响应面优化法在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开黑豆粉、一氧化氮供体硝普钠和氯化钙在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用，旨在提高深层发酵灵芝酸产量和灵芝酸生产率。硝普钠和氯化钙作为诱导剂在灵芝深层发酵液培养3?5天时加入以诱导灵芝深层发酵灵芝酸的合成，本发明采用一氧化氮供体硝普钠晶体和氯化钙溶于水配制成硝普钠水溶液和氯化钙水溶液作为灵芝深层发酵灵芝酸的诱导剂，行使其促进次生代谢物灵芝酸合成的功能；黑豆粉能够有效促进灵芝细胞的生长。研究结果表明，与比较例相比，采用本发明在灵芝发酵液中加入适量的黑豆粉、硝普钠和氯化钙可有效提高灵芝酸产量240?250%，提高灵芝酸生产率2.8?3.4倍。
【专利说明】响应面优化法在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种采用响应面优化灵芝深层发酵技术，具体涉及黑豆粉、一氧化氮 供体硝普钠（SNP)和氯化钙（CaCl2)在灵芝深层发酵次生代谢产物灵芝酸中的应用，通过促 进灵芝细胞生长和诱导灵芝酸合成而提高深层发酵灵芝酸产量和灵芝酸生产率。
【背景技术】
[0002] 灵芝/wcit/a? (Fr. ) Krast (Polyporaceae)]隶属于非裙菌目（无 裙菌目，如灵芝科(fefloofe/maiaceae·)灵芝属（fefloofe/ma)，素有"仙草"、 "灵丹妙药"之称，是一种食药兼用的高等真菌。在中国和亚洲其他国家有2000千年的应用 历史。我国第一部药物专著《神农本草经》把灵芝列为上品，谓灵芝"主耳聋，利关节，保神 益精，坚筋骨，好颜色，久服轻身不老延年"。现代生物学已证明灵芝子实体和菌丝体中含有 多糖类、核苷类、氨基酸类、三萜类、呋喃类、生物碱类、油脂类、留醇类、有机锗、无机离子等 活性物质。灵芝酸是存在于灵芝子实体、菌丝体、孢子粉的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗衰 老、抗氧化作用，抑制组胺释放、血管紧张素转化酶活性等广泛的药理作用，具有很高的药 用价值。因此，如何利用现代生物学技术提高灵芝酸产量一直是微生物学和发酵工业的重 要研究领域，是国内外学者研究和关注的热点，对医药业与农业的发展具有不可估量的价 值。
[0003] 目前，灵芝酸主要从灵芝子实体中提取。人工栽培灵芝子实体生产周期长，且生长 条件和产品质量不易控制。采用深层发酵培养的方法来获得灵芝酸，具有生产周期短、质量 易控、主要组分和野生灵芝基本一致，且发酵菌丝体中的灵芝酸含量也高于子实体等特点。 可见，深层发酵是获取灵芝酸的一种有效途径。然而，产量偏低的问题仍是限制灵芝深层 液体发酵规模化生产的一个瓶颈。大量的研究文献和发明专利表明，采用二阶段培养或在 培养基中添加一定浓度的茉莉酸、一氧化氮、苯巴比妥、乙酸和阿司匹林等信号分子和植物 激素均可诱导灵芝酸合成。然而，二阶段培养发酵周期长（20d以上)，整体效率不高；其他 大部分的研究仅仅报道了灵芝酸含量的提高（CN: 103392510 A; CN: 102816824 A; CN: 102174415 A)，并未涉及灵芝酸产量及生产率，且部分诱导剂不同程度地抑制灵芝菌丝生 长，这使得最终产量的提高程度仍不能满足工业生产的需要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供黑豆粉、一氧化氮供体硝普钠和氯化钙在灵芝深层发酵次 生代谢产物灵芝酸中的应用，采用响应面优化的方法对加入灵芝基础液体培养基中的外源 物质黑豆粉、硝普钠和氯化钙的浓度进行优化来提高灵芝酸产量和灵芝酸生产率。利用 Design Expert软件设计正交实验，并通过响应面分析法对实验结果进行分析，得出最佳因 子组合方案。
