荧光定量pcr检测猪主要病毒的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明利用探针荧光定量PCR技术，分2个体系能从临床样品中快速获取并检测出多种引起猪繁殖障碍和腹泻疾病的病毒，A体系检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)；B体系检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)。该检测试剂盒设计合理，使用方法简单，快速，准确，灵敏度高，适合于口岸检验检疫、畜牧业养殖、动物保护等部门使用，同时具有广泛的科研价值和商业前景。
【专利说明】荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明提供一种多重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
技术背景
[0002]每年的5月份至10月份，都会爆发一种以高热，呼吸困难，食欲下降，部分母猪流产、死产为特征的猪繁殖障碍性病。该病可传染各年龄段的猪，发病率高，死亡率随病程、继发感染发热严重程度不同而异，据估计，严重发病率群死亡率可达50%。该病来势凶猛，无特异防治方法，容易继发或并发其他病原微生物导致死亡，给养猪业造成巨大经济损失。猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine productiveand respiratory syndrome virus, PRRSV)、伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus, PRV)、猪痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)是与猪繁殖障碍密切相关的5种传染病病原菌。并且常常混合感染，有时又伴有细菌(如链球菌、胸膜肺炎放线杆菌)和血液原虫(如附红细胞体、弓形体)的并发或继发感染。还会导致腹泻等情况的发生。
[0003]猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是目前已知的最小的动物病毒。PCV分两个亚型，PCV-1型无致病性，PCV-2型感染主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)。PCV-2 感染与猪群中发生的许多新传染病密切相关，包括猪间质性肺炎、猪皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍以及仔猪先天性颤抖等，这些病总称为猪圆环病毒病(porcine circovirus associated diseases,PCVAD)。PCVAD作为一种新的病毒病在许多国家广泛流行，仅PMWS每年对欧洲养猪业造成的损失高达6亿欧元。目前，PCV-2感染在我国猪群中普遍存在，能够引起免疫抑制、混合感染和继发感染，严重危害养猪业的发展。
[0004]猪细小病毒(PPV)属于细小病毒科细小病毒属成员，是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一。PPV在世界各地普遍存在，可引起怀孕母猪流产、死胎、胎儿木乃伊化等，我国于20世纪80年代初在不同区分离得到了猪细小病毒，调查显示，绝大多数猪场均存在PPV的感染。近地年来，PPV感染呈扩大上升趋势，并呈现出许多新的流行特点，给养猪业造成巨大的经济损失。研究发现，该病毒除了能直接导致猪生殖缺陷外，还可在猪圆环病毒2型引起的断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的临床感染中扮演重要角色。
[0005]伪狂犬病病毒(PRV)属于疱疫病毒科α疱疫病毒亚科，可以感染多种家畜和野生动物。猪是PRV的天然宿主，感染后可引发母猪繁殖障碍，仔猪大量死亡，公猪失去种用能力等。根据不完全统计，全世界己有40多个国家和地区报道发生过本病，我国自1947年首次报道以来，现己扩展到全国二十几个省市，给我国畜牧业特别是养猪业造成了巨大的经济损失，目前本病己成为当前我国乃至世界各国猪病研究和防制的重点之一。
[0006]猪瘟病毒(CSFV)是猪瘟的病原，属于黄病毒科瘟病毒属成员。猪瘟是遍布于全世界性范围内的一种高度接触性传染病，早在19世纪初期就有关于猪瘟的报道，世界各国在对该病的防控上做出了巨大的努力，而且在北美、澳洲和北欧的一些地区曾成功地消灭了猪瘟，我国自20世纪20年代发生第I例猪瘟后，由于猪瘟兔化弱毒疫苗的广泛应用，已多年未大面积暴发猪瘟。但近年来，原已宣布消灭了猪瘟的欧洲一些国家又相继复发猪瘟，我国猪瘟的发病率亦呈上升趋势，且流行和发病特点发生了很大变化，呈非典型化态势，临床上主要表现为隐性带毒和慢性感染，成为影响养猪业发展的一大隐患，严重威胁着养猪业的发展。
[0007]猪蓝耳病，又称“猪繁殖与呼吸综合症”(PRRS)是由PRRSV引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸哀竭为主要症状的传染病，该病自20世纪80年代末期开始流行，遍布世界各个养猪国家，造成极大的经济损失。该病在我国普遍存在，且近年来呈流行态势。
