一种耐热耐碱木聚糖酶及其编码基因和重组载体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐热耐碱木聚糖酶及其编码基因和重组载体，该木聚糖酶选自如下(1)或(2)或(3)：(1)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的全长木聚糖酶taXynA；(2)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的重组木聚糖酶nsXynAΔSLH；(3)将SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有耐热耐碱木聚糖酶活性的由(1)或(2)衍生的蛋白质。本发明所述的木聚糖酶具有良好的木聚糖降解活性，在75℃条件下处理120min，酶活保留90％，在微酸性、中性或碱性环境下有较强的耐受能力。
【专利说明】一种耐热耐碱木聚糖酶及其编码基因和重组载体
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种具有较高最适反应温度、温度稳定性和 碱性耐受能力的木聚糖酶XynA △ SLH，以及该木聚糖酶的编码基因与其在枯草芽孢杆菌中 的高产表达策略。
【背景技术】
[0002] 木质纤维素类生物质是生物质能的一大代表，在地球上有着丰富的含量。纤维素 与半纤维素这两类多聚糖是木质纤维素类生物质的主要成分，是植物光合作用的产物，是 自然界中最为丰富的可再生资源之一。其中，木聚糖是植物细胞中组成半纤维素复合体的 主要成分，广泛分布于植物细胞壁中，是自然界中仅次于纤维素和淀粉之后的含量最丰富 的多聚糖，约占植物碳水化合物总量的三分之一，是一种庞大的、可再生的生物质能。
[0003] 木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖或木单糖的一类酶的总称，而狭义上 的木聚糖酶指的是内切木聚糖酶，是两种主链水解酶之一，在木聚糖降解过程中最主要 的酶，通过内切作用，从木聚糖主链内部作用于木聚糖主链骨架的糖苷链上，随机打断 木聚糖的主链骨架，从而生成低聚木糖以及极少数的木糖单糖，降低了木聚糖的聚合度 (Collins, Gerday et al. 2005)。
[0004] 木聚糖酶可广泛应用于食品、能源、造纸、饲料、医药、纺织等行业。例如，木聚糖 在动物消化道内不能被消化吸收，并且阻碍其他营养成份的消化利用，具有很强的抗营 养特性，从而限制了许多禾谷类饲料在饲料工业和畜牧业生产中的应用，而通过在饲料 中添加木聚糖酶，可以使饲料更容易、更充分地被消化吸收，能有效提高饲料的营养价值 (Collins, Gerday et al. 2005)。
[0005] 工业生产中常常需要在高温或碱性的条件下进行，而一般情况下，蛋白酶在遇到 高温或碱性环境时，往往不稳定，容易失活，这大大限制了许多酶制剂在工业生产中的应 用。因此，耐热耐碱木聚糖酶在工业生产中有着巨大的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种大分子耐热耐碱木聚糖酶木聚糖酶及其编码基因。
[0007] 本发明目的通过以下技术方案实现：
[0008] 一种耐热耐碱木聚糖酶，选自如下（1)或（2)或（3):
[0009] (1)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的全长木聚糖酶taXynA ;
[0010] (2)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的重组木聚糖酶nsXynA ASLH ;
[0011] (3)将SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加且具有耐热耐碱木聚糖酶活性的由（1)或（2)衍生的蛋白 质。
[0012] 其中，序列表中的SEQ ID NO:2由1432个氨基酸组成，分子量约为157. 5kD ;SEQ ID N0:4由1015个氨基酸组成，分子量约为112. 53kD ;
[0013] 为了使⑵中的木聚糖酶便于纯化，在序列表中SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列 组成的蛋白质C端连接上6 X Hi s标签。