[0005] 根据灵芝菌种的发酵特点和生理代谢特性，经过广泛筛选和系统的条件试验，发 现采用黑豆粉、一氧化氮（NO)供体硝普钠（SNP)和氯化钙配制一定浓度的水溶液经过滤除 菌后，在灵芝细胞生长的一定阶段加至深层发酵液，可以提高灵芝酸产量和灵芝酸生产率。
[0006] 黑豆粉、一氧化氮供体硝普钠和氯化钙在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用，其特征 在于：黑豆粉可以促进灵芝细胞的生长，一氧化氮供体硝普钠、氯化钙作为诱导剂能够诱导 灵芝深层发酵灵芝酸的合成，从而高效地提高灵芝酸产量和灵芝酸生产率。
[0007] 黑豆粉、一氧化氮供体硝普钠和氯化钙在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用具体做法 是，配制基础液体培养基，并分成17组，依据Design Expert软件设计得出各组组分药品添 加的浓度方案，把黑豆磨成粉、烘干，称取适量加入到基础培养基中，灭菌、冷却。选取菌丝 体生长良好的种子液，在无菌室超净工作台上先用高速分散器将菌丝体打碎，然后按接种 量5%分别加入到培养基中，于恒温摇床28°C、150r/min条件下培养3d后，无菌操作加入 lOOmmol/L硝普钠母液、lmol/L氯化钙母液于培养液中，使终浓度达到表1中各组对应的浓 度，继续于恒温摇床28°C、150r/min条件下培养4?6d后，收获含灵芝酸的发酵产物。
[0008] 本发明优选技术方案是，发酵液中加入占发酵液体积0. 2%的浓度为50mmol/L硝 普钠水溶液、占发酵液体积1%的浓度为lmol/L氯化钙水溶液和占发酵液体积1. 256%的黑 豆粉。
[0009] 本发明的原理是一氧化氮诱导深层发酵培养的灵芝细胞氧化迸发，促进过氧化氢 等活性氧的产生，并通过氯化钙中的钙离子激活钙调蛋白信号转导途径诱导灵芝合成次生 代谢物相关基因的表达。研究结果表明，与比较例相比，采用本发明在灵芝发酵液中加入适 量的黑豆粉、硝普钠和氯化钙可有效提高灵芝酸产量240?250%，提高灵芝酸生产率2. 8? 3. 4 倍。
【具体实施方式】
[0010] 黑豆粉、氯化钙和硝普钠在提高深层发酵灵芝酸产量中的应用，具体方法如下： 1)将黑豆用粉碎机磨成粉，烘干；配制浓度为50mmol/L的硝普钠（Na2 [Fe (CN) 5N0]) 水溶液；配制浓度为lmol/L的氯化I丐水溶液。2)取冰箱保存的灵芝 (Fr.) Krast (Polyporaceae)]母种菌丝接入新鲜的马铃薯综合固体培养基斜面上，置 于28°C培养箱培养7d，将菌丝接入马铃薯综合液体培养基，于恒温摇床25?30°C，100? 160rpm条件下培养2?5d，用分散器将菌丝球打碎即为灵芝种子液。
[0011] 实施例一：取灵芝种子液按5%接种量分别接入液体培养基中（葡萄糖20g/L，蛋白 胨10g/L，KH2P04lg/L，MgSO4 0· 5g/L，黑豆粉若干，详见表1)，于恒温摇床中在28°C，150r/ min条件下培养3d，无菌操作加入50mmol/L硝普钠溶液、lmol/L氯化興溶液于培养液中，使 终浓度达到表1中各组对应的浓度，继续于恒温摇床28°C、150r/min条件下培养4d。收获 含灵芝酸的发酵液。发酵液5000rpm离心10min，沉淀在-45°C真空冷冻干燥36h得灵芝菌 丝体总干重。