一种产小分子透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种产小分子透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法，属于生物工程【技术领域】。本发明采用兽疫链球菌来源的透明质酸合酶hasA和枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖脱氢酶tuaD，重组Pichia pastoris GS115宿主中表达，实现了透明质酸的生产；同时，采用水蛭来源的透明质酸酶整合至毕赤酵母基因组上，分别置于不同强度的组成型启动子下分泌表达，通过控制透明质酸酶的分泌表达量来制备不同分子量大小的小分子透明质酸产物，制备的产物分子量范围有差异，对于微生物直接生产特定范围的小分子透明质酸具有重要的指导借鉴意义。本发明为高效制备小分子透明质酸奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。
【专利说明】一种产小分子透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产小分子透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法，属于生物工程
【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 透明质酸（Hyaluronic Acid, HA)，是一种高分子粘性多糖，以其独特的分子结构 和理化性质，使其具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，是目前发现的自然界中保 湿性最好的物质，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领 域。近年来研究发现，低分子量的HA(低于IXlO 4)和透明质酸寡糖具有独特的生物学功 能。低分子量的HA(低于IXlO4)和寡聚透明质酸，表现出非常强的生物活性，具有抑制 肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，免疫 细胞、细胞因子的激活剂。HAlO(K)糖单位）和HA8 (8糖单位）可以刺激成纤维细胞增殖、 胶原合成以及可以通过破坏大分子透明质酸与细胞受体的相互作用而选择性杀死癌细胞； HA6和HA4可以诱导体内树突细胞的成熟以及新血管合成。此外，HA寡糖容易被人体吸收 而用于人体自身HA等多糖合成的前体，因此，HA寡糖在食品保健以及医药领域具有重要的 应用前景。
[0003] 目前，虽然已有报道采用从头合成的方法来制备HA寡糖，但由于化学合成存在底 物昂贵、步骤繁琐以及合成效率低等多问题，难以实现HA寡糖制备应用。相比较，酶法催化 合成HA寡糖是一种很有潜力的方法，但需要制备大量的透明质酸酶液和控制反应条件。因 此，将微生物发酵生产HA和透明质酸酶（Hyaluronidase，HAase)相偶联，实现一菌发酵直 接生产获取HA寡糖和透明质酸酶两种产物，具有一定的研究意义和工业化潜力。
[0004] 本发明在毕赤酵母（Pichia pastoris)内重组表达Streptococcus zooepidemicus来源的透明质酸合成酶hasA和UDP-葡萄糖脱氢酶的tuaD以构建HA合成 途径，并表达HAase，以实现一菌同步发酵生产HA和HAase，在发酵液中直接制备生产HA寡 糖产物。这一偶联模式解决了当前微生物生产HA过程中由于粘度过高导致发酵停滞产量 难以获得突破的瓶颈问题，尤其是首次实现微生物高效合成HA寡糖，具有巨大的应用价值 和经济效益。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种产小分子透明质酸的重组毕赤酵母， 是在重组毕赤酵母内构建了产透明质酸的途径并偶联分泌表达透明质酸酶。为构建产透明 质酸的途径，在毕赤酵母中表达了编码透明质酸合酶的基因 hasA和UDP-葡萄糖脱氢酶的 基因 tuaD。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母为Pichia pastoris GS115。
