Il-10多肽抑制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种多肽及其制备方法，可采用固相合成法和生物合成法，本发明的生物合成法还涉及编码所述多肽的核苷酸序列，包含编码所述多肽的核苷酸序列在内的表达载体，包含所述表达载体在内的宿主细胞，本发明还涉及含有所说的多肽的药物组合物，本发明还涉及这种多肽或其组合物在制药领域的应用，尤其是这种多肽或含该多肽的组合物在制备预防或治疗疾病时阻断白介素10药物中的应用。
【专利说明】丨L-10多肽抑制剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多肽及其制备方法，本发明还涉及这种多肽在制药领域的应用， 尤其是利用这种多肽具有抑制白细胞介素一 10的功能，在制备预防或治疗疾病时，阻断白 介素10药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 白细胞介素一 10 (IL-10)是一个在免疫调节和炎症反应中具有多向性作用的细 胞因子，其功能包括了截然相反的两个方面，免疫抑制和免疫促进。IL-10蛋白是二聚体， 每个亚单位的长度为178个氨基酸。由很多免疫细胞分泌，包括TH1，TH2和TH17亚类，调 节性T细胞（TReg)，CD8+T和B细胞。也在启动免疫反应的细胞中表达，包括树突状细胞 (DCs)、巨噬细胞、浆细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等，IL-10通过抑制病原体 的免疫反应来防止对宿主的损害。
[0003] 当IL-10在免疫反应启动阶段出现时可中止T细胞的反应，能抑制现有T细胞抗 病毒感染的能力。而且IL-10可直接作用于T细胞，限制其复制、功能分化和效能。在慢性 病毒感染和癌症患者血清中常发现IL-10非常过量的表达，使针对慢性病毒感染，肿瘤免 疫反应消失而引起严重后果而在丙型肝炎病毒（HCV)、乙型肝炎病毒（HBV)、免疫缺陷病毒 (HIV)和EB病毒（EBV)感染中低水平的IL-10常与病毒的清除和病毒的有效控制存在相关 性。
[0004] IL-10还与体内自身免疫相关。自身免疫由靶向正常组织的自身抗体、自身反 应性T细胞或它们的某些组合的发展引起。自身免疫性疾病的一个实例是全身红斑狼疮 (SLE)，一种全身的结缔组织都成为炎性的慢性风湿性疾病；自身抗体将正常的身体组织误 认为是外部侵入的物质，攻击正常的身体组织，引起特征性的炎症，其中一些是有肾脏病毒 性的；SLE在女性中的发病率高于男性十倍，它可以在任何年龄段发作，但最常见的是在年 轻成年人中。体内和体外研究都表明，阻断IL-10产生可以减轻SLE的临床表现【参见， Gonzalez-Amaro 等，J. Autoimmunity 11:395-402(1998)】。
[0005] 治疗性地阻断IL-10信号来增加抗病毒免疫和疫苗效果在抗病毒治疗中越来越 有前景。动物实验表明，阻断白介素 10,可以清除慢性病毒感染，如果在DNA疫苗免疫时阻 断白介素10,可以更好地清除慢性病毒感染。卡介苗免疫时阻断白介素10,可以诱导动物 产生更强的T细胞免疫反应，比仅仅使用卡介苗免疫，可以更好地保护免疫动物免受结核 菌感染。此外，肿瘤组织局部注射Toll样受体9配体CpG，腹腔注射抗白介素 10受体抗体， 可以抑制肿瘤生长；病毒样颗粒免疫时阻断白介素10,可以提高病毒样颗粒疫苗诱导的T 细胞免疫反应。疫苗多肽疫苗结合Toll样受体4配体脂多糖LPS免疫时阻断IL-10信号， 也可以抑制人乳头瘤病毒E7抗原转化的TC-1肿瘤细胞在小鼠中的生长。免疫时阻断白介 素10提高疫苗诱导的T细胞反应，清除病毒感染，抑制肿瘤生长的可能机理是，阻断了白介 素10对抗原提呈细胞、特别是树突状细胞的抑制作用。
[0006] IL-10受体是由IL-10R1和IL-10R2亚单位组成的二类细胞因子家庭成员， IL-10R1是唯一的配体连接亚单位。IL-10R2是信号传导的亚单位，与其他细胞因子 (IL-22, IL-26, IL-28和IL-29)所共有。因此最近认为使用特定的分子、抗IL-10或抗 IL-10受体的抗体来阻断IL-10R1与IL-10结合是解决这个问题的可行方法。美国先灵公 司申请的200480040148. 2及其两份分案申请201010004581. 8、201010004582. 2均涉及白 细胞介素-10抗体。但临床使用级的抗体（如单克隆抗体）由于高成本生产和复杂的管理 批准程序等原因尚未投入临床使用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就是为了提高一种与IL-10配体连接亚单位IL-10R1易于结合、从 而据此机制来抑制IL-10生物学功能的多肽。
[0008] 本发明还公开了这种多肽的制备方法。
[0009] 本发明还公开了这种多肽在制药领域中的应用。
[0010] PharmaR&D计算模型和模拟方法已成为药物研发程序的整体组分之一。以结构为 基础的药物设计方法（Structure-based drug design, SBDD)迅速得到发展和广泛应用。可 在靶分子（如相关的蛋白/受体的疾病）、药物候选分子和获得更可靠的模型等方面提供 非常好的前景，如连接位置（蛋白与受体连接位置）、互相作用机制（蛋白与受体结合，氢 键连接，库仑相互作用和某一残端侧链的螯合的方式），相互作用力（破坏蛋白与受体间共 价或非共价键所需的最小能量）和复合物的稳定性（例如温度和PH改变的影响，其他分子 或离子存在的影响等）。通过分析这些数据，构建候选多肽，并用生物学检测方法来进一步 验证。随着计算能力的增强以及高分辨率量子加速X线晶体学获得更准确的蛋白/受体结 构，基于寻找理想的候选肽的SBDD方法由于其易于合成，低毒性和无公害吸引了越来越多 研究者的兴趣。
[0011] 本发明应用分子动力学模拟模型用AMBER12系列程序来模拟分析体内外IL-10和 IL-10R1相互作用，鉴定结合区域和作用力。然后以目标QM/MM模拟方法获得的生物学信息 为基础设计若干个多肽序列。理想的多肽在计算模拟中具有阻断IL-10和IL-10R1之间信 号的能力，模拟方法显示在生理状态下IL-10R1与多肽更易于结合，据此机制来抑制IL-10 的生物学功能。
[0012] 根据上述原理，本发明经过计算，设计并提供了一种多肽序列（氨基酸序列），是 在端部具有SEQ ID No :1所不的氣基酸序列：
[0013] SEQ ID No : 1 :FFKKF FKKFF KKFFK Κ-0Η，即
[0014] NH3-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-C 00H.