[0014] 上述（1) (2)或（3)中的木聚糖酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生 物表达得到。（2)和（3)中的木聚糖酶的编码基因可通过将序列SEQID NO: 1或N0:3中的 DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突 变得到。
[0015] 上述木聚糖酶的编码基因，选自如下（1)或⑵或（3)或（4):
[0016] (1)其核苷酸序列编码权利要求1所述蛋白质分子；
[0017] (2)其核苷酸序列是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3所示的序列；
[0018] (3)其核苷酸序列是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列经一个或几个 核苷酸的取代和/或缺失和/或添加所得的衍生序列；
[0019] (4)与（1)所限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述木聚糖酶的核苷酸序 列。
[0020] 含有上述述编码基因的重组载体：将表达载体PHTHis与权利要求2的基因以限 制性内切酶BamH I和Pst I分别进行双酶切，酶切产物纯化后进行连接，转化至E. coli BL21 (DE3)感受态细胞，通过菌落PCR、测序筛选出阳性克隆；阳性克隆接至含氨苄青霉素 抗性的LB培养基中过夜培养后提取质粒，即得到重组载体。
[0021] 所述表达载体pHTHis的制备：将SEQ ID N0:9的基因片段与质粒pHTOl均用BamH I、Aat II进行双酶切，分别纯化后进行连接，转化至E. coli DH5a感受态细胞，通过菌落 PCR、测序筛选出阳性克隆；再将阳性克隆接至含氨苄青霉素抗性的LB培养基中过夜培养 后提取质粒，即为表达载体pHTHis。
[0022] 所述表达载体pHTHis的克隆/表达区域如图1所示。
[0023] 含有上述述编码基因的重组菌：将所述的重组载体通过化学转化法转至枯草芽孢 杆菌（Bacillus subtilis)中，再以氯霉素 LB平板进行筛选，即获得该木聚糖酶重组菌。
[0024] 本发明涉及的木聚糖酶来源于嗜热厌氧杆菌Thermoanaerobacterium aotearoense SQJT27,有较好的耐热能力。
[0025] 上述木聚糖酶的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0026] 含有上述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、表达盒均属于本发明的保 护范围。
[0027] 实验证明，本发明中的木聚糖酶表达载体有利于大分子量木聚糖酶的高效表达和 纯化，表达的木聚糖酶占菌体总蛋白约15%，纯化效率高达57%，比酶活为248. 8U/mg。该 表达载体具有高表达量、高回收率、高催化活力等特点，有利于木聚糖酶制剂的工业化生 产。
[0028] 本发明的木聚糖酶最适反应温度为80°C，最适反应pH为6. 5 ;在70°C的条件下处 理2小时几乎没有酶活损失，在75°C的条件下处理2小时仍能保留约90%的剩余酶活，在 微酸性、中性和碱性环境下有较强的耐受能力。本发明的木聚糖酶具有耐热耐碱特性，能够 很好地应用于分解半纤维素中的木聚糖酶，生产功能性低聚糖，适合于对温度要求高的很 多非强酸性工业环境，具有在工业生产中推广应用的巨大潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1为pHTHis载体的克隆/表达区域序列。
[0030] 图2为本发明的重组木聚糖酶基因 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。M，DNA分子量标 准；1，重组木聚糖酶基因 nsXynA的PCR产物。
[0031] 图3为本发明的重组木聚糖酶纯化过程收集样品的SDS-PAGE图。M，蛋白质分 子量标准；1，重悬菌液破碎上清（粗酶液）；2,重悬菌液破碎沉淀；3,镍柱纯化穿过液；4， 68mM咪唑缓冲液洗脱的第一个蛋白峰所含蛋白样品；5,68mM咪唑缓冲液洗脱的第二个蛋 白峰所含蛋白样品；6,116mM咪唑缓冲液洗脱的蛋白样品；7, 500mM咪唑缓冲液洗脱的蛋白 样品。
