一个与普通菜豆抗炭疽病基因位点紧密连锁的分子标记及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一个与普通菜豆抗炭疽病基因位点紧密连锁的分子标记及其检测方法。该分子标记由SEQ ID No.1所示和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成。结果表明：采用此分子标记对待测普通菜豆的基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增产物的大小可以有效检测出待测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病。该方法将会加速抗炭疽病新品种的选育进程，提高抗病育种效率、減少农药防治炭疽病造成的环境污染，同时节约种植成本，具有明显的经济效益、生态效益。
【专利说明】-个与普通菜豆抗炭疸病基因位点紧密连锁的分子标记及 其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一个与普通菜豆抗炭疽病基因位点紧密连锁 的分子标记及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 普通菜豆（Phaseolus vulgaris L.)是全世界重要的食用豆类之一，含有丰富的 蛋白质、淀粉、矿物质和多种维生素等。普通菜豆作为我国主要的杂粮作物，种植区域广泛， 但是在生产上经常受到菜豆炭疽病的危害，炭疽病病原菌通过种子进而侵染植株整个地上 部分，危害菜豆的叶片、茎、荚等，在冷凉潮湿的环境下尤为严重，减产30%?90%，流行年 份植株萎蔫枯死，严重影响着普通菜豆的品质和产量。迄今为止，已经定位到20个炭疽病 基因或QTL，但是缺乏有效应用于抗病育种的分子标记。因此，发掘抗病资源、开发抗病标记 和克隆抗病基因对于提高菜豆的产量具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是提供一种用于检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的引物对。
[0004] 本发明提供的用于检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的引物对由SEQ ID No. 1所示 和SEQ ID No. 2所示的DNA分子组成。
[0005] 上述所述的引物对在检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的应用也是 本发明的保护范围。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的 试剂盒。
[0007] 本发明提供的试剂盒包含上述所述的引物对。
[0008] 上述所述的试剂盒在检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的应用也是 本发明的保护范围。
[0009] 本发明最后一个目的是提供一种检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的 方法。
[0010] 上述所述的检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的方法包括如下步骤：
[0011] (1)提取待测普通菜豆的基因组DNA ;
[0012] (2)以所述基因组DNA为模板，采用SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA 分子为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；若扩增产物大小为273bp，则待检测的普通 菜豆为抗炭疽病；若扩增产物大小为406bp，则表明待测的普通菜豆为感炭疽病。
[0013] 上述方法中，所述抗炭疽病为病情指数小于等于60,所述感炭疽病为病情指数大 于60。
[0014] 上述方法中，所述病情指数按照现有技术常规方法得到，具体可按如下方法得 到：
[0015] DI =Σ (CiXNi)/9N，其中DI为病情指数；Ci为单株发病级别；Ni为各级别植株 数；N为总株数。单株发病级别分为6级：0级，全株无症状表现；1级，叶片上有针尖大小病 斑；3级，叶片上病斑面积小于10% ;5级，叶片上病斑面积小于25% ;7级，叶片上病斑面积 50% ;9级，叶片萎蔫枯死。
[0016] 根据病情指数将普通菜豆对炭疽病的抗性划分为5个等级：高抗（HR)(病情指数 彡2. 0);抗（R) (2. 0〈病情指数彡15. 0)冲抗（MR) (15. 0〈病情指数彡60. 0);感（S) (60. 0〈 病情指数彡80. 0);高感（HS)(病情指数>80. 0)。
[0017] 上述所述的方法在检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的应用也属于 本发明的保护范围。
[0018] 本发明提供了一个与普通菜豆抗炭疽病基因位点紧密连锁的分子标记及其检测 方法。结果表明：采用分子标记SNP+In/Del/Pr 〇7对待测普通菜豆的基因组DNA进行PCR扩 增，根据扩增产物的大小可以有效检测出待测普通菜豆的抗感炭疽病品种。该方法将会加 速抗炭疽病新品种的选育进程，提高抗病育种效率、減少农药防治炭疽病造成的环境污染， 同时节约种植成本，具有明显的经济效益、生态效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为SNP+In/Del/Pr〇7标记引物对两个亲本红芸豆和京豆扩增产物测序后的序 列比对结果。
