基于可控型dna聚合酶和外切酶活性的dna重组酶的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于蛋白质工程和基因克隆【技术领域】，具体为一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法及其应用。具体步骤如下：(1)构建DNA重组酶的表达载体；(2)改造DNA重组酶的DNA聚合酶和3’外切酶活性；(3)测定DNA重组酶突变体水解双链DNA时生成的5’单链突出端长度，(4)验证制备的DNA重组酶生成5’单链DNA突出端的长度和基因克隆效率。本发明的有益效果在于：其制备的5’单链突出端的长度可控，维持在15-25个核苷酸范围内，使得克隆效率和准确率达到最高，利用中等效率的感受态细胞即可满足克隆要求。制备的DNA重组酶可用于基因克隆、点突变等基因工程领域。
【专利说明】基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备 方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的新型DNA重组酶制备方 法，其可以用于构建重组DNA载体，属于蛋白质工程和基因克隆【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因 克隆技术涉及目标基因 DNA片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目 标基因与质粒两步必不可少的操作。限制性核酸内切酶消化和DNA连接效果较难控制，常 常造成目标基因克隆失败。同时由于限制性核酸内切酶识别位点的多样性，不同目标基因 采用的限制性核酸内切酶不同，使得常规基因克隆的操作通量有限，不能进行高通量基因 克隆。
[0003] 为了克服常规基因克隆方法的缺陷，目前已开发了不依赖于限制性核酸内切酶和 DNA连接酶的克隆技术。这些克隆技术的共同点是：通过酶学或化学手段，使目标基因和线 性载体DNA产生长度不低于12个核苷酸的单链突出端，且目标基因与线性载体的单链突出 端互补配对，重组质粒转入大肠杆菌后，大肠杆菌负责修复目标基因与线性载体间的缺口， 形成含有目标基因的完好重组载体。目前不依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的克隆 方法也存在明显缺点：产生单链突出端的酶学反应处于非可控状态，要么反应过度，要么反 应不充分，结果单链突出端生成效率极低，不高于千分之一，需要转化效率极高的感受态细 胞（高于1〇 8)才能取得较满意的克隆效率。而制备高于1〇8的感受态细胞就是一项困难繁 琐的技术。因此制备酶学反应可控的高效稳定的DNA重组酶，用于基因克隆将大大促进不 依赖于限制性内切酶和连接酶的克隆技术与基因工程技术的发展。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酶学反应可控的新型DNA重组 酶的制备方法及其应用，其制备的DNA重组酶可用于基因克隆和点突变，尤其适用于高通 量基因克隆。
[0005] 本发明提供一种新型DNA重组酶制备方法，该新型DNA重组酶同时具有DNA聚合 酶活性和3'外切酶活性，而且这两种活性经过改造后可以在生成5'单链DNA突出端的过 程中达到一种平衡状态：当5'单链DNA突出端长度短于15个核苷酸时，重组酶表现为3' 外切酶，继续水解3'核苷酸，从而延长5'单链DNA突出端；当5'单链DNA突出端长度长 于25个核苷酸时，重组酶表现为DNA聚合酶，在3'端添加核苷酸，使5'单链DNA突出端回 退到15-25个核苷酸。这种新型DNA重组酶，可以高效的使5'单链DNA突出端长度维持在 15-25个核苷酸左右，从而大大提高5'单链DNA突出端生成效率；使得利用中等效率的感 受态细胞（1〇 4_1〇5)即可轻松的完成基因克隆。