[0032] 图4为本发明的重组木聚糖酶的最适反应pH曲线图。
[0033] 图5为本发明的重组木聚糖酶的最适反应温度曲线图。
[0034] 图6为本发明的重组木聚糖酶的pH稳定性曲线图。
[0035] 图7为本发明的重组木聚糖酶在70、75和80°C下保温不同时间后的剩余酶活力曲 线。
[0036] 图8为本发明的重组木聚糖酶在75-80°C下保温30min的剩余酶活力曲线。
【具体实施方式】
[0037] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，如《分子克隆实验 指南》（第三版）中所述的方法。
[0038] 实施例1
[0039] 枯草芽孢杆菌胞内表达载体pHTHis的构建
[0040] 以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pHTOl (M0BITEC公司）为基础载体，以引物 1彼0 10勵:5)、引物2彼0 10勵:6)，不添加模板，进行？〇?扩增，获得一段58拉的含有 六组氨酸标签编码序列的片段（SEQ ID N0:9)。PCR反应条件为：98°C变性10sec，53°C退 火5sec，72°C延伸5sec。该片段与质粒pHTOl均用BamH I、Aat II进行双酶切，分别纯化 后进行连接，转化至E. coli DH5a感受态细胞，通过菌落PCR、测序筛选出阳性克隆。阳性 克隆接至含氨苄青霉素抗性的LB培养基中过夜培养后提取质粒，作为后续实验的克隆表 达载体pHTHis，其克隆/表达区域序列如图1。
[0041] 引物 1 :5,-TGTACGGATCCGGTGGTTCTCTGCAGCATCA-3,（SEQ ID N0:5)
[0042] 引物 2 :5,-CCGATGACGTCTTAATGATGATGATGATGATGCTGCAGAGAACC AC-3, （SEQ ID NO: 6)
[0043] 实施例2
[0044] 木聚糖酶的编码基因 xynA的克隆
[0045] 该木聚糖酶基因 xynA氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)通过Blast比对，可知该酶是 一个多结构域组成的大分子蛋白酶，C端末尾包含了三个连续的SLH结构域以及一段连接 肽，与锚定在细胞表面相关，对其酶学性质没有显著影响，因此将其去掉以提高该酶的表达 效率，最终确定本发明所用的木聚糖酶氨基酸序列为SEQ ID N0:4,相应的编码基因序列为 SEQ ID NO:3。
[0046] 以嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium aotearoense) SCUT27 的基因组为模 板，以引物3 (SEQ ID NO:7)、引物4 (SEQ ID NO:8)进行PCR扩增该木聚糖酶编码基因 （SEQ ID N0:3)。PCR反应条件为：98°C变性10sec，56°C退火5sec，72°C延伸3min，引物3、引物4 序列及反应体系如下。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
[0047] 引物 3 :5'-CGTTCGGATCCATGGACGATACTAATACAAATCTGG-3'（SEQ IDN0:7)
[0048] 引物 4 :5,-AATACCTGCAGAGAAGGTTTACCTGTAAGCATCA-3,（SEQ IDN0:8)
[0049] PCR扩增获得的木聚糖酶基因片段纯化后与实施例1构建得到的质粒pHTHis 以限制性内切酶BamH I和Pst I分别进行双酶切，酶切产物纯化后进行连接，转化 至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过菌落PCR、测序筛选出阳性克隆。阳性克隆接 至含氨苄青霉素抗性的LB培养基中过夜培养后提取质粒，即为该重组木聚糖酶的表 达载体pHTHis-nsXynAASLH。该载体通过化学转化法转至枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)1012wt(购买自M0BITEC公司）中，以终浓度5yg/mL的氯霉素 LB平板进行筛 选，即可获得该重组木聚糖酶胞内表达菌株B.subtilis 1012wt/pHTHis_nsXynAASLH。枯 草芽孢杆菌感受态细胞制备及转化方法参考Spizizen法（Anagnostopoulos and Spizizen 1961)。