称取灵芝菌丝体〇.l〇〇g，溶解于IOmL无水乙醇中，超声波破壁3 h后，提取 液用IOOOOrpm离心IOmin,取上清液0· 2mL于IOmL具塞试管中，依次加入5%香草醒-冰 醋酸0. 5mL和高氯酸0. 8mL，60°C水浴20min，然后冰水冷却3min，加入2. 80mL冰醋酸，混 匀于548 nm测定吸光值，测定灵芝酸含量。并通过以下公式计算灵芝酸产量：G=SXH/ (PXV)(G :灵芝酸产量，mg/L ;S :样品灵芝酸含量/mg ;H :菌丝体总干重/g ;V :发酵液体积 /L ;P:样品干重/g)结果见表1。通过Design-Expert 6. 0.5软件对模型回归方程进行分 析，得到的优化结果为：在硝普钠浓度为〇. lmmol/L、黑豆粉浓度为12. 56g/L、氯化钙浓度 为lOmmol/L时，灵芝酸的产量最高为662. 38mg/L。对优化得到的预测结果进行试验验证， 试验结果为654. 21 mg/L，灵芝酸生产率为93.46 mg/L/d。与比较例相比，灵芝酸产量提高 241. 7%，灵芝酸生产率提高3. 39倍。
[0012] 实施例二：取灵芝种子液按5%接种量分别接入液体培养基中（葡萄糖20g/L，蛋白 胨10g/L，KH 2P04lg/L，MgSO4 0· 5g/L，黑豆粉若干，详见表2)，于恒温摇床中在28°C，150r/ min条件下培养3d，无菌操作同时加入50mmol/L硝普钠溶液、lmol/L氯化興溶液于培养液 中，使终浓度达到方案中各组对应的浓度，继续于恒温摇床中在28°C，150r/min条件下培 养5d。收获含灵芝酸的发酵液。发酵液5000rpm离心lOmin，沉淀在-45°C真空冷冻干燥 36h得灵芝菌丝体总干重。称取灵芝菌丝体0. 100g，溶解于IOmL无水乙醇中，超声波破壁 3 h后，提取液用IOOOOrpm离心IOmin,取上清液0· 2mL于IOmL具塞试管中，依次加入5% 香草醛-冰醋酸0. 5mL和高氯酸0. 8mL，60°C水浴20min，然后冰水冷却3min，加入2. 80mL 冰醋酸，混匀于548 nm测定吸光值，测定灵芝酸含量。并通过以下公式计算灵芝酸产量： G=SXH/ (PXV) (G :灵芝酸产量，mg/L ;S :样品灵芝酸含量/mg ;H :菌丝体总干重/g ;V :发 酵液体积/L ;P:样品干重/g)检测结果见表2。通过Design-Expert 6. 0.5软件对模型回 归方程进行分析，得到的优化结果为：在硝普钠浓度为〇. lmmol/L、黑豆浓度为11. 71g/L、 氯化钙浓度为lOmmol/L时，灵芝酸的产量最高为671. 26mg/L，灵芝酸生产率为74. 58 mg/ L/d。对优化得到的预测结果进行试验验证，试验结果为灵芝酸产量658. 75 mg/L，灵芝酸 生产率为82. 34 mg/L/d。与比较例相比，灵芝酸产量提高244. 1%，灵芝酸生产率提高2. 87 倍。
[0013] 比较例一：取灵芝种子液按5%接种量分别接入液体培养基中（葡萄糖20g/L，蛋白 胨 10g/L，KH2P04lg/L，MgSO4 (λ 5g/L)，于恒温摇床中在 28°C，150r/min 条件下培养 9d。收 获含灵芝酸的发酵液。发酵液5000rpm离心10min，沉淀在-45°C真空冷冻干燥36h得灵芝 菌丝体总干重。称取灵芝菌丝体〇.l〇〇g，溶解于IOmL无水乙醇中，超声波破壁3 h，提取液 用IOOOOrpm离心IOmin,取上清液0· 2mL于IOmL具塞试管中，依次加入5%香草醒-冰醋 酸0. 5mL和高氯酸0. 8mL，60°C水浴20min，然后冰水冷却3min，加入2. 80mL冰醋酸，混匀于 548 nm测定吸光值，测定灵芝酸含量。并通过以下公式计算灵芝酸产量：G=SXH/ (PXV) (G :灵芝酸产量，mg/L ;S :样品灵芝酸含量/mg ;H :菌丝体总干重/g ;V :发酵液体积/L ;P : 样品干重/g)。灵芝酸产量为191. 42 mg/L。灵芝酸生产率为21. 27mg/L/d。