[0015] 其中，氨基酸K(赖氨酸，Lys)可以为R(精氨酸，Arg)全部替代；替代后，多肽序 列（氨基酸序列）端部的氨基酸序列为SEQ ID No :2 :FFRRF FRRFF RRFFR R-0H。
[0016] 这种替代也可以部分取代，包括一个替代、两个替代、三个替代、四个替代和五个 替代，替代的氨基酸可以是任何位置。包括SEQ ID N0 :1和2的所有片段序列，如FFKKF FKKFF KK-〇H,FFKKF FKKFF KKFF-〇H,FFKKF FKKFF-0H, FFRRF FRRFF RRFF-〇H,FFRRF FRRFF RR等。
[0017] 本发明多肽的氨基酸序列优选为：SEQ ID No :1 :FFKKF FKKFF KKFFK Κ-0Η,即
[0018] NH3-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-C 00H;或者
[0019] 优选为 SEQ ID No :2 :FFRRF FRRFF RRFFR R-OH ;即
[0020] NH3-Phe-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Arg-C 00H〇
[0021] 模拟结果：SEQ ID N〇:l、2多肽可以与IL-10R1受体结合，并形成较IL-10更为稳 定的复合物结构。
[0022] 1、设计多肽SEQ ID No :1，2和IL-10R1受体的相互作用
[0023] 分子动力学模拟结果显示通过长时间的模拟SEQ ID No :1，2与IL-10R1所形成复 合物的代表构型的主链构型根平均方差均在2A以下，而且，势能也逐渐下降并趋于平稳， 说明已经形成了稳定的构型。
[0024] 2.复合物解离能的比较
[0025] 在此，我们引入解离能的定义及计算方法。解离能，ED，为解离IL-10R1与IL-10或 设计多肽序列所形成复合物形成单体所需要的能量，具体计算公式如下，
[0026] Ed = Ecx-Er = Ep
[0027] 其中，ED为解离能（负值表示需要从外界吸收能量），Ecx、Ep Ep依次为复合物、 IL-10R1、IL-10或设计多肽序列的势能。
[0028] 计算结果如表1所示，相对于IL-10与IL-10R1形成的复合物，SEQ ID N0 :1、2多 肽与IL-10R1所形成的复合物均需要更多的能量才能被解离。由此可以从理论上证明，设 计多肽与IL-10R1形成的复合物更稳定，所以具有与IL-10R1优先结合的能力，从而抑制了 IL-10,而且SEQ ID N0 :1的效果更好。
[0029] 表1IL-10或设计多肽序列与IL-10R1形成复合物解离能
[0030]
【权利要求】
1. 一种多肽，所述的多肽末端SEQ ID No :1所示的氨基酸序列，其中氨基酸K为R全 部、部分替代或者不取代： SEQ ID No :1 :FFKKF FKKFF KKFFK K-0H。
2. 根据权利要求1所述的多肽，所述的多肽为SEQ ID No :1所示的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1所述的多肽，所述的多肽为SEQ ID No :2所示的氨基酸序列： SEQ ID No :2 :FFRRF FRRFF RRFFR R-0H。
4. 一种权利要求1 一 3所述多肽的制备方法，其特征在于采用固相合成法合成。
5. -种权利要求1 一 3所述多肽的制备方法，其特征在于采用生物方法合成。
6. -种核苷酸序列，其特征在于编码权利要求1 一 3所述的氨基酸序列。
7. -种表达载体，其包含编码权利要求6所述的核苷酸序列。
8. -种宿主细胞，其包含权利要求7所述的表达载体。
9. 根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于其是大肠杆菌。
10. -种组合物，包括权利要求1 一 3的多肽和药学上可接受的载体。
11. 权利要求1 一 3所述多肽在制备预防或治疗疾病时阻断白介素10药物中的应用。
12. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述应用为在制备具有免疫刺激作用药 物中的应用。
13. 根据权利要求11或12所述的应用，其特征在于所述应用为在制备具有刺激T细胞 免疫作用药物中的应用。
14. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于与Toll样受体配体联合使用。
15. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于在增强预防性疫苗的预防疾病的效果的 应用。
16. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于在制备增强治疗性疫苗治疗疾病的效果 的应用。
17. 权利要求10所述的组合物在制备预防或治疗疾病时阻断白介素10药物中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104231054SQ201410441333
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】刘晓松, 王天放, 王跃建 申请人:王跃建, 王天放, 刘晓松