一株高效过表达内源虾青素合成酶基因的法夫酵母菌株的制作方法
【专利摘要】一株高效过表达内源虾青素合成酶基因的法夫酵母菌株。本发明提供了一株过表达内源虾青素合成酶基因得到的法夫酵母高产虾青素基因工程菌株，通过游离质粒过表达虾青素合成酶基因crtS,获得了高产虾青素的法夫酵母基因工程菌株(MK19-pGBKT7crtS)，将其定名为CSR19。该菌株表达的crtS基因前带有内源的核糖体结合位点序列(简称Rbs.序列)。经发酵培养并与受体菌株MK19相比，该工程菌株的虾青素产量提高了33.5％，且稳定性好，在饲料工业中具有良好的应用前景。
【专利说明】一株高效过表达内源虾青素合成酶基因的法夫酵母菌株
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体地，涉及一株高效过表达内源虾青素合成酶基因 的法夫酵母菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 虾青素（化学名称：3,3'-二羟基_4,4'-二酮基-β-胡萝卜素），分子式为 C4tlH52O4，分子量为596. 86。是一种在自然界中广泛存在的叶黄素类类胡萝卜素，一些藻类， 细菌，真菌和浮游生物可以自身合成虾青素，而其他的高等生物如甲壳类，鱼类和鸟类则通 过食物链摄取虾青素，继而储存在体内，使外观呈现红色，提高商业价值。
[0003] 虾青素是类胡萝卜素合成的最高级别产物，因此在自然界，虾青素具有最强的抗 氧化性，可以有效清除细胞内的氧自由基，在动物体内有抑制肿瘤发生、增强免疫机能的功 能。
[0004] 基于以上的特性，虾青素在水产养殖，医药，保健及化妆品领域具有广泛的应用。 目前市场上的虾青素来源主要为化学合成，不仅价格昂贵，而且同天然虾青素在结构、功 能、应用及安全性等方面差别显著，由此对天然虾青素的需求正在增加。
[0005] 法夫酵母属于担子菌门，杂担子菌纲，红法夫酵母属，可以利用多种碳源进行发 酵，是一种具有工业化应用前景的虾青素产生菌株。为了提高其虾青素产量， 申请人:在前 期通过高产菌株选育和发酵工艺优化等手段，获得了一株高产虾青素法夫酵母突变菌株 ΜΚ19(菌种保藏号为CGMCC No. 3445)，并确定了最适的培养方法，有效地提高了虾青素的合 成效率。
[0006] 虾青素合成酶（编码基因为crtS)是一种细胞色素 P450单氧酶，在色素合成前体 物质到终产物虾青素的转化过程中发挥作用。CrtS在细胞内的表达量多少对虾青素的产量 具有重要影响。若能获得过表达虾青素合成酶基因 crtS的的法夫酵母基因工程菌株，将极 大地提高虾青素的产量，适应目前日益增长的工业生产需求。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种在法夫酵母中有效表达色素合成酶的游离质粒 载体及其高效转化并稳定存在于法夫酵母的方法。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种通过过表达虾青素合成酶基因而获得的高产虾 青素的法夫酵母工程菌株及其培养方法。
[0009] 为了实现以上目的，本发明从法夫酵母（Phaffia rhodozyma)菌株中克隆到虾青 素合成酶（astaxanthin synthetase)基因 crtS，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所不，该基 因全长为3302bp，GC含量为52. 7 %，其mRNA序列长度为1809bp，开放阅读框ORF长度为 1674bp，包含18个外显子和17个内含子，编码由557个氨基酸组成的虾青素合成酶CrtS， 其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。预测该蛋白分子量为62. 6kD，等电点为5. 67。CrtS 属于细胞色素 P450单氧酶家族中的3A亚家族，它与其他P450单氧酶家族的蛋白具有很高 的相似度。包含有氧结合位点（339AGYETS344),其中的G34°and T343为保守残基。亚铁血红素 结合域（488fisgpracfg497)，以及参与稳定蛋白三维结构的保守结构域（ 394ESLR397)。
[0010] 本发明选择的在法夫酵母中过表达crts基因的质粒载体为PGBKT7,该质粒为游 离型表达质粒，最初用于酿酒酵母菌。其组成型启动子P adhi可以启动下游融合蛋白的高效 表达，并可通过2μ复制位点，在酵母中自主复制。该质粒对于酵母细胞具有较高的转化效 率。
