同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的荧光探针pcr方法
【专利摘要】本发明涉及微生物的检测方法和检测试剂盒，具体涉及一种同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的荧光探针PCR检测方法，所述的方法包括：利用特异性探针和引物对，以细菌DNA为模板进行实时荧光PCR反应，其特征在于:所述引物对分别为SeqIDNo.1、SeqIDNo.2、SeqIDNo.3和SeqIDNo.4所示的序列；SeqIDNo.1:5’-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’SeqIDNo.2:5’-CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’SeqIDNo.3:5’-TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’SeqIDNo.4:5’-AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’所述探针为能与迟缓爱德华氏菌或鮰爱德华氏菌的基因组DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补的核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；所述探针为SeqIDNo.5和SeqIDNo.6所示的序列,SeqIDNo.5：5’-ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’SeqIDNo.6：5’-CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’。
【专利说明】同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的荧光探针PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物的检测方法和检测试剂盒，具体涉及用于同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针序列，以及试剂盒。
【背景技术】
[0002]迟钝爱德华氏菌(Mdwardsiella sp.)广泛分布于海水和淡水中，感染各种养殖水生动物,对水产养殖危害极大。对鳗鱼、鲶鱼、鳝鱼和其他多种动物致病，可造成严重经济损失，引起鱼类发病的病原菌主要为迟缓爱德华氏菌(疋和鮰爱德华氏菌{E.1ctaluri^0现已知迟缓爱德华氏菌是多种淡、海水养殖鱼类的重要病原菌，引起鱼类肾脏、肝脏脓疡病灶的疾病，损失严重，是目前水产养殖中危害较大的病原菌。
[0003]目前国内外建立的爱德华氏菌基因检测技术有检测迟缓爱德华氏菌的普通PCR检测技术，以及检测鮰爱德华氏菌的普通PCR检测技术，这些方法需要多次才能把这两种菌检测出来，而且需要通过凝胶电泳才能观察检测结果，检测方法较荧光PCR方法为繁琐而费时。
[0004]目前国内外尚未开发建立同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的荧光探针PCR检测方法。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明为了快速检测水生动物中的迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌，开发建立了检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的实时荧光PCR方法。
[0006]本发明一方面开发了一种同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的荧光探针PCR检测方法。
[0007]本发明另一方面提供一种用于同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的试剂盒。
[0008]一种同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的荧光探针PCR检测方法，所述的方法包括:利用特异性探针和引物对，以细菌DNA为模板进行实时荧光PCR反应，其特征在于:所述引物对分别为Seq ID N0.1、Seq IDN0.2、Seq IDN0.3和Seq IDN0.4所示的序列；
Seq ID N0.1: 5，-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’
Seq ID N0.2: 5’ -CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’
Seq ID N0.3: 5’ -TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’
Seq ID N0.4: 5’ -AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’
其中:Seq ID N0.1为迟缓爱德华氏菌的上游引物，Seq ID N0.2为迟缓爱德华氏菌的下游引物，Seq ID N0.3为鮰爱德华氏菌的上游引物，Seq ID N0.3为鮰爱德华氏菌的下游引物；所述探针为能与迟缓爱德华氏菌或鮰爱德华氏菌的基因组DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补的寡核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；
优选的，所述探针为Seq ID N0.5和Seq ID N0.6所示的序列，
Seq ID N0.5:5’ -ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’ ；
Seq ID N0.6:5’ -CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’，
其中，Seq ID N0.5为能与迟缓爱德华氏菌的基因组DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补的寡核苷酸序列；Seq ID N0.6为能与鮰爱德华氏菌的基因组DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补的寡核苷酸序列。
[0009]所述Seq ID N0.5探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，Seq ID N0.6探针5’端标记的荧光报告基团为VIC，所述探针3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。
[0010]所述实时荧光PCR反应的引物终浓度为0.25μπιΟ1/ dm3，探针终浓度为
0.5 μ mol/ dm3。
[0011]所述实时荧光PCR的反应条件包括:先95 °C变性I min，然后95 V 10 S、550C 10 s、68 V 30 s循环40次，在68°C进行FAM和VIC双通道荧光采集。
[0012]本发明另一方面提供一种用于同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含有能扩增出迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的基因片段的引物对，所述引物对分别为Seq ID N0.1、Seq IDN0.2、Seq IDN0.3和Seq IDN0.4所示的序列；
Seq ID N0.1: 5，-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’
Seq ID N0.2: 5’ -CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’
Seq ID N0.3: 5’ -TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’
Seq ID N0.4: 5’ -AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’
所述探针为能与迟缓爱德华氏菌或鮰爱德华氏菌的基因组DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补的核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；
