铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法及应用，其方法为：将铁皮石斛粉加入缓冲溶液,硫酸氨沉淀,透析冷冻干燥，得蛋白质粉末；再溶解,配成铁皮石斛蛋白液,分别加入3种蛋白酶，即碱性蛋白酶Alcalase2.4L、碱性蛋白酶37017和胰蛋白酶,酶解,得三种酶解液；进行凝胶色谱柱层析，水洗脱，收集得到9个多肽组分，即铁皮石斛抗肿瘤多肽。所得产品A3对肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞SGC-7901和乳腺癌细胞MCF-7的半抑制浓度IC50分别为：169.62μg/mL、155.20μg/mL、107.53μg/mL。本发明得到的铁皮石斛多肽有利于功能食品和医药领域的开发利用。
【专利说明】铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 铁皮石斛（Dendrobium officinale)为多年生草本植物，又名黑节草，其干燥莖经 过加工可制成枫斗，历代医著如《道藏》、《神农本草经》、《本草纲目拾遗》等对其均有记载， 被誉为中华九大仙草之首。2012年版的《中华人民共和国药典》中记载铁皮石斛具有益胃 生津、滋阴清热的功效，可用于骨蒸劳热，胃阴不足，阴虚火旺，口干烦渴等症状。近年来，分 离技术和生物技术快速发展，研究人员得以对铁皮石斛的化学成分和生物活性进行详尽研 究，发现铁皮石斛成分多样，并拥有多种生物活性，不仅可以益胃生津，增强机体免疫力，还 具有抗肿瘤、降血糖的作用。
[0003] 生物活性肽（Bioactive peptide)是由20个天然氨基酸构成的小到两个氨基酸 大到数百个氨基酸的并具有特殊生物功能的多肽类化合物。肽虽然是由氨基酸组成的，但 是具有许多单个氨基酸所不具备的功能。生物活性肽可以通过水解蛋白质得到，其生物活 性也在水解过程中被释放出来。随着研究的深入，生物活性肽的多种生物活性已经被大量 的研究证实，常被提及活性的有降血糖活性、抑菌活性、抗癌活性、抗病毒活性、免疫调节活 性等。可以预测，在不久的将来生物活性肽将成为人类筛选药物的天然资源宝库。
[0004] 近些年来，具有抗肿瘤活性的天然多肽和人工合成多肽受到广泛的关注。抗肿瘤 活性肽分子量小、穿透能力强、免疫原性低，且易于合成。目前，多种抗肿瘤多肽类药物已上 市或进入临床研究，多肽类药物不仅活性高、毒副作用小，还可以增加肿瘤细胞对其它治疗 方法的敏感度。因此抗癌活性肽的研究对于肿瘤的临床治疗有重要价值。目前国内外对铁 皮石斛抗肿瘤多肽的分尚纯化与应用尚未有报道。
【发明内容】
[0005] 为拓展铁皮石斛在食品和生物医学领域的应用，大幅提高其附加值，本发明的目 的是提供铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法及应用。
[0006] 为实现本发明目的，采用如下技术方案： 铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，所述制备方法为： (1) 将铁皮石斛粉加入缓冲溶液PBS中浸泡提取蛋白，硫酸氨沉淀，透析冷冻干燥， 得到蛋白质粉末； (2) 取步骤（1)所得蛋白质粉末溶解于蒸馏水，配成铁皮石斛蛋白液，分别加入3种 蛋白酶，即碱性蛋白酶Alcalase 2. 4L、碱性蛋白酶37017和胰蛋白酶，在控制条件下进行 酶解，得到三种酶解液； (3) 取步骤（2)得到的三种酶解液，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶S印hadex G-25柱层 析，水洗脱，在检测波长280nm下收集得到9个多肽组分，即铁皮石斛抗肿瘤多肽。
[0007] 上述方法中，具体步骤如下： (1) 称取20-200 g铁皮石斛粉末，用液氮研磨后加入1-4 L的PBS浸泡12-36 h，再用纱 布过滤掉残渣得到铁皮石斛的PBS提取液；在PBS提取液中加入硫酸铵至饱和度10%-90%， 过夜，在转速为5000-10000 r/min条件下离心后除去上清液，得到蛋白浸膏，用PBS溶解 蛋白浸膏后装入截留分子量范围5000-10000的透析袋，透析三天，然后冻干得到蛋白质粉 末； (2) 称取l-5g蛋白粉末，蒸馏水配成质量百分比浓度为1-10%的铁皮石斛蛋白液，分 别加入碱性蛋白酶Alcalase 2. 4L、碱性蛋白酶37017和胰蛋白酶进行水解，碱性蛋白酶 Alcalase 2. 