[0008]以上5种病原均可不同程度地引起猪繁殖性障碍，并且常常混合感染。仅凭临床症状、病理变化、流行病学调查很难作出准确诊断，尤其是在发病的早期或潜伏期诊断更加困难，而且上述疾病的发生使对其它疾病如猪流行性腹泻的诊断变得复杂和困难。猪流行性腹湾(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹?写病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)引起猪的一种以呕吐、腹湾和脱水为主要特征的肠道传染病。该病以7日龄以内仔猪发病为主，病程短、传播迅速、仔猪死亡率极高，可达100%。1978年，比利时和英国首次报道PEDV疫情，1984年，我国证实该病的存在。在2010-2012年中国不同地区均有PEDV大暴发的报道，造成哺乳仔猪大量死亡，严重影响了我国养猪业的健康发展。因此，建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好、能同时检测多种病原的检测方法和检测试剂盒对猪呼吸和繁殖障碍疾病的诊断和防治具有重要意义。国内外兽医工作者建立了许多用于检测猪病原的方法，其中包括:电子显微镜技术、病毒分离培养试验、动物接种试验、免疫荧光试验、间接免疫荧光试验、各种免疫组织化学酶联免疫吸附试验(ELISA)方法、血清学诊断方法及原位杂交、聚合酶链式反应(Polymerase chain react1n, PCR)分子生物学方法等。对一个病原使用所有的诊断方法是不可行的，不同的病原需要使用最合适的诊断方法。但总的来说，上述这些方法都存在许多明显的不足之处，病毒分离耗时长，荧光抗体检测灵敏度不是很高，ELISA和血清学方法只能检测抗体，不适合早期诊断。实时荧光定量PCR (Real time fluorescent quantitative PCR, Real-time QPCR)技术自诞生之日起，就以其操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等众多优点，而被广泛应用于基础科学研究、药物研发、临床诊断、转基因研究、基因检测等各个领域研究当中，已经成为生命科学领域的一项常规技术。因此，基于多重荧光定量PCR技术建立起特异性强、灵敏度高、重复性好、能检测这6种病原的检测方法和检测试剂盒对猪繁殖障碍和腹泻疾病的诊断和防治具有重要意义。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速，准确性高，灵敏，经济的检测猪细小病毒PPV、猪流行性腹泻病毒PEDV、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV、伪狂犬病病毒PRV、猪瘟病毒CSFV、猪圆环病毒PCV等6种引起猪繁殖障碍或腹泻疾病的病毒的检测试剂盒。
[0010]为了解决上述技术问题，本发明针对各国的养猪业病毒感染的检测问题，提供了相应的检测试剂盒，包括能扩增100-200bp片段的引物，带有不同荧光基团的探针，A和B两个多重荧光TaqMan探针PCR扩增体系反应液，猪细小病毒PPV标准品、猪流行性腹泻病毒PEDV标准品、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV标准品、伪狂犬病病毒PRV标准品、猪瘟病毒CSFV标准品、猪圆环病毒PCV标准品，阴性对照品。
[0011]具体而言，本发明提供了荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒，包括如下2套体系:
[0012]体系A，包括如下3对引物和如下对应的3条探针:
[0013]一、
[0014]上游引物PCV 病毒一PR: 5’ -CAGCACCCTGTAACGTTTGTC-3’
[0015]下游引物PCV 病毒一PR: 5’ -TTAGTCTTCCAATCACGCTTCTG-3，
[0016]特异性PCV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’-HEX-TTTCCCGCTCACGTTCAAAAGTTCAG-BHQ1-3，；
[0017]二、
[0018]上游引物PRV 病毒一PR: 5’ -CACGCCGATGTGGTGGA-3’
[0019]下游引物PRV 病毒一PR: 5’ -GGTACTGGCCCTCGTTGAA-3’
[0020]特异性PRV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5，-ROX-ACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAG-BHQ2-3，；
[0021]三、
[0022]上游引物PPV 病毒一PR: 5’ -GCTTTAGCCTTGGAGCCGT-3’
[0023]下游引物PPV 病毒一PR: 5’ -AAGCAGGCTCTTATGTCGGTT-3’
[0024]特异性PPV 病毒 TaqMan 荧光探针一 P: 5 ’ -FAM-TGGAGCGAGCCAACAACACCAACTT -BHQ1-3，；
[0025]体系B，包括如下3对引物和如下对应的3条探针:
[0026]一、
[0027]上游引物CSFV 病毒一PR: 5’ -GCTCCCTGGGTGGTCTAAG-3’
[0028]下游引物CSFV 病毒一PR: 5’ -CTCGTCCACATAGCATCTCG-3’
[0029]特异性CSFV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5，-FAM-CCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCG-BHQ1-3，；