[0011] 本发明从法夫酵母ΜΚ19中提取总RNA，通过反转录获得第一链CDNA，以CDNA为模 板扩增获得包含起始密码子上游17bp核糖体结合位点序列的crtS基因，通过酶切连接反 应将其插入到PGBKT7质粒上，获得过表达虾青素合成酶CrtS的质粒载体pGBKT7-crtS (图 1所示）。
[0012] 通过以下步骤制备得到：
[0013] a)法夫酵母总RNA的提取
[0014] (1)取适量的法夫酵母（Phaffia rhodozyma)细胞，液氮研磨，加入ImlTrizol试剂 (Invitrogen)，剧烈震荡5分钟，室温孵育5分钟；
[0015] ⑵加入〇· 2ml氯仿，剧烈振荡15-30秒，室温孵育3分钟；
[0016] (3)4?，12000rpm离心15分钟，样品会分为三层，将上层无色水相转移至新管中， 再进行下一步操作；
[0017] (4)加入一倍体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟，4°C，12000rpm离心10分 钟，弃掉上清；
[0018] (5)加 lml75%乙醇洗涤沉淀，4°C，7500rpm离心5分钟，弃掉上清；
[0019] (6)开盖，室温冰上干燥10分钟；
[0020] (7)加入适量的没有RNA酶的水溶解沉淀，得到总RNA溶液；b)法夫酵母cDNA第 一链的制备
[0021] 反转录采用由Promega公司生产的反转录酶（M-MLV)，具体操作步骤如下：
[0022] 反应体系为25μ 1，将以下成分加到一个无核酸酶的离心管中：
[0023] 总 RNA 2 μ g
[0024] OligdT (0· 5 μ g/μ L) 2 μ L
[0025] 70°C加热5分钟，解链，立即放冰上2分钟。
[0026] M-MLV buffer (5 X) 5 μ L
[0027] M-MLV 反转录酶（200U/ μ L) 1 μ L
[0028] dNTPs (IOmM) I. 25 μ L
[0029] RNA 酶抑制剂 0· 625 μ L
[0030] RNase free water 补至 25 μ L
[0031] 42 °C温浴60分钟，95 °C加热5分钟终止反应，冷冻保存；c)引物设计
[0032] 根据GenBank中crtS基因的序列（GenBank登录号为DQ002006)，设计合成克隆引 物如下：
[0033] CRTSCPF :5' - AATGCCATGGCCACCTACTTTCTCCATATG- 3'
[0034] CRTSCPR :5，- AACTGCAGGACGACGTAGAAGTCATAGC- 3'
[0035] 在克隆引物两端分别设计有NcoI和PstI酶切位点（见上述序列中斜体并有下划 线的部分）
[0036] 含核糖体结合位点的法夫酵母虾青素合成酶基因 crtS的PCR扩增：用CRTSCPF、 CRTSCPR为引物，以上述获得的法夫酵母cDNA为模板，扩增获得crtS的cDNA片段，PCR反 应体系如下：
[0037]
【权利要求】
1. 含自身核糖体结合位点序列的法夫酵母虾青素合成酶Crts，其氨基酸序列为： a) SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；或 b) SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成 的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述法夫酵母虾青素合成酶的基因 crtS，是如下a)或b): a) 其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示；或 b) 由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码bPrP的核苷酸 序列。
3. 含有权利要求2所述基因的过表达质粒载体。
4. 如权利要求3所述的过表达载体，其为pGBKT7-crtS。
5. 如权利要求4所述的过表达载体，其特征在于，通过以下步骤制备得到： a) 法夫酵母总RNA的提取 b) 法夫酵母cDNA第一链的制备，25 μ 1反应体系为：总RNA 2 μ g，0.5 μ g/μ L的 OligdT 2 μ L，M-MLV buffer 5 μ L，200U/ μ L 的 M-MLV 反转录酶 1 μ L，dNTPs 1· 25 μ L，RNA 酶抑制剂〇. 