12-15个月。化疗是晚期膀胱癌治疗的主要 手段，但疗效不佳，不能显著延长患者的生存时间。
[0003] 基因治疗，尤其近年来发展起来的分子靶向治疗，曾是晚期膀胱癌治疗的希望，但 是存在诸多难以突破的技术瓶颈，如靶向性差、杀伤效果不稳定、安全性隐患等，严重限制 了该技术在肿瘤治疗中的应用。因此，探索特异、高效和副作用小的新型生物靶向治疗方 法，对于膀胱癌的治疗具有非常重要的意义。
[0004] CRISPR Cas9系统是细菌利用来保护自身免受外来病毒和核酸侵袭的细胞机器。 当细菌受到噬菌体感染后，CRISPR RNA就能通过互补序列结合噬菌体DNA序列，并表达 Cas9--一种核酸切割酶，能切割噬菌体DNA，沉默其基因表达。CRISPR Cas9系统目前已 被开发成为新一代基因组编辑技术，为修复突变DNA提供了一条简单的途经，有潜力用于 治疗许多的遗传基因疾病。将CRISPR/Cas系统用于真核细胞需要满足两个条件：一个是表 达Cas9酶，用于切断靶标DNA ;另外一个就是称为引导RNA的RNA分子，这种分子能通过碱 基配对与靶标互补结合。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种新的特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置的构建方法。
[0006] 本发明提供一种特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置的构建方法，其特征在于， 包括：
[0007] 构建质粒 hUPII_pSpCas9 ;
[0008] 构建质粒 hTERT-gRNA-BAM ;
[0009] 构建质粒 pRL-SV40_LacI ;
[0010] 构建质粒 pcDNA3_Lac〇-hRluc ;
[0011] 构建质粒 pcDNA3-Lac〇-E-cadherin。
[0012] 将 hUPII 启动子片段插入质粒 Cbh-3X-FLAG-NLS-SpCas9-NLS 的 Xbal/Agel 位点， 而构建所述质粒hUPII_pSpCas9。
[0013] 将hTERT启动子和核酸酶序列围绕的引导RNA分子分别插入质粒pCMVp-NEO-BAM 的 Xbal/Sal I 和 Sal I/BamH I 位点，而构建所述质粒 hTERT-gRNA-BAM。
[0014] 将IacI基因序列插入质粒pRL-SV40的Nhel/Xbal位点，而构建所述质粒 pRL-SV40-LacI。
[0015] 将Iac操纵子序列和hRluc基因分别插入质粒pcDNA3的HindIII/Kpn I和BamH I/EcoR I位点，而构建所述质粒pcDNA3-Lac〇-hRluc。
[0016] 将人 E-cadherin cDNA 序列插入 pcDNA3_Lac〇-hRluc 的 BamH I/EcoR I 位点，而 构建所述质粒 pcDNA3-Lac〇-E_cadherin。
[0017] 分子遗传装置的构建基于CRISPR_Cas9技术，该装置可以包含逻辑"与"门遗传线 路。分子遗传装置整合了人端粒酶逆转录酶基因的肿瘤特异性启动子和人uroplakin基因 的膀胱特异性启动子。该装置基于来自这两个启动子的输入信息，并只在它们均有高转录 活性的细胞中激活输出端基因的CMV启动子（该启动子在一般情况下被IacI抑制）。
[0018] 当且仅在膀胱癌细胞（同时具有高转录活性的hTERT和hUPII启动子）中，Cas9 系统能有效工作并沉默阻遏蛋白lac I的表达，从而激活效应基因的表达。
[0019] 上述质粒的混合物与转染试剂形成质粒/转染试剂混合物。转染试剂如 Lip〇feCtamin2000。质粒/转染试剂混合物进行荧光酶素活性检测和细胞迁移运动能力检 测。
[0020] 所述IacI基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0021] 所述膀胱癌细胞如T24、5637、J82或SW-780。
[0022] -种所述构建方法构建的分子遗传装置在特异探测膀胱癌细胞试剂盒中的应 用。
[0023] -种所述构建方法构建的分子遗传装置在抑制膀胱癌细胞药物中的应用。
[0024] -种所述构建方法构建的分子遗传装置在膀胱癌细胞中特异表达效应基因上的 应用。
[0025] 所述效应基因是Iuciferase基因或E-cadherin基因。
[0026] 本发明的有益效果是：构建的分子遗传装置能够有效特异控制膀胱癌细胞并显著 影响其恶性生物学行为，并能够有效检测膀胱癌细胞并增强荧光素酶基因的表达，便于科 学研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1是分子遗传装置的工作原理示意图；
[0028] 图2是IacI靶序列和所设计的引导RNA序列示意图；
[0029] 图3是荧光素酶检测结果图，其中，横坐标依次表示膀胱癌细胞系T24、膀胱癌细 胞系5637、膀胱癌细胞系SW-780、膀胱癌细胞系J82、HEK-293T (人胚肾脏细胞）、HeLa (宫 颈癌细胞）、A549 (肺癌细胞）、PC-3 (前列腺癌细胞）、GC-1 (精母细胞）、GC-2 (精母细胞） 和Fibroblast (人成纤维上皮细胞），对于每个细胞，左边方柱指本发明分子遗传装置，右 侧方柱指hTERT-Rluc载体；SC-I指仅在膀胱癌细胞中高表达荧光素酶的分子遗传装置；