4L的酶解条件为：酶在铁皮石斛蛋白液中的浓度（E/S)为2-10%，温度30-60 °C，pH =6-9,反应时间为6-12 h ;胰蛋白酶的酶解条件为：酶在铁皮石斛蛋白液中的浓度 (E/S)为2-12%，温度25-55 °C，pH =6-10,反应时间为6-12 h ;碱性蛋白酶37017的酶解 条件为：酶在铁皮石斛蛋白液中的浓度（E/S)为2-12%，温度20-65 °C，pH=7-10,反应时间 为6-13 h;该过程中实时用0. 05-0. 5 mol/L的NaOH和HCL来调节反应体系的pH值，控 制pH值在ρΗ±0. 05之内，水解后，在90-100 °C的水浴中灭酶10-30 min，冷却到室温后在 5000-10000 r/min下离心5-30 min后取上清液，得到三种酶解液； (3) 对步骤（2)得到的三种酶解液进行凝胶色谱葡聚糖凝胶S印hadex G-25分离纯化， 具体条件为：柱体积为80-200 mL，上样量为l-5mL，其中含200-600 mg酶解多肽干粉，流动 相为水，流速为0.5 mL/min，每6 min收集一管，总共收集100管，检测波长为215 nm和280 nm ;碱性蛋白酶Alcalase 2. 4L酶解产物在检测波长280nm下收集到3个峰Al，A2和A3; 胰蛋白酶酶解产物在检测波长280nm下收集到3个峰Yl，Y2和Y3;碱性蛋白酶37017酶 解产物在检测波长280nm下收集到3个峰S1，S2和S3.这样，三种酶解产物经S印hedax G-25柱层析后共得到9个多肽组分，即铁皮石斛抗肿瘤多肽。
[0008] 3、根据权利要求1-2所述的铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，所述 铁皮石斛抗肿瘤多肽组分的具体有多肽质量含量为：A1为39. 6%，A2为47. 2%，A3为99. 2%， Y1 为 33. 7%，Y2 为 54. 0%，Y3 为 58. 2%，S1 为 33. 8%，S2 为 40. 6%，S3 为 86. 4%。
[0009] 上述方法中，所述铁皮石斛抗肿瘤多肽组分中A3含有10个肽，MALDI-T0F-T0F 质谱分析鉴定其中3个肽的序列分别为：RHPFDGPLLPP⑶，KPEEVGGAGDRWTC和 RCGVNAFLPKSYLVHFGWKLLFHFD. 上述方法中，所述铁皮石斛抗肿瘤多肽组分具有抗肿瘤活性；所述组分A3对肝癌细胞 Η印G-2、胃癌细胞SGC-7901和乳腺癌细胞MCF-7的半抑制浓度IC50分别为：169. 62 Pg/ mL、155.20 M<g/mL、107.53 Mg/mL。
[0010] 所述铁皮石斛抗肿瘤多肽可应用于功能食品或抗肿瘤医药的制备。
[0011] 与现有技术相比，本发明具有如下技术效果和优点： 本发明得到的铁皮石斛9个多肽组分，具有多肽含量为：A1为39. 6%，A2为47. 2%，A3 为 99. 2%，Y1 为 33. 7%，Y2 为 54. 0%，Y3 为 58. 2%，S1 为 33. 8%，S2 为 40. 6%，S3 为 86. 4%。 MALDI-T0F-T0F质谱分析表明，A3中含有10个肽，其中，3个肽的序列分别鉴定为： RHPFDGPLLPP⑶，KPEEVGGAGDRWTC 和 RCGVNAFLPKSYLVHFGWKLLFHFD.更重要的是，经抗肿 瘤活性（MTT法）检测，所述9个组分对胃癌细胞SGC-7901增殖都具有抑制作用，特别， A3对肝癌细胞Η印G-2和乳腺癌细胞MCF-7还有抑制作用。A3对肝癌细胞Η印G-2、胃癌细 胞SGC-7901和乳腺癌细胞MCF-7的半抑制浓度IC50分别为：169. 62 Pg/mL、155. 20 Pg/ mL、107.53 Pg/mL。因而本发明得到的铁皮石斛多肽有利于功能食品和医药领域的开发利 用。
[0012]
【专利附图】
【附图说明】 图1为实施例1中碱性蛋白酶Alcalase 2.4L酶解产物的凝胶色谱葡聚糖凝胶 SephadexG-25柱层析洗脱曲线； 图2为实施例1中胰蛋白酶酶解产物的凝胶色谱葡聚糖凝胶SephadexG-25柱层析洗 脱曲线； 图3为实施例1中碱性蛋白酶37017酶解产物的凝胶色谱葡聚糖凝胶S印hadexG-25 柱层析洗脱曲线； 图4为实施例1所制备的铁皮石斛9个多肽组分对胃癌细胞SGC-7901的抑制效果图。
[0013] 图5为实施例1所制备的铁皮石斛多肽A3的一级质谱图。
[0014] 图6为实施例1所制备的铁皮石斛多肽A3中荷质比m/z = 1417. 840的二级质谱 图。