[0050] 实施例3
[0051] 重组木聚糖酶的表达纯化
[0052] (一）重组酶的表达
[0053] 含有重组质粒pHTHis-nsXynA Δ SLH的枯草芽抱杆菌B. subtilis 1012wt过夜培 养菌液IOmL转接到IL LB(含Syg/mL氯霉素）培养基中，37°C 250rpm培养，当培养液OD6tltl 达到约0. 5时，加入IPTG至终浓度0. ImM，诱导培养10h，离心收集细胞，使用溶菌酶和/或 超声波破碎仪破碎细胞，离心收集上清即为粗酶液。SDS-PAGE胶图显示（图3)，本实施例 中重组木聚糖酶表达量约占菌体总蛋白的15%。
[0054] (二）重组酶的纯化
[0055] 采用镍柱亲和层析方法纯化目的蛋白。首先用平衡缓冲液（20mM，pH 7. 5Tris-HCl 缓冲液，〇.511似(：1，2〇1111咪唑）平衡附-阶^(1\5〇11);将上述粗酶液以3111171^11的流速过 平衡好的Ni柱，上样结束后，继续以相同流速，以平衡缓冲液冲至平衡，提高流速至5mL/ min，继续冲至平衡。以不同咪唑浓度出8、116和500mM)的缓冲液进行洗脱并收集相应蛋 白质样品。纯化过程收集的蛋白样品SDS-PAGE结果如图3所示。
[0056] 实验结果表明，通过镍柱亲和层析方法从重组菌B. subtilisl012wt/ pHTHis-nsXynA Λ SLH中纯化得到的木聚糖酶回收率高达57%，IL发酵液最终获得木聚糖 酶纯品19. 2mg。
[0057] 实施例4
[0058] 重组木聚糖酶的酶活测定
[0059] 木聚糖酶可将木聚糖降解为低聚寡糖，可采用DNS法测定催化反应结束后产生的 还原糖量来检测木聚糖酶的酶活力（MILLER 1959)。具体步骤如下：向190 μ L lOOmM、pH 6. 5的Bis-Tris-HCl缓冲液中加入90 μ L I %榉木木聚糖溶液，加入适当稀释过的20 μ L 粗酶液或纯化酶液，80°C反应5min，立即加入200 μ LDNS溶液，沸水浴3min，冰水冷却后离 心，测定540nm下的吸收值，反应整个过程同时以D-木糖作标准。酶活力单位（U)定义为 ： 上述反应条件下，每分钟产生1 μ mol相当于D-木糖的还原糖所需要的酶量为1个酶活力 单位。
[0060] 经测定，以榉木木聚糖为底物实施例3中所得的木聚糖酶比酶活达248. 8U/mg。
[0061] 实施例5
[0062] 重组木聚糖酶的酶学性质检测
[0063] 将上述纯化酶液分别进行下列性质检测。
[0064] 1.最适反应pH的测定
[0065] 纯化酶液分别于不同pH值的缓冲液中进行反应，测定其相对酶活力。检测酶活的 方法除了所用的缓冲体系有所不同外，其余均与实施例3中所述酶活检测方法相同。
[0066] 选择的pH值范围及缓冲体系如下：0. IM乙酸-乙酸钾缓冲液pH 3. 5?6.0,0. IM Bis-Tris-HCl缓冲液pH 6. 0?L 0,0· IM Tris-HCl缓冲液pH 7. 0?9. 0。通过比较不同 pH值下的酶活力差异,可知该酶酶的最适反应pH值。相对酶活的定义为：不同pH值下的 酶活与最大酶活的百分比。结果表明，本发明的重组木聚糖酶的最适反应PH值为6. 5(结 果如图4所示）。
[0067] 2.最适反应温度的测定
[0068] 纯化酶液在最适反应pH值下，于不同温度（即50,55,60,65,70,75,80,85和 90°C )进行酶活力检测，比较其相对酶活可知该酶的最适反应温度。检测测酶活的方法除 了反应温度有所不同外，其余均与实施例3中所述酶活检测方法相同。结果表明，本发明的 重组木聚糖酶的最适反应温度为80°C (结果如图5所示）。
[0069] 3. pH稳定性的测定
[0070] 纯化酶液分别以不同pH值的缓冲液稀释一定倍数，在70°C条件下保存30min，热 处理结束后，测定其相对酶活力。检测酶活的方法与实施例3中所述酶活检测方法相同，在 最适反应PH以及最适反应温度下进行酶活检测。