[0007] 所述透明质酸合酶编码基因 hasA可以来源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)、马链球菌(Streptococcus equi)或类马链球菌(Streptococcus equissp)。在本发明的一种实施方式中，编码所述透明质酸合酶的基因 hasA来源于兽疫链 球菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 所述UDP-葡萄糖脱氢酶可以来源于链球菌属（Streptococcus species)、大肠杆 菌（Escherichia coli)或芽孢杆菌（Bacillus)。在本发明的一种实施方式中，编码所述 Μ)Ρ-葡萄糖脱氢酶的基因 tuaD来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，hasA和tuaD分别由组成型强启动子控制表达，例如 毕赤酵母组成型强启动子。如hasA由三磷酸甘油醛脱氢酶启动子GAP(SEQ ID N0.3)控制 表达，tuaD由翻译延伸因子l-α启动子TEF1(SEQ ID NO. 4)控制表达。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述透明质酸酶LHyal来源于水蛭，融合启动子和 信号肽后通过重组整合到毕赤酵母基因组进行表达。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，编码所述透明质酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5 所示。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述透明质酸酶基因分别置于不同强度的组成型启 动子GAP、TEFl或YPTl (SEQ ID NO. 6)控制下表达；信号肽为α -因子信号肽。透明质酸 酶表达量越高，所制得HA的分子量越小。将水蛭透明质酸酶基因与GAP启动子融合，所得 重组毕赤酵母发酵生产的HA平均分子量为41000道尔顿。将水蛭透明质酸酶基因与TEFl 启动子融合，所得重组毕赤酵母发酵生产的HA平均分子量为66500道尔顿。将水蛭透明质 酸酶基因与YPTl启动子融合，所得重组毕赤酵母发酵生产的HA平均分子量为110000道尔 顿。
[0013] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建所述重组毕赤酵母的方法，主要 包括以下步骤：
[0014] (1)构建透明质酸的合成途径：将编码透明质酸合酶的基因 hasA与启动子GAP融 合，将编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因 tuaD与启动子TEFl融合，将两个融合片段再融合后 连接表达载体，转化毕赤酵母得到含透明质酸合成途径的毕赤酵母；
[0015] (2)偶联表达透明质酸酶：将透明质酸酶基因融合启动子后整合到步骤（1)所得 重组毕赤酵母的基因组中，获得偶联表达透明质酸酶的重组毕赤酵母。
[0016] 所述步骤（2)中的启动子可根据需要制备的HA的分子量进行调整，启动子强度越 大，重组毕赤酵母产的HA的分子量就越小。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，步骤（2)选定毕赤酵母基因组上乙醇脱氢酶基因作 为透明质酸酶整合位点。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，步骤（2)将水蛭透明质酸酶基因与GAP启动子融合， 所得重组毕赤酵母发酵生产的HA平均分子量为41000道尔顿。
[0019] 在本发明的另一种实施方式中，步骤（2)将水蛭透明质酸酶基因与TEFl启动子融 合，所得重组毕赤酵母发酵生产的HA平均分子量为66500道尔顿。
[0020] 在本发明的另一种实施方式中，步骤（2)将水蛭透明质酸酶基因与YPTl启动子融 合，所得重组毕赤酵母发酵生产的HA平均分子量为110000道尔顿。
[0021] 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种应用所述重组毕赤酵母发酵产小分 子透明质酸（l〇 4Da〈Mr〈105Da)或透明质酸寡糖（MKlO4Da)的方法，是以甘油、甲醇、山梨醇 或葡萄糖等作为碳源，在20-30°C，发酵48-96h。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，将经活化培养的重组毕赤酵母接种于发酵培养基， 200rpm3(TC培养96h。所得小分子透明质酸分子量小于IO 5Da,主要产物为低分子量或者 HA-4、HA-6、HA-8、HA-10等透明质酸寡聚糖。
[0023] 所述发酵培养基含：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4,11. 8g/L KH2PO4,1 X YNB (13. 4g/L)，500 X 生物素 lml/L (4 X IOVD，甘油 lml/L，添加 2g/L 的 MgSO4, 葡萄糖浓度为5%。