[0015] 图7为实施例1所制备的铁皮石斛多肽A3中荷质比m/z = 1504. 81的二级质谱 图。
[0016] 图8为实施例1所制备的铁皮石斛多肽A3中荷质比m/z = 2994. 743的二级质谱 图。
【具体实施方式】
[0017] 以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护 范围不限于此。
[0018] 实施例1 铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下： (1) 称取100 g铁皮石斛粉末，用液氮研磨后加入4 L的PBS浸泡20 h，再用纱布过滤 掉残渣得到铁皮石斛的PBS提取液。在PBS提取液中加入70%的硫酸铵，过夜，离心（7000 r/min)后除去上清液，得到蛋白浸膏。用PBS溶解蛋白浸膏后装入截留分子量范围6000的 透析袋，透析三天，然后冻干得到蛋白质粉末； (2) 称取2g蛋白粉末，蒸馏水配成质量百分比浓度为3%的铁皮石斛蛋白液，分别 加入喊性蛋白酶Alcalase 2. 4L (Novozymes)、喊性蛋白酶37017 (Novozymes)和膜蛋白酶 (BioBasic Unit)进行水解，碱性蛋白酶Alcalase 2. 4L的酶解条件为：酶与底物浓度比 (E/S)为3%，温度45 °C，pH =7,反应时间为8 h。胰蛋白酶的酶解条件为：酶与底物浓度 比（E/S)为6%，温度35 °C，pH =8,反应时间为10 h。碱性蛋白酶37017的酶解条件为： 酶与底物浓度比（E/S)为8%，温度50 °C，pH=9,反应时间为12 h。实验过程中实时用0.08 mol/L的NaOH和HCL来调节反应体系的pH值，控制pH值在ρΗ±0. 05之内。水解后，在95 -C的水浴中灭酶15 min,冷却到室温后在9000 r/min下离心15 min后取上清液，得到三种 酶解液。
[0019] (3)步骤（2)得到的三种酶解液，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶S印hadex G-25分离 纯化，具体条件为：柱体积为100 mL，上样量为3mL(含400 mg酶解多肽干粉），流动相为水， 流速为〇· 5 mL/min，每6 min收集一管，总共收集100管，检测波长为215 nm和280 nm。 碱性蛋白酶Alcalase 2. 4L酶解产物在检测波长280nm下收集到3个峰Al，A2和A3 (图 1);胰蛋白酶酶解产物在检测波长280nm下收集到3个峰Yl，Y2和Y3 (图2);碱性蛋白 酶37017酶解产物在检测波长280nm下收集到3个峰S1，S2和S3 (图3).这样，三种酶 解产物经S印hedax G-25柱层析后共得到9个多肽组分Al、A2、A3、Yl、Y2、Y3、SI、S2、S3， 多肽含量依次为 39. 6%、47· 2%、99· 2%、33· 7%、54· 0%、58· 2%、33· 8%、40· 6%、86· 4%。MTT 法检 测这九个组分对胃癌细胞SGC-7901增长都有抑制作用（图4).特别，多肽A3对肝癌细 胞Η印G-2、胃癌细胞SGC-7901和乳腺癌细胞MCF-7都有一定的抑制作用（表1)，半抑制浓 度 IC50 分别为：169. 62 Pg/mL、155. 20 Pg/mL、107. 53 Pg/mL. MALDI-TOF-TOF-MS 质谱分 析表明，A3中主要含有10个多肽（图5)，其中荷质比为1417. 840、1504. 81和2994. 743 的三个肽共占 61. 5%.进一步的二级质谱（图6-8)鉴定这3个肽的氨基酸序列分别为： RHPFDGPLLPP⑶，KPEEVGGAGDRWTC 和 RCGVNAFLPKSYLVHFGWKLLFHFD. 表1多肽A3对三种癌细胞的抑制效果（土 s，n= 5) (%)
【权利要求】
1. 铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法为： (1) 将铁皮石斛粉加入缓冲溶液PBS中浸泡提取蛋白，硫酸氨沉淀，透析冷冻干燥， 得到蛋白质粉末； (2) 取步骤（1)所得蛋白质粉末溶解于蒸馏水，配成铁皮石斛蛋白液，分别加入3种 蛋白酶，即碱性蛋白酶Alcalase 2. 4L、碱性蛋白酶37017和胰蛋白酶，在控制条件下进行 酶解，得到三种酶解液； (3) 取步骤（2)得到的三种酶解液，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶S印hadex G-25柱层 析，水洗脱，在检测波长280nm下收集得到9个多肽组分，即铁皮石斛抗肿瘤多肽。