[0071] 选择的pH值范围及体系如下：0· IM乙酸-乙酸钾缓冲液pH 3. 5?6. 0,0· IM Bis-Tris-HCl缓冲液pH 6. 0?L 0,0· IM Tris-HCl缓冲液pH 7. 0?9. 0。通过比较不同 PH值下保存的酶液的剩余酶活力差异，可知该酶在微酸性、中性以及碱性的条件下较为稳 定（结果如图6所示）。将未经热处理的纯化酶液的酶活记作100%。
[0072] 4.热稳定性的测定
[0073] 纯化酶液分别在不同的温度（70、75、80°C )中保温，于最适反应条件下分别测定 保温不同时间后酶液的剩余酶活。另外，纯化酶液分别在75、76、77、78、79和80°C中保温 30min，分别测定酶液的剩余酶活。其中，将未经热处理的酶液的酶活记作100%，比较纯化 酶液经不同温度，不同保温时间的热处理后的相对酶活。结果表明，该酶在70°C的条件下保 温2h后几乎没有酶活损失，在75°C条件下保温2h仍能保留约90%的剩余酶活，于75、76、 77°C保温30min均几乎没有酶活损失。可见，该重组木聚糖酶具有很好的温度稳定性（结 果见图7和图8所示）。
【权利要求】
1. 一种耐热耐碱木聚糖酶，其特征在于，选自如下⑴或⑵或⑶： (1) 由SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成的全长木聚糖酶； (2) 由SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列组成的重组木聚糖酶； (3) 将SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且具有耐热耐碱木聚糖酶活性的由（1)或（2)衍生的蛋白质。
2. 权利要求1所述木聚糖酶的编码基因，其特征在于， (1)其核苷酸序列编码权利要求1所述蛋白质分子； ⑵其核苷酸序列是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3所示的序列； (3) 其核苷酸序列是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列经一个或几个核苷 酸的取代和/或缺失和/或添加所得的衍生序列； (4) 与（1)所限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述木聚糖酶的核苷酸序列。
3. 含有权利要求2所述编码基因的重组载体。
4. 根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，将表达载体pHTHis与权利要求2的 基因以限制性内切酶BamH I和Pst I分别进行双酶切，酶切产物纯化后进行连接，转化至 E. coli BL21(DE3)感受态细胞，通过菌落PCR、测序筛选出阳性克隆；阳性克隆接至含氨苄 青霉素抗性的LB培养基中过夜培养后提取质粒，即得到重组载体。
5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述表达载体pHTHis的制备：将SEQ ID N0:9的基因片段与质粒pHTOl均用BamH I、Aat II进行双酶切，分别纯化后进行连接， 转化至E. coli DH5ci感受态细胞，通过菌落PCR、测序筛选出阳性克隆；再将阳性克隆接至 含氨苄青霉素抗性的LB培养基中过夜培养后提取质粒，即为表达载体pHTHis。
6. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述表达载体pHTHis的克隆/表达 区域如图1所示。
7. 含有权利要求2所述编码基因的重组菌。
8. 根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，权利要求3?6任一项所述的重组载 体通过化学转化法转至枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)中，再以氯霉素 LB平板进行筛 选，即获得该木聚糖酶重组菌。
9. 含有权利要求2所述编码基因的转基因细胞系。
10. 含有权利要求2所述编码基因的表达盒。
【文档编号】C12N15/75GK104263711SQ201410466572
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】李爽, 黄雄亮, 王菊芳 申请人:华南理工大学