625 μ L，无 RNA酶水补至25 μ L，42°C温浴60分钟，95°C加热5分钟终止反应， 冷冻保存； c) 含核糖体结合位点的法夫酵母虾青素合成酶基因 crtS的PCR扩增，用CRTSCPF、 CRTSCPR为引物，以获得的法夫酵母cDNA为模板，扩增获得crtS的cDNA片段，20 μ 1的PCR 反应体系如下：10μg/μl的模板cDNAlμl，10XBuffer2μl，2XTaqmixl0μl，上下 游引物各 〇. 5μ 1，ddH20 6 μ 1 ; 反应条件为：94 °C 3min ;94 °C 30s，60°C 30s，72 °C 2min，30 个循环；72 °C 5min ; 4°C 2min ； CRTSCPF :5' -AATGCCATGGCCACCTACTTTCTCCATATG-3' CRTSCPR:5，- AACTGCAGGACGACGTAGAAGTCATAGC- 3' ； d) 从PCR反应产物中回收目的片段，将PCR回收产物连接到载体pMD18-T-Simple上， 构建得到质粒pMD18-T_crtS ; e) 目的基因连接到酵母表达载体pGBKT7,用限制性内切酶Ncol和PstI分别对 pMD18-T-crtS和pGBKT7进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4DNA连接酶将其连接， 得到表达质粒pGBKT7_crtS。
6. -株高效过表达内源虾青素合成酶基因的法夫酵母菌株CSR19。
7. 制备权利要求6所述法夫酵母菌株CSR19的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将YH)培养基中过夜培养的法夫酵母种子按〇. 5%的接种量接种到YH)培养基中， 21°C，200rpm，培养至0D_值为1 ;所述法夫酵母为高产虾青素法夫酵母突变菌株MK19,保 藏号为 CGMCCNo. 3445 ; 2) 4°C，8000rpm，离心8分钟收集法夫酵母突变菌株MK19细胞，用13ml 50mM，pH值为 7. 0的磷酸钾缓冲液重悬细胞，21°C保温15分钟；所述磷酸钾缓冲液包含25mM二硫苏糖 醇； 3) 用13ml STM缓冲液洗细胞2次，最终重悬在0. 8ml的STM缓冲液中；所述STM缓冲 液配方为 270mM 蔗糖，10mM Tris HC1, ρΗ7· 5, ImM MgCl2 ; 4) 将5 μ g/ul的pGBKT7-crtS质粒DNA 4 μ 1与80 μ 1上述重悬细胞混合，放置冰上 15min，之后转移至预冷的0. 2cm电转杯中； 5) 电转条件为：电压为2. OkV,脉冲长度为4ms,电极间距为0. 2cm,立即加入预冷的 lmlYH)培养基，复壮2. 5小时； 6) 复壮后的细胞分别以Ι,ΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟΛΚΓ5的稀释度涂布PDA平板，21°C培养 4-5天后观察结果； 7) 阳性转化子的验证：液体种子培养基培养转化子至对数中期，取lml发酵液离心收 集菌体，用玻璃珠法破碎细胞，提取质粒DNA，以此为模板，采用PCR的方法验证质粒的存 在：正向引物CRTSIDF为T7启动子的测序引物，反向引物CRTSIDR位于crtS基因内部， 引物序列：CRTSIDF: GTAATACGACTCACTATAGGGCG CRTSIDR: GAGGTAAAGACTGAAGMCGC 2(^1?〇?反应体系如下：10\8肛€612 4 1，2\了39 11^11(^1，上下游引物各0.5 4 1， ddH20 6 μ 1 ； 反应条件为：94°C 3min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 20s，30 个循环；72°C 5min ;4°C 2min。
8. 法夫酵母菌株CSR19在制备虾青素中的应用。
9. 法夫酵母菌株CSR19发酵生产虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 种子活化：挑取CSR19菌苔接种至新鲜PDA斜面，21?25°C培养3?7天； (2) 液体种子活化：从步骤（1)的PDA斜面上挑取菌苔至液体种子培养基中，21? 25°C，200-220rpm，培养 2-4 天； 上述液体种子以10%的接种量第二次转接液体种子培养基，21?251：，200-220印111， 培养液〇D6QQ = 9?12停止培养； (3) 发酵培养：步骤（2)的液体种子以4% -8%质量比接种至液体发酵合成培养基， 21 ?25°C，200-220rpm，培养 4-6 天。
10. 含有法夫酵母菌株CSR19的菌剂。
【文档编号】C12R1/645GK104278015SQ201410466752
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】李颖, 迟爽, 何彦锋, 苏倩, 楼慧强, 李季伦 申请人:中国农业大学