[0030]二、
[0031]上游引物PRRSV 病毒一PR: 5’ -TCAGCCATAGAAACCTGGAAAT-3’
[0032]下游引物PRRSV 病毒一PR: 5’ -ACGACAAATGCGTGGTTATCA-3’
[0033]特异性PRRSV 病毒 TaqMan 荧光探针一P: 5 ’ -HEX-ACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGC-BHQ1-3，；
[0034]三、
[0035]上游引物PEDV 病毒一PR: 5’ -TGGCATTTCTACTACCTCG-3’
[0036]下游引物PEDV 病毒一PR: 5’ -AGTGGGTTCAGTCTTTGC-3’
[0037]特异性PEDV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -ROX-CGAGTCCTATAACGGAGGTCGGCG -BHQ2-3，。
[0038]作为本发明的荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒的改进:
[0039]试剂盒还包括A和B两个多重突光TaqMan探针PCR扩增体系反应液,猪细小病毒PPV标准品、猪流行性腹泻病毒PEDV标准品、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV标准品、伪狂犬病病毒PRV标准品、猪瘟病毒CSFV标准品、猪圆环病毒PCV标准品、阳性对照品、阴性对照品。
[0040]作为本发明的荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒的进一步改进:
[0041 ] 多重荧光探针PCR扩增体系反应液A含有PCR反应缓冲液，病毒PCV2、PPV、PRV的特异性引物，病毒PCV2、PPV、PRV的TaqMan荧光探针；
[0042]多重荧光探针PCR扩增体系反应液B含有PCR反应缓冲液，病毒CSFV、PRRSV、PEDV的特异性引物，和病毒CSFV、PRRSV, PEDV的TaqMan荧光探针。
[0043]作为本发明的荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒的进一步改进:
[0044]PCV(PCV2)的标准品序列:GAGCACCCTGTAACGTTTGTCAGATTTCCCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAGAAGCGTGATTGGAAGACTAA ；
[0045]PPV 的标准品序列:GCTTTAGCCTTGGAGCCGTGGAGCGAGCCAACAACACCAACTTTCACCAACCTGCACTTAACTCCAACACCGCCAGATTCAGCAATACGGACACCAAGTCCAACTTGGTCAGAAATAGAAACCGACATAAGAGCCTGCTT ；
[0046]PRV 的标准序列:CACGCCGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAGCTGGGGCTGCTCATGGTGGCCCCGGGGCGGTTCAACGAGGGCCAGTACC ；
[0047]CSFV 的标准序列:GCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAG ；
[0048]PRRSV 的标准序列:TCAGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCGTGCCCACCACGTTGAAAGTGCCGCAGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGT ；
[0049]PEDV 的标准序列:TGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACT。
[0050]作为本发明的荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒的进一步改进:所述阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为PCV2、PPV、PRV、PRRSV, CSFV, PEDV的阳性质粒样品。
[0051]阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为PCV2、PPV、PRRSV,CSFV的阳性质粒样品。
[0052]备注说明:阳性对照为PCV2、PPV、PRV、PRRSV, CSFV, PEDV的阳性质粒样品保存于-20度，尽量减少反复冻融。即，本发明的试剂盒，保存于-20度，尽量减少反复冻融。
[0053]本发明还同时提供了上述试剂盒在检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV、PEDV中的应用。
[0054]本发明进一步具体而言:
[0055]I)多重荧光探针PCR扩增体系反应液A含有PCR反应缓冲液、病毒PCV，PPV, PRV的特异性引物、病毒PCV，PPV, PRV的TaqMan荧光探针组成；多重荧光探针PCR扩增体系反应液B含有PCR反应缓冲液、病毒CSFV，PRRSV, PEDV的特异性引物和TaqMan荧光探针组成。