[0030] 图4是细胞划痕检测结果图，其中，A?K依次表示膀胱癌细胞系T24、膀胱癌细胞 系5637、膀胱癌细胞系SW-780、膀胱癌细胞系J82、HEK-293T (人胚肾脏细胞）、HeLa (宫颈 癌细胞）、A549 (肺癌细胞）、PC-3 (前列腺癌细胞）、GC-1 (精母细胞）、GC-2 (精母细胞）和 人成纤维上皮细胞，对于每个细胞，上面表示O小时取样结果，下面表示24小时取样结果， 从左至右依次表示 SC-1、SC-4 及 pcDNA3-hTERT-E-cadherin。
【具体实施方式】
[0031] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0032] 技术与方法
[0033] 1.细胞培养
[0034] 膀胱癌细胞系T24、J82、5637、SW-780和HEK-293T(人胚肾脏细胞）、HeLa(宫颈癌 细胞）、A549 (肺癌细胞）、PC-3 (前列腺癌细胞）、GC-1 (精母细胞）和GC-2 (精母细胞）购 自 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, USA)，人成纤维上皮细胞由发明 人分离培养。细胞培养液由90%的DMEM(Invitrogen, CA)，10%的胎牛血清（Invitrogen), 1% -2 %的谷氨酰胺和0. 5 % -1 %的双抗配成。
[0035] 2.分子遗传装置的构建
[0036] 质粒hUPII-pSpCas9(PX165)的构建过程如下：将hUPII启动子片段插入质粒 Cbh-3X-FLAG-NLS-SpCas9-NLS (从Addgene获得，Addgene是全球科学家质粒共享非盈利组 织）的Xbal/Agel位点。
[0037] 质粒hTERT-gRNA-BAM的构建过程如下：将hTERT启动子和核酸酶序列围绕的引导 RNA 分子分别插入质粒 pCMVp-NEO-BAM (从 Addgene 获得）的 Xbal/Sal I 和 Sal I/BamH I 位点。
[0038] 质粒pRL-SV40_LacI的构建过程如下：将IacI基因序列插入质粒pRL-SV40 (从 Promega公司获得）的Nhel/Xbal位点。
[0039] 质粒pcDNA3_Lac〇-hRluc的构建过程如下：将Iac操纵子序列和hRluc基因分别 插入质粒 pcDNA3 (从 Addgene 获得）的 Hind III/Kpn I 和 BamH I/EcoRI 位点。
[0040] 质粒pcDNA3-Lac〇-E_cadherin的构建过程如下：将人E-cadherin cDNA序列插入 pcDNA3_Lac〇-hRluc 的 BamH I/EcoR I 位点。
[0041] 3.细胞转染
[0042] 转染前一天，4-5X104个细胞接种在24孔板上，加入0. 5ml培养基，放在 37 °C、5 % CO2培养箱内。生长24小时后，细胞汇合度达到70%，在50ul的无血清 培养基内加入Iug重组质粒的混合物，柔和混匀。在50ul无血清培养基内加入Iul Lipofectamin2000(Invitrogen, CA)试剂，轻轻混勻，室温放置5min。将稀释好的质粒和 Lipo2000轻柔混勻，室温放置20分钟，以便形成质粒/Iipofectamin混合物。将质粒/ Iipofectamin混合物加入24孔板内，轻柔摇晃24孔板。放入培养箱内，4-6小时后更换培 养基。
[0043] 4.荧光素酶活性检测
[0044] 用 Promega 公司的 Dual-Luciferase Reporter Assay System 检测样品 Luciferase活性。按上述转染方法转染细胞。转染48h后，吸去旧培养基，用PBS清洗 洗两次，每孔细胞加入ΙΟΟμΙ的Passive Lysis Buffer(PLB),室温轻微振摇15min。收 集细胞裂解液于I. 5ml Eppendorf管中；向Eppendorf管中加入100 μ 1的Luciferase Assay Reagent II (LAR II);将细胞裂解液 12, OOOg 离心 lmin，取上清 50 μ 1 加入 1.5ml Eppendorf管中并吹打均匀：用阅读仪测量可见光强度10s(此时所读光为psiCHECK2载 体上转录翻译产生的萤火虫Luciferase所发出的）；取出Eppendorf管，加入100μ 1 Stop&Glo Reagent，吹打均匀；用阅读仪测量可见光强度IOs (此时所读光为psiCHECK2载 体上转录翻译出的海肾Luciferase所发出的）将所得到的数据，标准化后进行分析。荧光 素酶活性检测结果如图3所示。
[0045] 5.细胞迁移运动能力检测