所述探针为Seq ID N0.5和Seq ID N0.6所示的序列，
5， -ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’
5’ -CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’。
[0013]所述Seq ID N0.5探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，Seq ID N0.6探针5’端标记的荧光报告基团为VIC，所述探针3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。
[0014]本发明的有益效果:
本发明开发建立同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的荧光探针PCR检测方法，弥补了目前国内外无同时检测上述两种爱德华氏菌的实时荧光PCR方法的空白。利用荧光探针与目的片段杂交，释放检测信号的荧光探针PCR检测技术具有比普通PCR更高的检测灵敏度和特异性，且操作步骤简单，反应结束后直接读取检测结果，无需打开反应管进行电泳检测，减少了交叉污染，可以更有效的保证结果的准确性，亦有效提高检测效率，缩短检测时间。
[0015]【专利附图】
【附图说明】图1示本发明实施例所述实时荧光PCR检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌阴性结果图:其中，曲线I为迟缓爱德华氏菌阳性对照；曲线2为鮰爱得华氏菌阳性对照；曲线3为阴性对照；曲线4为受检样品。
[0016]图2示本发明实施例所述实时荧光PCR检测迟缓爱德华氏菌阳性结果图:其中1.迟缓爱德华氏菌阳性对照；2.鮰爱得华氏菌阳性对照；3.受检样品；4.阴性对照。
[0017]图3示本发明实施例所述实时荧光PCR检测鮰爱德华氏菌阳性结果图:其中，曲线I为迟缓爱德华氏菌阳性对照；曲线2为鮰爱得华氏菌阳性对照；曲线3和4为受检样品；曲线5为阴性对照。
[0018]
【具体实施方式】
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0019]本发明所使用的物料和试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
[0020]实施例1
1、主要仪器和试剂
荧光定量PCR仪:美国ABI公司7300型。核酸纯化系统:美国Thermo公司KingFisherml型。核酸磁珠法提取试剂盒:美国Omega生物技术公司Mag-Si Tissue DNA kit。实时荧光PCR反应液:北京天根生物工程有限公司的RealMasterMix (Probe)试剂盒。
[0021]2引物和探针
选择GenBank所收录的爱德华氏菌gyrb基因序列，在该基因序列保守区域用Primerexpress 3.0软件设计引物,并在爱德华氏菌种特异区域设计TaqMan探针,经NCBI Blast检验其特异性。设计并筛选出2套特异性引物和TaqMan-MGB探针。迟缓爱德华氏菌检测探针5’端标记FAM荧光报告基团，鮰爱德华氏菌检测探针5’端标记VIC荧光报告基团。引物和探针由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列见表1。
[0022]表1迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌检测引物和探针序列
【权利要求】
1.一种同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的荧光探针PCR检测方法，所述的方法包括:利用特异性探针和引物对，以细菌DNA为模板进行实时荧光PCR反应，其特征在于:所述引物对分别为Seq ID N0.1、Seq IDN0.2、Seq IDN0.3和Seq IDN0.4所示的序列；
Seq ID N0.1: 5，-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’
Seq ID N0.2: 5’-CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’
Seq ID N0.3: 5’-TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’
Seq ID N0.4: 5’-AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’ 所述探针为能与迟缓爱德华氏菌或鮰爱德华氏菌的基因组DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补的核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团； 所述探针为Seq ID N0.5和Seq ID N0.6所示的序列，
Seq ID N0.5:5’ -ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’
Seq ID N0.6:5’ -CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述SeqID N0.5探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，Se q ID N0.6探针5’端标记的荧光报告基团为VIC，所述探针3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于:所述实时荧光PCR反应的引物终浓度为0.25 μ mol/ dm3,探针终浓度为0.5 μ mol/ dm3。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于:所述实时荧光PCR的反应条件包括:先 95 °C变性 I min，然后 95 V 10 s、55°C 10 s、68 V 30 s 循环 40 次，在 68°C进行 FAM和VIC双通道荧光采集。
5.一种用于同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含有能扩增出迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的基因片段的引物对，所述引物对分别为 Seq ID N0.1、Seq IDN0.2、Seq IDN0.3 和 Seq IDN0.4 所示的序列；
Seq ID N0.1: 5，-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’
Seq ID N0.2: 5’-CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’
Seq ID N0.3: 5’-TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’
Seq ID N0.4: 5’-AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’ 所述探针为能与迟缓爱德华氏菌或鮰爱德华氏菌的基因组DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补的核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团； 所述探针为Seq ID N0.5和Seq ID N0.6所示的序列，
5， -ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’
5’ -CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于:所述SeqID N0.5探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，Seq ID N0.6探针5’端标记的荧光报告基团为VIC，所述探针3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。
【文档编号】C12Q1/04GK104164514SQ201410441438
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】郭书林, 陈信忠, 贾鹏, 龚艳清, 杨俊萍, 陈炳颖, 孔繁德 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心