[0056]2) PCR缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、MgCl2, dNTPs和耐热TaqDNA聚合酶。
[0057]3)、多重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性TaqMan突光探针序列，如上所述。
[0058]本发明的检测试剂盒的使用方法:
[0059]每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌双蒸水稀释为I X 12?I X 16Copies/ μ L。
[0060]RNA/DNA病毒样品提取:根据产品使用说明书，用病毒RNA/DNA抽提试剂盒Ezol (TAKARA)从细胞株、新鲜或冷冻的样本提取病毒核酸。
[0061]反转录反应:在无RNase的0.2ml PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA/DNA模板0.5 μ L和1.75 μ L DEPC-H2O, 70°C变性5min，冰上放置3min，加入反转录反应液(即，加入终浓度为IXM-MuLV缓冲液，dNTPs 0.1mM, M-MuLV反转录酶50U，RNase抑制剂10U，随机引物0.5uM)，补水至总体积5μ L。混匀后离心在42°C下反应60min，70°C反应lOmin，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA/DNA模板。
[0062]核酸的检测例如为:取4 μ L已抽提的待测样品核酸cDNA/DNA为模板分别进行A和B多重荧光PCR反应，其中A多重荧光PCR体系1XPCR buffer 5μ L,25mM MgCl25 μ L,2.5mM dNTPl.5μ L,即 PCV、PPV 和 PRV 上下游引物各 2 μ L(浓度均为 10 μ Μ)，PCV、PPV和PRV三种探针各I μ L (浓度均为10 μ Μ)，Taq DNA Polymerase 2U，加ddH20至反应体系总体积为 50 μ L ;B 多重荧光 PCR 体系 10XPCR buffer 5 μ L, 25mM MgCl25 μ L, 2.5mMdNTP1.5 μ L,CSFV,PEDV 和 PRRSV 上下游引物各 2 μ L(浓度均为 10 μ Μ) ,CSFV,PEDV 和 PRRSV 三种探针各I μ L (浓度均为10 μ Μ)，Taq DNA Polymerase 2U，加ddH20至反应体系总体积为50 μ L ;反应参数为:95°C 3min ；95°C 15s，60°C lmin，共 40 个循环。
[0063]多重荧光定量PCR反应体系A (总反应体积50 μ L):cDNA/DNA模板4 μ L ; 10 XPCRbuffer5 μ L, 25mM MgCl25 μ L, dNTP (25mM) 1.5 μ L，Taq DNA Polymerase 2U, PCV2、PPV 和PRV 引物(10 μ M)各 2yL，相应 3 种探针(10mM/L)各 lyL，#Sdd H2O 至 50 μ L。
[0064]反应在ABI7300荧光定量仪上进行，扩增程序为95°C 5min ；40个循环:95°C 30s，56°C 30s, 72°C 31s。
[0065]多重荧光定量PCR反应体系B (总反应体积50 μ L):cDNA/DNA模板4 μ L ; 10 XPCRbuffer5 μ L, 25mM MgCl25 μ L, dNTP (1mM) 1.5 μ L，Taq DNA Polymerase 2U, CSFV、PRRSV和 PEDV 引物(10 μ M)各 2yL，相应 3 种探针(10mM/L)各 lyL，#Sdd H2O 至 50 μ L。
[0066]反应在ABI7300荧光定量仪上进行，扩增程序为95°C 5min ；40个循环:95°C 30s，56°C 30s, 72°C 31s。
[0067]突光定量结果报告:
[0068]I) PCV、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV 和 PRV 的扩增曲线 Ct (threshold cycle，每个反应管内的荧光信号达到所设的阈值时所经历的扩增循环数)均等于40.0，则判为阴性标本。
[0069]2)如果其中PCV、PPV、PRRSV, CSFV, PEDV和PRV相应扩增曲线的Ct值彡35的标本，则检测结果对应于该种病毒为阳性，即待测样品携带相应病毒；
[0070]3) Ct值在35?40区间为灰色区域，重做后大于37，则判为阴性。
[0071]4)如果检测结果为阳性，根据所获得的标准曲线及待测样品CT值，计算待测标本病毒 copies/ μ L。
[0072]采用上述技术方案，本发明的试剂盒的技术进步在于:(1)设计出了能检测猪6种重要病毒的多重实时荧光PCR检测的探针，克服了现有的分子检测方法操作复杂，灵敏度不高，特异性不强，重复性不好等缺点。(2)本发明的多重实时荧光PCR检测方法能通过同时检测猪6种重要病毒病原，并且能够进行大量的样品检测。(3)本发明不仅可以定性检测PCV, PPV, PRV, PRRSV, PEDV和CSFV，还可以通过分析标准曲线来判断各种病毒在样品中的含量。(4)本发明具有很高的灵敏度，可以检测出样本中10个拷贝数的相关病毒。(5)本发明检测快速，特异性强，除了探针，其余试剂均是国内生物公司的普通PCR产品，在提高猪病毒检测技术水平的同时,也大大节约了成本。