[0020] 图 2 为 SNP+In/Del/Pro7 标记在杂交组合 R)0002322XR)0005600 的 F2 分离群体 中的扩增。
[0021] 图3为SNP+In/Del/Pro7标记在普通菜豆10份抗病材料和8份感病材料中的扩 增。
【具体实施方式】
[0022] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0023] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0024] 实施例1、分子标记SNP+In/Del/Pro7的获得
[0025] 1、供试材料
[0026] 普通菜豆高抗炭疽病种质红芸豆，统一编号：F00002322 ;感炭疽病种质京豆， 统一编号：F00000777 ;以及其杂交F2:3群体。以上材料均来源于中国农业科学院作物 科学研究所，在文献"Mingli Chen，Jing Wu，Lanf eng Wang, Xiaoyan Zhang, Matthew ff.Blair, Jizeng Jia, Shumin Wang. Development of mapped simple sequence repeat markers from common bean (Phaseolus vulgaris L. ) based on genome sequences of a Chinese landrace and diversity evaluation. Molecular breeding 201433:489-496"中 公开过。
[0027] 2、普通菜豆对炭疽病抗性鉴定
[0028] 对亲本R)0002322、R)0000777及1，092个F2:3家系（每个F 2:3家系取30粒种子） 植株播种后，待植株三出复叶完全展开时，采用高压喷雾接种法对整株进行苗期接种鉴定。 于人工气候室温度20?22°C，湿度95?100%条件下培养，7天后调查发病情况。
[0029] 利用F2:3家系抗病表型推测F2群体的基因型。每个F 2:3家系的30个单株表现全 部抗病，对应F2单株基因型与母本一致；30个单株表现全部感病，对应F 2单株基因型与父 本一致；30个单株表现抗、感分离，对应F2单株基因型为杂合型。
[0030] 3、SSR标记与抗病基因的连锁分析
[0031] 根据初步的定位结果，参照普通菜豆基因组序列（http://www. phytozome. net/ search, php)，利用Primer Premier 5.0软件在候选区段共开发了 282对SSR分子标记。分 别以抗、感病亲本及分离群体中的抗、感池 DNA为模板，筛选282对SSR分子标记发现，其中 32对标记在抗、感病亲本及分离群体中的抗、感池 DNA中同时表现多态性。
[0032] 利用32对多态性引物对群体进行遗传作图分析，利用软件Mapmarker 3. 0中 Kosambi法计算位点间的距离，分析位于SSR标记与F2群体单株基因型间遗传连锁关 系；MapDrawV2. 1软件进行连锁图谱绘制。结果显示：标记PSSR0771和PSSR0869与基因 Co-2322紧密连锁，标记之间的位置PSSR0771-C〇-2322-PSSR0869,遗传距离分别为0. 2cM 和 0. 4cM。
[0033] 4、筛选与抗炭疽病基因共分离的分子标记
[0034] 进一步将标记PSSR0771和PSSR0869序列搜索普通菜豆全基因组序列数据库 (http ://www. phytozome. net/search, php)，显示两个标记之间的序列长度为 76, 622bp，依 据76, 622bp的序列设计特异性标记在抗、感亲本中进行序列扩增，基于序列差异开发了 3 个In/Del标记Clp-Nl、TFUPlcl用于精细定位（表1)。
[0035] 表1、In/Del分子标记序列
[0036]
【权利要求】
1. 一种用于检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的引物对； 所述引物对由SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA分子组成。
2. 权利要求1所述的引物对在检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的应用。
3. -种检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的试剂盒，该试剂盒包含权利要求 1所述的引物对。
4. 权利要求3所述的试剂盒在检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的应用。
5. -种检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病的方法，包括如下步骤： (1)提取待测普通菜豆的基因组DNA ; ⑵以所述基因组DNA为模板，采用SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA分子 为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；若扩增产物大小为273bp，则待检测的普通菜豆 为抗炭疽病品种；若扩增产物大小为406bp，则表明待测的普通菜豆为感炭疽病品种。
6. 权利要求5所述的方法在检测或辅助检测普通菜豆是否抗菜豆炭疽病中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104313143SQ201410549437
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】王述民, 陈明丽, 武晶, 王兰芬, 朱振东 申请人:中国农业科学院作物科学研究所