[0006] 本发明提供一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法， 具体步骤如下：
[0007] 第一步，构建DNA重组酶的表达载体。
[0008] 选取同时具有DNA聚合酶和3'外切酶活性的DNA聚合酶作为DNA重组酶原型，利 用常规基因克隆技术将原型重组酶基因克隆到原核表达载体pET28a，在大肠杆菌表达菌株 BL21 (DE3)中表达原型重组酶。镍柱亲和纯化DNA重组酶，测定其DNA聚合酶和3'外切酶 活性，计算3'外切酶活性/DNA聚合酶活性的比值（E/P值）。
[0009] 第二步，改造 DNA重组酶的DNA聚合酶和3'外切酶活性
[0010] 在原型DNA重组酶基础上，利用基因点突变技术改变原型DNA重组酶负责DNA聚 合酶和3'外切酶活性的关键氨基酸残基，制备一系列原型DNA重组酶突变体，调整其E/P 值。利用原核表达系统pET28a/BL21(DE3)pLysS表达原型DNA重组酶突变体。镍柱亲和纯 化原型DNA重组酶突变体，测定计算各突变体E/P值；以原型DNA重组酶E/P值作为参照， 筛选E/P值增高的DNA重组酶突变体。
[0011] 第三步，测定DNA重组酶突变体水解双链DNA生成的5'单链突出端长度
[0012] 由于改变了 DNA重组酶突变体的E/P值，使得其具有如下特性：在低浓度 dNTP (20-50 μ M)存在下能够高效水解双链DNA，但当5'单链DNA长度超过25个核苷酸时， DNA聚合酶活性被有效启动，使得5'单链DNA长度缩短；当5'单链DNA长度短于15个核 苷酸时，DNA聚合酶活性被关闭，3'外切酶活性被有效启动，使得5'单链DNA长度延长。基 于DNA重组酶突变体的这一特性，人工合成长度为80个碱基对的双链DNA作为底物，测定 步骤二中获得的DNA重组酶突变体水解双链DNA的实际效果，筛选生成的5'单链突出端长 度在15-25个核苷酸范围内的DNA重组酶突变体，用于基因克隆。
[0013] 本发明中还进一步提供利用DNA重组酶进行不依赖于限制性核酸内切酶和连接 酶的基因克隆的应用。
[0014] 本发明的有益效果在于：
[0015] (1)制备的单链突出端的长度可控，维持在15-25个核苷酸范围内，使得克隆效率 和准确率达到最高，中等效率的感受态细胞即可满足克隆要求。
[0016] (2)制备的DNA重组酶可用于基因克隆、点突变等基因工程领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为本发明基于可控型聚合酶和外切酶活性的新型DNA重组酶的工作原理图。
[0018] 图2为火球菌DNA重组酶的克隆效率图示。
[0019] 图3为大肠杆菌DNA重组酶的克隆效率图示。
【具体实施方式】
[0020] 以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本 发明的限定。图1为本发明基于可控型聚合酶和外切酶活性的新型DNA重组酶的工作原理 图。
[0021] 实施例1耐热型DNA重组酶的制备
[0022] 首先构建火球菌P. furiosus的耐热型DNA聚合酶的重组表达载体，由于其同时具 有DNA聚合酶和3'外切酶活性，可作为耐热型重组酶原型。在火球菌原型DNA重组酶的基 础上，通过改造其DNA聚合酶和3'外切酶活性，使其DNA聚合酶和3'外切酶活性达到一种 平衡状态，从而使最终的火球菌DNA重组酶能够将双链DNA末端加工成长度为15-25个核 苷酸的5'单链突出端。具体实施步骤如下：
[0023] 第一步，制备火球菌原型DNA重组酶
[0024] 利用原核表达系统表达纯化火球菌重组DNA聚合酶，作为耐热型DNA重组酶原 型。利用原核表达质粒pET28a，在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中表达火球菌原型DNA重 组酶。纯化原型DNA重组酶后，测定其DNA聚合酶活性和3'外切酶活性，活性测定反应体 系为：20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM(NH4)2S04, 10mM KC1，0. lmg/mL BSA，0. 1% (v/v)Triton X-100,2mM MgS04，根据DNA聚合酶和3'外切酶活性的测定值，计算其E/P值为2. 3。