[0073]综上所述，本发明具体利用探针荧光定量PCR技术，分2个体系能从临床样品中快速获取并检测出多种引起猪繁殖障碍和腹泻疾病的病毒的应用试剂盒，A体系检测猪圆环病毒 2 型(Porcine circovirus type 2, PCV2)、猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)、伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus, PRV) ;B体系检测猪流行性腹?写病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine productive and respiratorysyndrome virus, PRRSV)、猪痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)。该检测试剂盒设计合理具有方法简单，快速，准确，灵敏度高，适合于口岸检验检疫、畜牧业养殖、动物保护等部门使用，同时具有广泛的科研价值和商业前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0074]图1是试剂盒结构示意图。
[0075]图2a和图2b是两个多重荧光定量PCR体系检测的实例。
[0076]图3?图8分别猪圆环病毒2型、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的灵敏度。
[0077]从左至右分别是16、ΙΟ5、ΙΟ4、103、12、1copies/ μ L。
【具体实施方式】
[0078]下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明，但对本发明的保护范围并不仅限于此。
[0079]实施例1
[0080]参见图1，多重实时荧光定量PCR检测试剂盒，由定量PCR反应液1，猪圆环病毒2型PCV2标准品2、伪狂犬病毒PRV标准品3、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV标准品4、猪瘟病毒CSFV标准品5、猪细小病毒PPV标准品6、猪流行性腹泻病毒PEDV标准品7、阳性对照品8、阴性对照品9、盒体10组成。
[0081]盒体10设有容器孔，分别放置定量PCR反应液1，猪圆环病毒2型PCV2标准品2、伪狂犬病毒PRV标准品3、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV标准品4、猪瘟病毒CSFV标准品5、猪细小病毒PPV标准品6、猪流行性腹泻病毒PEDV标准品7、阳性对照品8、阴性对照品9 ;其中定量PCR反应液A和B单管分装，矩阵排列，荧光定量PCR反应液A含有PCR反应缓冲液(含氯化锰和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，耐热TaqDNA聚合酶等)4管(标记为★)、荧光定量PCR反应A的三种病毒的特异性引物(上下游引物同管装)为4管(标记为?)、相应的三种荧光探针为4管(标记为▲);荧光定量PCR反应液B含有PCR反应缓冲液(含氯化锰和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，耐热TaqDNA聚合酶等)4管(标记为☆)荧光定量PCR反应B的三种病毒的特异性引物(上下游引物同管装)为4管(标记为O )、相应的三种荧光探针为4管(标记为Λ)。
[0082]实施例2
[0083]I试验材料与方法
[0084]1.1毒株猪圆环病毒2型、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒各一株。
[0085]1.2待检样品60份血清和13份粪便样品分别采集自福建、上海、浙江等地的猪场；
[0086]1.3引物与探针
[0087]从美国的NCBI基因库上下载了世界各地的猪圆环病毒2型、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒基因序列。对其进行了同源性比较，在对应病毒基因组的保守基因区设计特异性引物与TaqMan探针，序列如下:
[0088]上游引物PCV 病毒一PR: 5’ -CAGCACCCTGTAACGTTTGTC-3’
[0089]下游引物PCV 病毒一PR: 5，-TTAGTCTTCCAATCACGCTTCTG-3，
[0090]特异性PCV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -HEX-TTTCCCGCTCACGTTCAAAAGTTCAG-BHQ1-3，；
[0091]上游引物PRV 病毒一PR: 5’ -CACGCCGATGTGGTGGA-3’
[0092]下游引物PRV 病毒一PR: 5’ -GGTACTGGCCCTCGTTGAA-3’
[0093]特异性PRV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5，-ROX-ACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAG-BHQ2-3，；
[0094]上游引物PPV 病毒一PR: 5’ -GCTTTAGCCTTGGAGCCGT-3’
[0095]下游引物PPV 病毒一PR: 5’ -AAGCAGGCTCTTATGTCGGTT-3’