2. 根据权利要求1所述铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，具体步骤如下： (1) 称取20-200 g铁皮石斛粉末，用液氮研磨后加入1-4 L的PBS浸泡12-36 h，再用纱 布过滤掉残渣得到铁皮石斛的PBS提取液；在PBS提取液中加入硫酸铵至饱和度10%-90%， 过夜，在转速为5000-10000 r/min条件下离心后除去上清液，得到蛋白浸膏，用PBS溶解 蛋白浸膏后装入截留分子量范围5000-10000的透析袋，透析三天，然后冻干得到蛋白质粉 末； (2) 称取l-5g蛋白粉末，蒸馏水配成质量百分比浓度为1-10%的铁皮石斛蛋白液，分 别加入碱性蛋白酶Alcalase 2. 4L、碱性蛋白酶37017和胰蛋白酶进行水解，碱性蛋白酶 Alcalase 2. 4L的酶解条件为：酶在铁皮石斛蛋白液中的浓度（E/S)为2-10%，温度30-60 °C，pH =6-9,反应时间为6-12 h;胰蛋白酶的酶解条件为：酶在铁皮石斛蛋白液中的浓度 (E/S)为2-12%，温度25-55 °C，pH =6-10,反应时间为6-12 h ;碱性蛋白酶37017的酶解 条件为：酶在铁皮石斛蛋白液中的浓度（E/S)为2-12%，温度20-65 °C，pH=7-10,反应时间 为6-13 h;该过程中实时用0. 05-0. 5 mol/L的NaOH和HCL来调节反应体系的pH值，控 制pH值在ρΗ±0. 05之内，水解后，在90-100 °C的水浴中灭酶10-30 min，冷却到室温后在 5000-10000 r/min下离心5-30 min后取上清液，得到三种酶解液； (3) 对步骤（2)得到的三种酶解液进行凝胶色谱葡聚糖凝胶S印hadex G-25分离纯化， 具体条件为：柱体积为80-200 mL，上样量为l-5mL，其中含200-600 mg酶解多肽干粉，流动 相为水，流速为0.5 mL/min，每6 min收集一管，总共收集100管，检测波长为215 nm和280 nm ;碱性蛋白酶Alcalase 2. 4L酶解产物在检测波长280nm下收集到3个峰Al，A2和A3; 胰蛋白酶酶解产物在检测波长280nm下收集到3个峰Yl，Y2和Y3;碱性蛋白酶37017酶 解产物在检测波长280nm下收集到3个峰S1，S2和S3.这样，三种酶解产物经S印hedax G-25柱层析后共得到9个多肽组分，即铁皮石斛抗肿瘤多肽。
3. 根据权利要求1-2所述的铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，所述铁皮 石斛抗肿瘤多肽组分的具体有多肽质量含量为：A1为39. 6%，A2为47. 2%，A3为99. 2%，Y1 为 33. 7%，Y2 为 54. 0%，Y3 为 58. 2%，S1 为 33. 8%，S2 为 40. 6%，S3 为 86. 4%。
4. 根据权利要求1-2所述的铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，所述铁皮 石斛抗肿瘤多肽组分中A3含有10个肽，MALDI-T0F-T0F质谱分析鉴定其中3个肽的序列 分别为：RHPFDGPLLPP⑶，KPEEVGGAGDRWTC 和 RCGVNAFLPKSYLVHFGWKLLFHFD。
5. 根据权利要求1-2所述的铁皮石斛抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，所述铁皮 石斛抗肿瘤多肽组分具有抗肿瘤活性；所述组分A3对肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞SGC-7901 和乳腺癌细胞此?-7的半抑制浓度比50分别为 ：169.62 48/1^、155.20 48/1^、107.53 48/ mL〇
6.权利要求1-5任一一项所述的制备方法制备得到的铁皮石斛抗肿瘤多肽应用于功 能食品或抗肿瘤医药的制备。
【文档编号】C12P21/06GK104232718SQ201410466768
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】张学武, 郑秋平 申请人:华南理工大学