[0025] 第二步，制备火球菌DNA重组酶突变体
[0026] 在火球菌原型DNA重组酶基础上，基因定点突变技术改变原型DNA重组酶负责DNA 聚合酶活性的精氨酸和赖氨酸等关键氨基酸残基、负责3'外切酶活性的天冬氨酸和谷氨酸 等残基，调整其E/P值，共制备了 12个DNA重组酶突变体：M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、 M10、M11、M12。利用原核表达系统pET28a/BL21(DE3)pLysS表达DNA重组酶突变体M1-M12， 镍柱亲和纯化DNA重组酶突变体，测定计算各突变体的E/P值；以火球菌原型DNA重组酶为 参考标准，筛选到E/P值增大的突变体：M2、M3、M5、M8、Mil。
[0027] 第三步，测定火球菌DNA重组酶突变体水解双链DNA生成5'单链DNA突出端的长 度
[0028] 人工合成长度为80个碱基对的双链DNA作为底物，测定步骤二筛选到的DNA重组 酶突变体12、1〇1518111水解双链0嫩生成的5'单链突出端长度。测定反应条件如下 ： 50μΜ dNTP，0. ΙμΜ双链DNA，20ng DNA重组酶，60°C反应5-10分钟。根据测定结果筛选到 了 DNA重组酶M5、M11具有如下特性：能够水解平末端双链DNA，但当5'单链DNA长度超过 25个核苷酸时，DNA重组酶的DNA聚合酶活性被有效启动，使得5'单链DNA长度缩短；当 5'单链DNA长度短于15个核苷酸时，DNA重组酶的DNA聚合酶活性被关闭，而重组酶的3' 外切酶活性被有效启动，使得5'单链DNA延长。其中DNA重组酶M5和Mil生成的5'单链 DNA长度分别为：18和22个核苷酸。因此DNA重组酶M5、M11可以用于基因克隆。
[0029] 第四步，火球菌DNA重组酶基因克隆效率测定。利用火球菌DNA重组酶M5进行不 依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的基因克隆，反应条件为60°C反应0-30分钟。其 中，火球菌DNA重组酶M5的克隆效率见图2。感受态细胞的转化效率为2. 3X 105。纵坐标 表示克隆数，克隆数越多代表克隆效率越高。横坐标为反应时间，在0-5分钟内克隆效率与 反应时间基本成正比例；克隆效率在5分钟后达到最高值，而且随反应时间的延长，克隆效 率并未降低，在30分钟内都很稳定，这是本DNA重组酶的主要优点。
[0030] 实施例2常温型DNA重组酶的制备
[0031] 大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段同时具有DNA聚合酶活性和3'外切酶活 性，又是常温型蛋白，因此可以作为常温型DNA重组酶原型。基于常温型DNA重组酶原型的 大肠杆菌DNA重组酶的制备步骤如下：
[0032] 第一步，制备大肠杆菌原型DNA重组酶
[0033] 利用原核表达系统pET28a/BL21 (DE3)pLysS表达大肠杆菌重组DNA聚合酶I的 Klenow大片段，作为常温型DNA重组酶原型。镍柱亲和纯化常温型大肠杆菌原型DNA重组 酶，测定其DNA聚合酶活性和3'外切酶活性，计算大肠杆菌原型DNA重组酶的E/P值=1. 3。 活性测定体系为：50mM Tris-HCl(pH8. 0)，5mM MgCl2, ImM DTT。
[0034] 第二步，制备大肠杆菌DNA重组酶突变体