[0096]特异性PPV 病毒 TaqMan 荧光探针一P: 5 ’ -FAM-TGGAGCGAGCCAACAACACCAACTT -BHQ1-3，
[0097]上游引物CSFV 病毒一PR: 5’ -GCTCCCTGGGTGGTCTAAG-3’
[0098]下游引物CSFV 病毒一PR: 5’ -CTCGTCCACATAGCATCTCG-3’
[0099]特异性CSFV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5，-FAM-CCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCG-BHQ1-3，；
[0100]上游引物PRRSV 病毒一PR: 5’ -TCAGCCATAGAAACCTGGAAAT-3’
[0101]下游引物PRRSV 病毒一PR: 5’ -ACGACAAATGCGTGGTTATCA-3’
[0102]特异性PRRSV 病毒 TaqMan 荧光探针一P: 5 ’ -HEX-ACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGC-BHQ1-3，；
[0103]上游引物PEDV 病毒一PR: 5’ -TGGCATTTCTACTACCTCG-3’
[0104]下游引物PEDV 病毒一PR: 5’ -AGTGGGTTCAGTCTTTGC-3’
[0105]特异性PEDV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -ROX-CGAGTCCTATAACGGAGGTCGGCG -BHQ2-3，。
[0106]引物和探针委托生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0107]1.4病毒核酸的提取:
[0108]RNA/DNA病毒样品提取:根据产品使用说明书，用病毒RNA/DNA抽提试剂盒Ezol (TAKARA)从细胞株、新鲜或冷冻的样本提取病毒核酸。
[0109]反转录反应:在无RNase的0.2ml PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA/DNA模板0.5 μ L和1.75 μ L DEPC-H2O, 70°C变性5min，冰上放置3min，加入终浓度为IxM-MuLV缓冲液，dNTPs 0.1mM, M-MuLV反转录酶50U，RNase抑制剂10U，随机引物0.5uM，补水至总体积5yL。混匀后离心在42°C下反应60min，70°C反应lOmin，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA/DNA模板。
[0110]1.5荧光PCR反应体系和条件的优化:
[0111]试剂盒:
[0112]多重荧光定量PCR反应体系A (总反应体积50 μ L):cDNA/DNA模板4 μ L ; 10 XPCRbuffer5 μ L, 25mM MgCl25 μ L, dNTP (25mM) 1.5 μ L，Taq DNA Polymerase 2U, PCV2、PPV 和PRV 引物(10 μ M)各 2yL，相应 3 种探针(10mM/L)各 lyL，#Sdd H2O 至 50 μ L。
[0113]同时设一阴性对照。S卩，以高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水替代上述cDNA模板，体积量不变。
[0114]反应在ABI7300荧光定量仪上进行，扩增程序为95°C 5min ；40个循环:95°C 30s，56°C 30s, 72°C 31s。
[0115]多重荧光定量PCR反应体系B (总反应体积50 μ L):cDNA/DNA模板4 μ L ; 10 XPCRbuffer5 μ L, 25mM MgCl25 μ L, dNTP (1mM) 1.5 μ L，Taq DNA Polymerase 2U, CSFV、PRRSV和 PEDV 引物(10 μ M)各 2yL，相应 3 种探针(10mM/L)各 lyL，#Sdd H2O 至 50 μ L。
[0116]同时设一阴性对照。S卩，以高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水替代上述cDNA模板，体积量不变。
[0117]反应在ABI7300荧光定量仪上进行，扩增程序为95°C 5min ；40个循环:95°C 30s，56°C 30s, 72°C 31s。
[0118]结果判断:选择荧光检测模式FAM、HEX、R0X、荧光基线调整取3_15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化实验，以相同浓度阳性核酸为模板反应体系中，引物浓度从0.1?1.00μΜ,探针浓度从0.1?0.50μΜ,采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ARn)选择最佳引物和探针浓度。
[0119]1.6荧光PCR特异性、灵敏度和重复性试验