[0024] 所得发酵液中的透明质酸酶分离纯化后可用于食品、医药或临床等用途。
[0025] 本发明利用毕赤酵母偶联产透明质酸酶和透明质酸，在产高分子HA的过程中，HA 被同时分泌至胞外的透明质酸酶降解为小分子透明质酸，具有直接的目的性。与其他方式 相比，该发明具有非常大的应用优势。首先，本发明偶联表达透明质酸酶，降低了发酵液粘 稠度，增加了溶氧和提高了 HA的产量；其次，发酵液中酶水解制备的小分子寡聚透明质酸 的转化产率高达95%以上，产物的分子量小余IO5道尔顿，且主要产物为低分子量寡聚糖， 易于纯化回收。基于应用分析，本发明方法在工业上用于制备小分子寡聚透明质酸及其衍 生体具有潜在而非常广泛的价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1所示为重组质粒PAPAT9K的构建示意图。
[0027] 图2所示为水蛭透明质酸酶基因整合片段的构建示意图。
【具体实施方式】
[0028] 序列表中为相关核苷酸序列信息：
[0029] (I)SEQ ID NO. 1序列信息为兽疫链球菌来源的透明质酸合成酶编码序列；
[0030] (2) SEQ ID NO. 2序列信息为枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖脱氢酶编码序列；
[0031] (3) SEQ ID NO. 3序列信息为毕赤酵母组成型启动子GAP的基因序列；
[0032] (4) SEQ ID NO. 4序列信息为毕赤酵母组成型启动子TEFl的基因序列；
[0033] (5) SEQ ID NO. 5序列信息为水蛭来源的透明质酸酶LHyal的基因序列；
[0034] (6) SEQ ID NO. 6序列信息为毕赤酵母组成型启动子YPTl的基因序列；
[0035] (7) SEQ ID NO. 7序列信息为编码毕赤酵母α -因子信号肽序列的基因序列。
[0036] (8)SEQIDN0·8为毕赤酵母基因组无痕改造片段PA0X-mazF-Zeocin(AMZ)的基因 序列。
[0037] 实施例IhasA基因和UDP-葡萄糖脱氢酶tuaD基因的克隆
[0038] 本发明所用的hasA基因来源于为兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicus ATCC 35246 和 UDP-葡萄糖脱氧酶基因来源于 Bacillus subtilis，Streptococcus zooepidemicus菌株在接种与5ml M17液体培养基，在37°C 200rpm培养16h。Bacillus subtilis 接种于 5ml LB 液体培养基，在 37°C 200rpm 培养 16h。Pichia pastorisGS115 接 种于5ml YH)液体培养基，置于200rpm30°C培养24h。分别收集菌体，采用细菌基因组提取 试剂盒提取三菌株的基因组DNA。
[0039] 根据已公布的基因组信息序列，分别设计引物hasA-F/hasA-R、tuaD-F/tuaD-R, 以提取的基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，分别扩增获取hasA和tuaD 基因。以Pichia pastorisGS115基因组为模板,设计引物gap-F/gap-R和tef-F/tef-R分 别扩增GAP和TEFl启动子。
[0040] 引物序列信息：5' -3'方向
[0041] hasA-F ： TGAACAACTATTTCGAAACGATGAGAACATTAAAAAACCTCATAAC
[0042] hasA-R ： TGTCTAAGGCGAATTAATTCTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTC
[0043] tuaD-F ：CATTTTAGTTATTCGCCAACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGGAACAGG
[0044] tuaD-R ： CCGGAATTCTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTCAGC
[0045] gap-F ：CTTGATTCGAGCTCTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTC
[0046] gap-R ：AGGTTTTTTAATGTTCTCATCGTTTCGAAATAGTTGTTCAATTG
[0047] tef-F ：GAACACGTAAAAAATTATTATAAGAATTCCGGATAACTGTCGCCTCTTTTATCTGCCGC
