一种g6pd缺乏症基因检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种G6PD缺乏症基因检测试剂盒，包括：①片段扩增引物及其复合扩增体系；②检测G6PD突变SNP位点的探针（分为特异探针和共用探针）；③还包括标签连接反应模板（包括特异外挂结合区和标签探针结合区）、标签探针（可带有不同荧光标记）、连接反应体系。本发明选择G6PD缺乏症的致病基因 g6pd 为检测对象，可直接对受测试者的基因型进行确诊，显著降低女性杂合子的漏诊率，测试准确性超过其他常规测试方法。另外，本发明的最短测试时间仅3小时，是一种高效、准确、操作简便的新型G6PD缺乏症诊断办法。
【专利说明】-种G6PD缺乏症基因检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物体外诊断【技术领域】，具体涉及一种Gero缺乏症基因检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖 _6_ 憐酸脱氧酶（glucose-6-phosphate dehydroge-nase, G6PD)缺乏症 是全球最常见的一种遗传性X连锁不完全显性酶缺乏症。全球约4亿人罹患此病。G6PD 基因位于X染色体，基因长约18Kb，有13个外显子和12个内含子，由515个氨基酸组成。 我国是G6H)缺乏症高发区之一，呈南高北低的分布特点，患病率为0. 2-44. 8%。主要分 布在长江以南各省，以海南、广东、广西、云南、贵州、四川等省为高。迄今全球已发现G6H) 基因突变型126种，在我国发现过其中15种：1376G>T、1388G>A、95A>G、1311C>T、392G>T、 1024C>T、592C>T、1004C>T、493A>G、487G>A、1360C>T、835A>T、1381G>A、1387G>T、871G>A。本 发明选取了其中 7 种高致病型位点（1388G>A、1376G>T、1024C>T、1004C>T、871G>A、95A>G 以 及392G>T)进行检测。
[0003] G6ro缺乏症发病原因是由于G6ro基因突变，导致G6ro酶活性降低，红细胞不能抵 抗氧化损伤而遭受破坏，引起溶血性贫血。其临床表现与一般溶血性贫血大致相同。分新 生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血、非球形细胞溶血性贫血等临床类型。本病临床 表现的轻重程度不同，多数患者，特别是女性杂合子，平时不发病，无自觉症状，部分患者可 表现为慢性溶血性贫血症状。Gero缺乏症同时也是新生儿病理性黄疸的主要原因。据中山 医大的一项统计表明，患G6H)缺乏症的新生儿中，约50%的患儿会出现新生儿黄疸，其中 约12%可发展为核黄疸，导致脑部损害，引起智力低下。
[0004] G6H)基因定位于X染色体长臂2区8带（Xq28)，一旦发生突变，男性患者均表现 为G6H)严重缺乏；女性患者拥有2条X染色体，若两条染色体都有G6H)基因缺陷，也表现 为G6ro严重缺乏；若只有一条染色体G6ro基因缺陷，则临床表现变化很大，G6ro酶的活性 可能从正常到完全缺乏，这将给检测带来极大的难度。
[0005] 多年来，G6ro缺乏症的检测方法在不断更新，目前主要有：四氮唑蓝纸片定性法、 变性珠蛋白小体生成试验、高铁血红蛋白还原试验（MHb-RT)、荧光斑点法（FST)、G6ro活性 测定等检测方法。这些方法操作简便、价格低廉，但是准确性不高，极易产生假阳性或假阴 性，尤其在测试女性杂合子时，很容易发生漏诊。
【发明内容】
[0006] 鉴于目前市面上G6ro缺乏症的检测方法普遍存在准确性低、高成本、操作复杂等 缺点，本发明旨在提供一种准确性高、低成本、操作简便的检测试剂盒，以弥补现有检测方 法容易漏诊女性杂合子的情况，帮助检出Gero缺乏症携带者并对他们进行及时地治疗，为 优生优育、提高国民身体素质做出一份贡献。
[0007] 本发明所采取的技术方案是：
[0008] -种G6H)缺乏症基因检测试剂盒，其含有：用于特异性扩增G6H)基因上7个多态 性位点的引物对、用于检测各多态性位点的探针、标签探针和标签连接反应模板；所述7个 多态性位点为：1388、1376、1024、1004、871、95、392 ;所述用于检测各多态性位点的探针包 括：共用探针、分型识别探针；所述分型识别探针包括野生型特异探针和突变型特异探针。
[0009] G6H)基因上7个多态性位点对应的引物对如下表所示：
[0010]
【权利要求】
1. 一种G6ro缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：用于特异性扩增 基因上7个多态性位点的引物对、用于检测各多态性位点的探针、标签探针和标签连 接反应模板；所述7个多态性位点为：1388、1376、1024、1004、871、95、392 ;所述用于检测各 多态性位点的探针包括：共用探针、分型识别探针；所述分型识别探针包括野生型特异探 针和突变型特异探针。
2. 根据权利要求1所述的G6H)缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，G6H)基因上7个 多态性位点对应的引物对如下表所示：
3. 根据权利要求1所述的G6H)缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述分型探针从 5'至3'端依次为多态性位点特异结合区、长度调整区，所述长度调节区是通过不同的序列 长度来指示不同位点的不同基因型；所述共用探针从5'至3'端依次为外挂区、共用识别 区，所述外挂区的作用是与标签连接反应模板右侧特异性结合。
4. 根据权利要求1所述的G6H)缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述分型探针从 5'至3'端依次为：外挂区、长度调整区、多态性位点特异结合区，所述外挂区的作用是与标 签连接反应模板右侧特异性结合，所述长度调节区是通过不同的序列长度来指示不同位点 的不同基因型；所述共用探针包括靶序列特异接合区。
5. 根据权利要求1或3或4所述的G6H)缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述分 型探针5'端第2-5位可以引入单碱基突变，或者是在探针序列中加入锁核酸（LNA)或肽核 酸（PNA)修饰，以提高连接酶识别的特异性。
6. 根据权利要求1所述的G6H)缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述用于检测各 多态性位点的探针如下表所示：
F代表上游共用探针，W代表野生型特异探针，Μ代表突变型特异探针。
7. 根据权利要求1或3或4或6所述的G6H)缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所 述共用探针和分型识别探针进行5'磷酸化处理。
8. 根据权利要求1所述的G6H)缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述标签连接反 应模板是由两段人工序列组成的寡核苷酸序列，左侧部分作用是与标签探针特异结合，右 侧部分是与共用探针或分型识别探针的外挂序列特异结合；所述标签探针是指用荧光染料 标记的一段寡核苷酸序列，其作用是与标签连接反应模板中的左侧特异结合，所述荧光染 料可以是 FAM、HEX、TAMARA、ROX、Siz 或 vig。
9. 根据权利要求1或8所述的G6H)缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述标签探 针的序列如下所示：AGTGCCAGCAAGATCCAATCTCA ;所述标签连接反应模板序列如下所示：tc caacccttagggaacccTGAGATTGGATCTTGCTGGCACT。
10.根据权利要求1所述的G6ro缺乏症基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还 含有PCR复合扩增体系和连接反应体系。
【文档编号】C12Q1/68GK104293916SQ201410466632
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】郑卫国, 胡琦, 王於建, 杜蔚安, 孟祥和, 郭育林, 葛海鹏, 高静, 王邦超 申请人:广东华美众源生物科技有限公司, 无锡中德美联生物技术有限公司