[0014] 比较例二：取灵芝种子液按5%接种量分别接入液体培养基中（葡萄糖20g/L，蛋白 胨 10g/L，KH2P04lg/L，MgSO4 (λ 5g/L)，于恒温摇床中在 28°C，150r/min 条件下培养 7d。收 获含灵芝酸的发酵产物(发酵液)。发酵液5000rpm离心10min，沉淀在-45°C真空冷冻干 燥36h得灵芝菌丝体总干重。称取灵芝菌丝体0. 100g，溶解于IOmL无水乙醇中，超声波破 壁3 h，提取液用IOOOOrpm离心IOmin,取上清液0· 2mL于IOmL具塞试管中，依次加入5% 香草醛-冰醋酸0. 5mL和高氯酸0. 8mL，60°C水浴20min，然后冰水冷却3min，加入2. 80mL 冰醋酸，混匀于548 nm测定吸光值，测定灵芝酸含量。并通过以下公式计算灵芝酸产量： G=SXH/ (PXV) (G :灵芝酸产量，mg/L ;S :样品灵芝酸含量/mg ;H :菌丝体总干重/g ;V :发 酵液体积/L ;P :样品干重/g)。灵芝酸产量为148. 31mg/L。灵芝酸生产率为21. 19mg/L/d。
[0015] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；任 何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方 法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实 施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做 的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
[0016] 表1 响应面分析方案及灵芝酸产量
【权利要求】
1. 黑豆粉、一氧化氮供体硝普钠和氯化钙在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用，其特征在 于：硝普钠和氯化钙作为诱导剂诱导灵芝深层发酵灵芝酸的合成以提高灵芝酸含量，黑豆 粉显著促进灵芝细胞的生长以提高灵芝菌丝体质量，从而提高灵芝酸产量和灵芝酸生产 率。
2. 根据权利要求1所述黑豆粉、一氧化氮供体硝普钠和氯化钙在灵芝深层发酵灵芝 酸中的应用，其特征在于：黑豆粉、硝普钠和氯化钙作为诱导剂诱导灵芝深层发酵灵芝酸的 具体做法是，在灵芝深层发酵基础液体培养基中加入黑豆粉，与发酵液的体积比为〇. 5? 1. 5%，培养3?5天时，向发酵液中加入浓度为50mmol/L硝普钠水溶液和lmol/L氯化钙 水溶液，硝普钠水溶液与发酵液的体积比为〇. 2?2%，氯化钙水溶液与发酵液的体积比为 0. 1?1%，继续培养4?8天后，收获含灵芝酸的发酵产物。
3. 根据权利要求2所述黑豆粉、一氧化氮供体硝普钠和氯化钙在灵芝深层发酵灵芝酸 中的应用，其特征在于：所述黑豆粉与发酵液的体积比为1. 256%，硝普钠水溶液与发酵液 的体积比为0. 2%，氯化钙水溶液与发酵液的体积比为1%。
【文档编号】C12R1/645GK104212867SQ201410470539
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】王松华, 吴世良, 何庆元, 李正鹏, 张晓红, 孙玉军, 祝嫦巍, 何华奇, 蒋圣娟, 鲍锐 申请人:安徽科技学院