[0046] 细胞迁移运动能力由细胞划痕实验检测。先用marker笔在24孔板背后，用直尺 比着，均匀得划横线，大约每隔0.5?Icm-道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。用PBS 洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。放入37度5% C02培养箱，培养。按0， 24小时取样，拍照。细胞迁移运动能力检测结果如图4所示。
[0047] 6.统计学分析
[0048] 数据分析使用SPSS17. 0统计软件，正态分布的数据采用x±s表示。两组间比较， 采用独立样本t检验。检验水准以P〈0. 05表示差别具有统计学意义。
[0049] 实验结果
[0050] 1.分子遗传装置的构建
[0051] 基于CRISPR-Cas9技术构建了一个包含逻辑"与"门遗传线路的分子装置（如图1 所示），该装置整合了人端粒酶逆转录酶基因（hTERT)的肿瘤特异性启动子和人uroplakin 基因的膀胱特异性启动子。该装置基于来自这两个启动子的输入信息，并只在它们均有高 转录活性的细胞中激活输出端基因的CMV启动子（该启动子在一般情况下被IacI抑制）。 启动子的信息整合是通过Cas9蛋白和靶向IacI基因的引导RNA的结合来实现的。该引导 RNA和其IacI靶序列的分子序列如图2所示。IacI的序列是GAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGC GAAAACGCGGGAAAAAGTGGA(SEQ ID NO: 1)。引导 RNA(SgRNA)的序列如图 2 所示。
[0052] 2.该装置特异性识别膀胱癌细胞的实验验证
[0053] 当效应基因被选取为Iuciferase基因时，突光素酶检测实验结果显示，该装置仅 在膀胱癌细胞T24、5637、J82和SW-780中激活荧光素酶报告基因的表达（如图3所示）。 这些结果提示该分子遗传装置能有效检测膀胱癌细胞并增强荧光素酶基因的表达（与 hTERT-Rluc载体相比）。
[0054] 3.该装置特异性控制膀胱癌细胞恶性生物学行为的实验验证
[0055] 当效应基因被选取为E-cadherin时，实验结果显示，该装置仅在膀胱癌细胞T24、 5637、J82和SW-780中抑制细胞的迁移（如图4所示）。这些结果提示该分子遗传装置能 有效特异控制膀胱癌细胞并显著影响其恶性生物学行为（与hTERT-Rluc载体相比）。
[0056] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
【权利要求】
1. 一种特异探测膀胱癌细胞的分子遗传装置的构建方法，所述其特征在于，包括： 构建质粒 hUPII_pSpCas9 ; 构建质粒 hTERT-gRNA-BAM ; 构建质粒 pRL-SV40-LacI ; 构建质粒 pcDNA3_Lac〇-hRluc ; 构建质粒 pcDNA3-Lac〇-E-cadherin。
2. 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于， 将hUPII启动子片段插入质粒Cbh-3X-FLAG-NLS-SpCas9-NLS的Xbal/Agel位点，而构 建所述质粒hUPII_pSpCas9 ; 将hTERT启动子和核酸酶序列围绕的引导RNA分子分别插入质粒pCMVp-NEO-BAM的 Xbal/Sal I 和 Sal I/BamH I 位点，而构建所述质粒 hTERT-gRNA-BAM ; 将lacl基因序列插入质粒pRL-SV40的Nhel/Xbal位点，而构建所述质粒 pRL-SV40-LacI ； 将lac操纵子序列和hRluc基因分别插入质粒pcDNA3的HindIII/Kpn I和BamH 1/ EcoR I位点，而构建所述质粒pcDNA3-Lac〇-hRluc ; 将人 E-cadherin cDNA 序列插入 pcDNA3_Lac〇-hRluc 的 BamH I/EcoR I 位点，而构建 所述质粒 pcDNA3-Lac〇-E-cadherin。
3. 如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述lacl基因序列如SEQ ID NO: 1所 /_J、1 ο
4. 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述膀胱癌细胞如T24、5637、J82或 SW-780。
5. -种权利要求1所述构建方法构建的分子遗传装置在特异探测膀胱癌细胞试剂盒 中的应用。
6. -种权利要求1所述构建方法构建的分子遗传装置在抑制膀胱癌细胞药物中的应 用。
7. -种权利要求1所述构建方法构建的分子遗传装置在膀胱癌细胞中特异表达效应 基因上的应用。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述效应基因是luciferase基因或 E-cadherin 基因。
【文档编号】C12N15/66GK104293819SQ201410441470
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】黄卫人, 刘宇辰, 蔡志明 申请人:深圳市第二人民医院