[0120]选择猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒标准品和采集的猪临床样品，对上述临床样本提取核酸，分别用多重荧光定量PCR A和B进行检测，验证方法的特异性；对已标定拷贝数的猪圆环病毒2型(I X 16Copies/μ L)，伪狂犬病毒(I X 16Copies/μ L)，猪流行性腹泻病毒(I X 16Copies/μ L)，猪细小病毒(I X 16Copies/μ L)，猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒(I X 16Copies/μ L)和猪瘟病毒(I X 16Copies/μ L)分别稀释后，平行进行荧光PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每个浓度的病毒核酸稀释液作3次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。
[0121]2 结果
[0122]2.1
[0123]特异性试验
[0124]本发明建立的多重荧光PCR反应A方法对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、伪狂犬病毒具有较好的特异性，采集的样本也检测出阳性反应。而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒等均无交叉反应。具体如图2a所示，图2中A为猪圆环病毒2型的扩增曲线、B为猪细小病毒的扩增曲线、C为伪狂犬病毒；而猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和阴性对照均无明显扩增曲线。
[0125]多重荧光PCR反应B方法对具有较好的特异性，采集的样本也检测出阳性反应。而与其他病毒如猪圆环病毒2型、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒等均无交叉反应。结果参见图2b，D为猪瘟病毒的扩增曲线、E为猪繁殖与呼吸综合征病毒的扩增曲线、F为猪流行性腹泻病毒。而猪圆环病毒2型、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒和阴性对照均无明显扩增所得曲线。
[0126]2.2灵敏度试验
[0127]分别将猪圆环病毒2型、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒稀释后，用荧光PCR方法进行检测，结果荧光PCR方法检测灵敏度均达到 1copies/μ L (见图 3、4、5、6、7、8)。
[0128]2.3重复性试验
[0129]分别取对猪圆环病毒2型(I X 16Copies/μ L)，猪细小病毒(I X 16Copies/μ L)，伪狂犬病毒(I X 16Copies/μ L)，猪流行性腹泻病毒(I X 16Copies/μ L)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(I X 16COpies/ μ L),猪痕病毒(I X 16Copies/ μ L)稀释混合后按10倍稀释成3个不同的浓度，对每个浓度的样本做3个批内重复和批间重复，结果不同核酸浓度各种的检测变异系数均小于5%，具有较好的重复性。
[0130]2.4临床样本检测
[0131]由采集自浙江、福建、河南、天津、广东等地的60份猪血清和13份粪便样品，提取出核酸，用本发明的荧光PCR方法检测病毒，同时采用常规PCR方法检测作平行试验。普通PCR法检测与荧光定量PCR方法检测结果如下:PCV2普通PCR检测出阳性11份，本发明检测出阳性13份；PPV普通PCR检测出阳性O份，本发明检测出阳性O份；PRV普通PCR检测出阳性I份，本发明检测出阳性I份；PRRSV普通PCR检测出阳性17份，本发明检测出阳性18份；CSFV普通PCR检测出阳性3份，本发明检测出阳性3份；PEDV普通PCR检测出阳性I份，本发明检测出阳性I份；其中CSFV和PRRSV混合感染I份，PRRSV和PCV2混合感染8份。本发明的PCR荧光方法用于样本检测的比常规方法获得阳性率高，且能检测多重感染，操作简单，安全自动化程度高，检测速度快，加上核酸的提取和逆转录，共仅需3-4个小时，优势明显。
[0132]备注说明:采用目前本行业所公认的精确度最高的单重实时荧光定量PCR进行检测，其结果同本发明。
[0133]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒，其特征是包括如下2套体系: 体系A，包括如下3对引物和如下对应的3条探针: 上游引物 PCV 病毒一PR: 5’ -CAGCACCCTGTAACGTTTGTC-3’ 下游引物 PCV 病毒一PR: 5’ -TTAGTCTTCCAATCACGCTTCTG-3’ 特异性 PCV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -HEX-TTTCCCGCTCACGTTCAAAAGTTCAG-BHQ1-3，；
--、
上游弓 I 物 PRV 病毒一PR: 5 ’ -CACGCCGATGTGGTGGA-3， 下游引物 PRV 病毒一PR: 5 ’ -GGTACTGGCCCTCGTTGAA-3， 特异性 PRV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -ROX-ACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAG-BHQ2-3，；