[0035] 在步骤一原型DNA重组酶基础上，改变大肠杆菌原型DNA重组酶负责DNA聚合酶 活性的精氨酸和赖氨酸等关键氨基酸残基，以及负责3'外切酶活性的天冬氨酸和谷氨酸等 残基，制备一系列DNA重组酶突变体：M1-M15。利用原核表达系统pET28a/BL21 (DE3)pLysS 表达这些DNA重组酶突变体。镍柱亲和纯化大肠杆菌DNA重组酶突变体，测定M1-M15各个 突变体的DNA聚合酶活性和3'外切酶活性，并计算各突变体的E/P值。以大肠杆菌原型 DNA重组酶的E/P值为参照，筛选到E/P值增高的突变体M3、M6、M7、M10、M12、M13。
[0036] 第三步，测定大肠杆菌DNA重组酶突变体水解双链DNA生成5 '单链DNA突出端的 长度
[0037] 人工合成长度为80个碱基对的双链DNA作为底物，测定步骤二筛选到的DNA重组 酶突变体M3、M6、M7、M10、M12、M13水解双链DNA生成的5'单链突出端长度。测定反应条 件如下：50μΜ dNTP，0. ΙμΜ双链DNA，20ng DNA重组酶，60°C反应5-10分钟。根据测定结 果筛选到了 DNA重组酶M3、M10具有如下特性：能够水解平末端双链DNA，且当5'单链DNA 长度超过25个核苷酸时，DNA重组酶的DNA聚合酶活性被有效启动，使得5'单链DNA长度 缩短；当5'单链DNA长度短于15个核苷酸时，DNA重组酶的DNA聚合酶活性被关闭，而DNA 重组酶的3'外切酶活性被有效启动，又使得5'单链DNA长度延长。大肠杆菌原型DNA重 组酶突变体M3和M10水解双链DNA生成的5'单链DNA长度分别为16和21个核苷酸，可 以满足不依赖于DNA连接酶和限制性核酸内切酶的基因克隆的要求。
[0038] 第四步，大肠杆菌DNA重组酶基因克隆效率测定
[0039] 利用大肠杆菌DNA重组酶M10进行基因克隆，反应条件为37度反应0-30分钟。大 肠杆菌DNA重组酶的克隆效率见图3。感受态细胞的转化效率为1.4X10 5。纵坐标表示克 隆数，克隆数越多代表克隆效率越高。横坐标为反应时间，在0-5分钟内克隆效率与反应时 间基本成正比例；克隆效率在5分钟后达到最高值，而且随反应时间的延长，克隆效率在30 分钟内都很稳定，并未降低，这是本专利技术制备的DNA重组酶的主要优点。
【权利要求】
1. 一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法，其特征在于，具 体步骤如下： (1) 构建DNA重组酶的表达载体 选取同时具有DNA聚合酶和3'外切酶活性的DNA聚合酶作为DNA重组酶原型，利用原 核表达系统pET28a/BL21 (DE3) pLysS表达原型重组酶，镍柱亲和纯化得到DNA重组酶，测定 其DNA聚合酶和3'外切酶活性，计算原型DNA重组酶的3'外切酶活性和DNA聚合酶活性 的比值，即E/P值，作为改善型DNA重组酶的筛选参数； (2) 改造 DNA重组酶的DNA聚合酶和3'外切酶活性 在原型DNA重组酶基础上，利用基因点突变技术改变原型DNA重组酶负责DNA聚合酶 和3'外切酶活性的氨基酸残基，调整DNA重组酶的E/P值，设计制备一系列DNA重组酶突 变体；利用原核表达系统pET28a/BL21 (DE3)pLysS重组表达、镍柱亲和纯化得到一系列DNA 重组酶突变体，测定突变体的DNA聚合酶和3'外切酶活性、计算各突变体的E/P值，以原型 DNA重组酶为参照物，筛选E/P值增高的一系列DNA重组酶突变体； (3) 测定DNA重组酶突变体水解双链DNA产生的5'单链DNA长度 人工合成长度为80个碱基对的双链DNA，以其作为底物，测定DNA重组酶突变体水解双 链DNA的效果，筛选生成的5'单链突出端长度在15-25个核苷酸范围内的DNA重组酶突变 体为用于基因克隆的DNA重组酶。
2. 根据权利要求1所述制备方法得到的DNA重组酶于基因克隆技术中的应用。
【文档编号】C12N9/12GK104195161SQ201410466583
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】刘喜朋, 杜飞 申请人:刘喜朋, 杜飞