[0048] tef-R ：ATGACAGCTATTTTTTTCATGTTGGCGAATAACTAAAATGTATGTAG
[0049] 实施例2重组质粒PAPT9K的构建
[0050] 采用上述扩增的DNA片段hasA、tuaD、GAP和TEF1，分别采用融合PCR进行启动子 和目的基因的融合。具体操作程序如下：hasA和GAP片段各取2ul混合于PCR管内，加入无 菌水21 μ 1和25 μ 12xsuper pfu Master Mix (杭州宝赛生物科技有限公司），混勻后置于 PCR 仪，按如下程序运行：94°C 3min，[94°C 30s，50°C 30s，72°C lmin]X10,72°C 5min。无 引物自融合PCR结束后，立即加入引物gap-F和hasA-R各I μ 1，混匀后按如下程序运行： 94°C 3min，[94°C 30s，55°C 30s，72°C lmin] X 32, 72°C 5min。PCR 产物经 1 % 的琼脂糖凝胶 电泳后，切胶回收目标条带，获得GAP-hasA片段。
[0051] 同理，按上述操作融合PCR获得TEFl-tuaD片段。回收的两个融合片段 GAP-hasA和TEFl-tuaD，在按上述融合PCR操作，将两片段进行融合，获得目标片段 GAP-hasA-TEFl-tuaD。由于在引物gap-F和tuaD-R两端分别引入了 SacI和NotI限制性 酶切位点，将载体PPIC9K进行SacI和EcoRI双酶切，去掉了 AOX启动子和α -因子信号 肽，重组目标片段GAP-hasA-TEFl-tuaD同样采取SacI和EcoRI双酶切，回收后与已双切的 PPIC9K载体连接，转化大肠杆菌JM109宿主，对鉴定出的阳性克隆提取质粒进行测序，比对 分析重组质粒PAPT9K构建成功，质粒构建示意图如附图1所示。
[0052] 实施例3重组毕赤酵母产HA的菌株构建
[0053] 重组质粒PAPT9K采用Sail线性化后，按毕赤酵母操作手册，电转Pichia pastoris GS115宿主，以MD平板（组氨酸缺陷型筛选标记）筛选阳性重组子。同时，为筛 选多拷贝插入的宿主，以含有不同浓度抗生素 g418的YH)平板进行高拷贝筛选。本发明中 采用的发酵重组菌株为4mg/ml筛选出来的阳性重组菌株，命名为PAPTGS115。
[0054] 实施例4重组毕赤酵母PAPTGS115菌株的摇瓶发酵
[0055] 挑取PAPTGS115重组菌单克隆接种于5ml YH)培养基，置于200rpm30°C过夜培养。 16h后接种于250ml三角摇瓶（装液量25ml)中，发酵培养基为BMGY :酵母提取物10g/L，蛋 白胨 20g/L，3g/L K2HP04，11.8g/L KH2P04，lXYNB(13.4g/L)，500X 生物素 lml/L(4Xl(T4g/ L)，甘油lml/L，添加2g/L的MgS04,葡萄糖浓度为5 %。按I %的接种量转接与BMGY摇瓶， 置于 200rpm30°C培养 96h。
[0056] 收集发酵液，IOOOOrpm下室温离心lOmin。发酵液上清转移置另一离心管中，加入 2倍体积的无水乙醇充分混匀沉淀发酵液中的透明质酸。室温下静置lh，再IOOOOrpmT 室温离心20min，去除干净液体，白色沉淀加入发酵液等体积的IM NaCl溶液充分溶解。对 发酵液进行适当的稀释后，采用Bitter-Muir硫酸咔唑法检测HA酸含量，对照组为Pichia pastoris GS115同等条件下发酵液的回收物。经测定PAPTGS115重组菌株的HA产量为 0.36g/L〇
[0057] 实施例5水蛭透明质酸酶LHyal基因整合片段的构建
[0058] 以大肠杆菌来源的毒素基因 mazF和博来霉素抗性基因 Zeocin作为双筛选标记， 构建毕赤酵母基因组无痕改造片段AMZ。具体操作如下：设计引物对A0X-F/R、mazF-F/R和 Zeo-F/R，分别扩增启动子AOX片段、mazF和Zeocin片段，采用融合PCR技术，按实施例2中 所述的融合步骤，将三个片段融合为PAOX-mazF-Zeocin，命名为AMZ。引物对信息如下：
[0059] AOX-F ：AACATCCAAAGACGAAAGGTTG
[0060] AOX-R ：ACGTATCGGCTTACCATCGTTTGGATCCTTCGAATAATTAG
[0061] mazF-F ： TTCGAAGGATCCAAACGATGGTAAGCCGATACGTACC
[0062] mazF-R ：GCTATGGTGTGTGGGAAGCTTGCACAAACGAAC
[0063] Zeo-F ： TTCGTTTGTGCAAGCTTCCCACACACCATAGCTTCAAAATG
[0064] Zeo-R ：AGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG
[0065] 选定毕赤酵母基因组上乙醇脱氢酶位点（Alcohol dehydrogenase)作为透明质酸 酶整合位点。采用AMZ无痕操作技术，构建整合片段（见附图2)。先采用融合PCR技术，将 不同强度的三个启动子GAP、TEFl和YPTl分别与LHyal基因进行融合；在乙醇脱氢酶基因 两端各取600bp左右的DNA片段作为同源重组的同源臂Arm-F和Arm-R,同时取Arm-R下游 约33bp的序列作为二次交换序列（DR)，融合于AMZ片段前端。最后，采取多次重叠 PCR技 术，按实施例2操作过程和附图2所示顺序，分别构建完整的三个基因整合片段。此实施例 引物信息序列如下：
[0066] Arm-F-F ：AAATTTCTTAGAAGGGGCCCATCTAGTTAGCGAG
[0067] Arm-F (GAP) -R :CCAAGACATTTCTACAAAAACTTTTACTCTAGGGGACCGCCGTTGGTC
[0068] Arm-F (TEFl) -R ：GATAAAAGAGGCGACAGTTATCTTTTACTCTAGGGGACCGCCGTTGGTC
[0069] Arm-F (YPTl) -R ：TCCCCAGACTACTTCCTCCACCTTTTACTCTAGGGGACCGCCGTTGGTC
[0070] Arm-R-F ：AAGGCTTTAATTTGCAAGCTACGGATCTTTCCAGCAGTATGCTACTG
[0071] Arm-R-R ：GAAACTCATTACATAAGACGTATACAAACTATTCG
[0072] ADPGAP-F ：GCGGTCCCCTAGAGTAAAAGTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCC
[0073] ADPGAP-R ：GTCACCGCGATCTCTTTCATCGTTTCGAAATAGTTGTTCAATTG
[0074] ADPTEFI-F :GCGGTCCCCTAGAGTAAAAGATAACTGTCGCCTCTTTTATCTGCCG
[0075] ADPTEFI-R :GTCACCGCGATCTCTTTCATGTTGGCGAATAACTAAAATGTATGTAG
[0076] ADPYPTI-F ：GCGGTCCCCTAGAGTAAAAGGTGGAGGAAGTAGTCTGGGGAGGTTG
[0077] ADPYPTI-R ：GTCACCGCGATCTCTTTCATATCGATGGGTAATGAGTCTTTTTGTG
[0078] ADLHyal (GAP) -F ：TGAACAACTATTTCGAAACGATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTG
[0079] ADLHyal (TEFl)-F ：CATTTTAGTTATTCGCCAACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTG
[0080] ADLHyal (YPTI)-F ：AAGACTCATTACCCATCGATATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTG
[0081] ADLHyal-R ：
[0082] GAAACTCATTACATAAGACGTATACAAACTATTCGGCTTATTTTTTGCAGGCTTCAACGTTAGCAG
[0083] ADAMZ-F ：GCCGAATAGTTTGTATACGTCTTATGTAATGAGTTTCAACATCCAAAGACGAAAGGTTG
[0084] ADAMZ-R：ATACTGCTGGAAAGATCCGTAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCG
[0085] 三个融合重组片段，制备浓度为500ng/y 1，电转产HA重组宿主PAPTGS115,涂布 含有50ug/ul Zeocin的YPD平板，置于37°C培养2-3天，发生同源重组的菌落携带AMZ片 段，可以在此平板上生长。对长出的单菌落转移至以1%甲醇为碳源（不含葡萄糖）的YPD 平板上，置于37°C培养2-3天。在此过程中，以DR序列发生第二次交换，使得AMZ片段丢 失，实现LHyal的无痕整合。若未发生二次交换，AMZ未丢失，AOX启动子在甲醇诱导下表 达毒性蛋白mazF，使得宿主死亡。因此，在含甲醇的YH)平板上生长的菌为成功重组LHyal 的宿主，通过提取基因组进行PCR验证和测序，该宿主改造成功，含有不同强度的三个启动 子 GAP、TEFl 和 YPTl 的重组菌株分别命名为 GLHAGS115、TLHAGS115 和 YLHAGS115。