__、 上游引物 PPV 病毒一PR: 5’ -GCTTTAGCCTTGGAGCCGT-3’ 下游引物 PPV 病毒一PR: 5 ’ -AAGCAGGCTCTTATGTCGGTT-3， 特异性 PPV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -FAM-TGGAGCGAGCCAACAACACCAACTT -BHQ1-3，； 体系B，包括如下3对引物和如下对应的3条探针: 上游引物 CSFV 病毒一PR: 5’ -GCTCCCTGGGTGGTCTAAG-3’ 下游引物 CSFV 病毒一PR: 5’ -CTCGTCCACATAGCATCTCG-3’ 特异性 CSFV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -FAM-CCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCG-BHQ1-3，；
--、
上游弓 I 物 PRRSV 病毒一PR: 5 ’ -TCAGCCATAGAAACCTGGAAAT-3 ’ 下游引物 PRRSV 病毒一PR: 5 ’ -ACGACAAATGCGTGGTTATCA-3， 特异性 PRRSV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -HEX-ACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGC-BHQ1-3，；
__、 上游引物 PEDV 病毒一PR: 5’ -TGGCATTTCTACTACCTCG-3’ 下游引物 PEDV 病毒一PR: 5’ -AGTGGGTTCAGTCTTTGC-3’ 特异性 PEDV 病毒 TaqMan 荧光探针一P:5’ -ROX-CGAGTCCTATAACGGAGGTCGGCG -BHQ2-3，。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒，其特征是: 所述试剂盒还包括A和B两个多重荧光TaqMan探针PCR扩增体系反应液，猪细小病毒PPV标准品、猪流行性腹泻病毒PEDV标准品、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV标准品、伪狂犬病病毒PRV标准品、猪瘟病毒CSFV标准品、猪圆环病毒PCV标准品、阳性对照品、阴性对照品。
3.根据权利要求1或2所述的荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒，其特征是: 多重荧光探针PCR扩增体系反应液A含有PCR反应缓冲液，病毒PCV2、PPV、PRV的特异性引物，病毒PCV2、PPV、PRV的TaqMan荧光探针； 多重荧光探针PCR扩增体系反应液B含有PCR反应缓冲液，病毒CSFV、PRRSV, PEDV的特异性引物，和病毒CSFV、PRRSV, PEDV的TaqMan荧光探针。
4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒，其特征是: PCV 的标准品序列:GAGCACCCTGTAACGITTGTCAGAITTCCCCGCGGGCTGGCTGAACITTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAGAAGCGTGATTGGAAGACTAA ； PPV 的标准品序列:GCTTTAGCCTTGGAGCCGTGGAGCGAGCCAACAACACCAACTTTCACCAACCTGCACTTAACTCCAACACCGCCAGATTCAGCAATACGGACACCAAGTCCAACTTGGTCAGAAATAGAAACCGACATAAGAGCCTGCTT ； PRV 的标准序列:CACGCCGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAGCTGGGGCTGCTCATGGTGGCCCCGGGGCGGTTCAACGAGGGCCAGTACC ； CSFV 的标准序列:GCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAG ； PRRSV 的标准序列:TCAGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCGTGCCCACCACGTTGAAAGTGCCGCAGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGT ； PEDV 的标准序列:TGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTo
5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR检测猪主要病毒的试剂盒，其特征是: 所述阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为PCV2、PPV、PRV,PRRSV, CSFV, PEDV的阳性质粒样品。
6.如权利要求1?5任一所述的试剂盒在检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV,CSFV, PEDV中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104263853SQ201410466604
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】姜永厚, 吴海港, 饶品彬 申请人:浙江理工大学