[0086] 实施例6重组毕赤酵母LHPAPTGS115菌株的摇瓶发酵
[0087] 分别挑取GLHAGS115、TLHAGS115和YLHAGS115重组菌单克隆接种于5ml YH)培 养基，置于200rpm3(TC过夜培养。按实施例4发酵过程操作：16h后接种于250ml三角摇 瓶（装液量25ml)中，发酵培养基为BMGY :酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4, 11. 8g/L KH2PO4,1 X YNB (13. 4g/L)，500 X 生物素 lml/L (4 X l(T4g/L)，甘油 lml/L，添加 2g/L 的MgS04,葡萄糖浓度为5%。按I %的接种量转接与BMGY摇瓶，置于200rpm30°C培养96h。
[0088] 收集发酵液，IOOOOrpm下室温离心lOmin。发酵液上清转移置另一离心管中，力口 入3倍体积的无水乙醇充分混匀沉淀发酵液中的透明质酸。室温下静置lh，再IOOOOrpm 下室温离心20min，去除干净液体，白色沉淀加入发酵液等体积的IM NaCl溶液充分溶解。 对样品进行适当的稀释后，采用Bitter-Muir硫酸咔唑法检测HA酸含量，对照组为Pichia pastoris GS115同等条件下发酵液的回收物。经测定GLHAGS115、TLHAGS115和YLHAGS115 重组菌株的HA产量分别为0. 59g/L、0. 53g/L和0. 43g/L。同时，对三株重组菌产生的HA的 分子量进行测定，平均分子量分别41000、66500和110000道尔顿。
【权利要求】
1. 一种重组毕赤酵母，其特征在于，是在毕赤酵母内表达了编码透明质酸合酶的基因 hasA和UDP-葡萄糖脱氢酶的基因 tuaD以获得产透明质酸的途径，并偶联分泌表达透明质 酸酶。
2. 根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，以毕赤酵母（Pichia pastoris) GS115为宿主。
3. 根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述透明质酸合酶编码基因 hasA 来源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)、马链球菌（Streptococcus equi)或类马链球菌（Streptococcus equissp) 〇
4. 根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述UDP-葡萄糖脱氢酶来 源于链球菌属（Streptococcus species)、大肠杆菌（Escherichia coli)或芽抱杆菌 (Bacillus)〇
5. 根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，hasA和tuaD分别由毕赤酵母组 成型强启动子控制表达。
6. 根据权利要求1-5任一所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述透明质酸酶来源于 水蛭，融合启动子和信号肽后通过重组整合到毕赤酵母基因组进行表达。
7. 根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述透明质酸酶基因分别采用 不同强度的组成型启动子控制表达，包括GAP、TEF1或YPT1。
8. -种构建权利要求1-5, 7任一所述重组毕赤酵母的方法，主要包括以下步骤： (1) 构建透明质酸的合成途径：将编码透明质酸合酶的基因 hasA与启动子GAP融合， 将编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因 tuaD与启动子TEF1融合，将两个融合片段再融合后连接 表达载体，转化毕赤酵母得到含透明质酸合成途径的毕赤酵母； (2) 偶联表达透明质酸酶：将透明质酸酶基因融合启动子、信号肽后整合到步骤（1)所 得重组毕赤酵母的基因组中，获得偶联分泌表达透明质酸酶的重组毕赤酵母。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤⑵信号肽采用α-因子信号肽，启 动子采用GAP、TEF1或ΥΡΤ1。
10. -种应用权利要求1-5,7任一所述重组毕赤酵母发酵产小分子透明质酸或寡聚透 明质酸的方法，是以甘油、甲醇、山梨醇或葡萄糖作为碳源，在20-30°C，发酵48-96h。
【文档编号】C12P19/26GK104263666SQ201410467076
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】陈坚, 堵国成, 康振, 金鹏 申请人:江南大学