犬新孢子虫的分离方法和体外培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种犬新孢子虫的分离方法和体外培养方法。为实现上述目的，本发明的犬新孢子虫的分离方法通过这样的技术方案实现：取一定体积浓度为10kU/ml的青霉素和10mg/ml的链霉素的双抗，应用一次性注射器无菌采集犬新孢子虫感染的动物脑组织，该犬新孢子虫感染的动物脑组织体积为该双抗体积的两倍，将该双抗加入到采集的该犬新孢子虫感染的动物脑组织；采用不同规格的一次性注射器按照针头直径缩小的顺序反复吸吹。本发明具有简便、快捷、省时、增殖时间短、实用性强等优点。
【专利说明】犬新孢子虫的分离方法和体外培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种犬新孢子虫的分离方法和体外培养方法。
【背景技术】
[0002]犬新孢子虫(Neospora caninum)为专性细胞内寄生原虫，隶属于原生动物门(Protozoa)、顶复亚门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoa)、新孢子虫亚纲(Neosporidia)、新孢子虫属(Neospora)。1988年,Dubey等人首次从一只下肢瘫痪的犬体内分离到该虫体，并且将其命名为犬新孢子虫。犬新孢子虫的终末宿主是犬，牛、羊、猪、马、兔等多种哺乳动物都可以作为中间宿主，它的寄生部位是中枢神经系统、脑、肝、肌肉及其它内脏组织。新孢子虫病(Neosporiasis)是由犬新孢子虫寄生于犬、牛、羊等多种哺乳动物细胞内而引起的一种原虫病，该病主要引起母畜流产、死胎或新生儿运动障碍和神经系统疾病，给畜牧业带来巨大的经济损失。国内对犬新孢子虫的研究尚属起步阶段，尚缺少自主知识产权的犬新孢子虫体分离、体外增殖等技术方法。
[0003]原有方法(Yamane et al.1997)中报道的犬新孢子虫的分离方法，通过以下步骤实现:无菌采集新鲜死亡的胎儿脑组织，称量10克放入研钵中，加入胰蛋白酶使终浓度为0.5%，37°C孵育20min，添加适量液氮迅速研磨，得到匀浆液经细胞滤器过滤后离心，并悬浮于添加抗生素等双抗的无菌PBS中，最后将含有虫体的混悬液接种于含有10%胎牛血清培养基的单层Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)上，每24h更换培养液，直至观察到犬新孢子虫速殖子。这一分离方法繁琐复杂，极易污染，研磨组织飞溅的液氮容易伤害操作人员，胰蛋白酶也会影响组织中分离的虫体和培养细胞的生长发育，分离效率较低，失败率高。
[0004]体外培养犬新孢子虫常用细胞为Vero细胞系等传代细胞,原有方法(Davison etal.1999)中报道的体外培养犬新孢子虫的方法，以Ve1传代细胞系培养犬新孢子虫速殖子为例，将复苏的Ve1细胞接种到含8%犊牛血清的DMEM培养液中，当Vero细胞长成单层后接种14个左右虫体，每隔12小时更换培养液，应用倒置显微镜观察犬新孢子虫速殖子增殖情况，接种4-5日后虫体增殖达到高峰期。Vero细胞的传代培养程序繁琐，而且犬新孢子虫在Vero细胞系中培养生长和增殖缓慢，尤其冻存虫体复苏、接种Vero细胞其复苏和增殖时间较长，极大限制了急需虫体试验的研究进展。
[0005]专利“一种新的犬新孢子虫速殖子的体外培养和染色方法”采用MCF-7乳腺细胞为宿主细胞，采用RPM-1640培养基进行培养，采用倒置显微镜观察胞外新孢子虫速殖子的数目，从第2天开始缓慢增长，第3天开始迅速增长，在第4天达到高峰。该方法依旧存在增殖时间长的问题。
[0006]目前，尚没有应用原代人胚肾细胞-293细胞体外增殖培养犬新孢子虫的报道。
【发明内容】
[0007]本发明是鉴于现有技术中存在的上述问题而做出的，本发明的目的在于提供一种简便、快捷、实用性强的犬新孢子虫的分离方法。
[0008]为实现上述目的，本发明的犬新孢子虫的分离方法通过这样的技术方案实现:取一定体积浓度为10kU/ml的青霉素和10mg/ml的链霉素的双抗,应用一次性注射器无菌采集犬新孢子虫感染的动物脑组织，该犬新孢子虫感染的动物脑组织体积为该双抗体积的两倍以上,将该双抗加入到采集的该犬新孢子虫感染的动物脑组织；
[0009]采用不同规格的一次性注射器按照针头直径缩小的顺序反复吸吹。
[0010]本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述吸吹步骤中，反复吸吹至少10次以上。
[0011]本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述一次性注射器，针头直径的大小不小于27G。
[0012]本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述一次性注射器，选自12G针头、20G针头、27G针头中任意一种以上的针头。
[0013]本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，还包括:将经过处理的所述犬新孢子虫感染动物脑组织接种到对数生长期的Vero细胞中培养。
[0014]本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述培养采用DMEM完全培养液。
[0015]本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述培养液含有I %双抗和8%犊牛血清。
[0016]本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述培养液每隔24小时更换一次。
[0017]为了实现上述的另一目的，本发明的犬新孢子虫的体外培养方法通过这样的技术方案实现:采用含8%犊牛血清的DMEM培养液培养原代人胚肾细胞-293细胞；当原代人胚肾细胞-293细胞长成单层细胞后，向每瓶原代人胚肾细胞-293细胞中接种13个通过本发明分离得到的犬新孢子虫速殖子(或犬新孢子虫其他分离株)，每隔12小时更换培养液；以及采用倒置显微镜观察犬新孢子虫速殖子增殖情况，培养36小时即可观察到虫体增殖达到高峰期，培养48小时后90%以上原代人胚肾细胞-293细胞涨破崩解，培养液中几乎全部为犬新孢子虫速殖子。
[0018]本发明的犬新孢子虫的体外培养方法的技术方案，接种到原代人胚肾细胞-293细胞中虫体的数量仅为接种到Vero细胞中的虫体的数量的1/10，培养36小时虫体即可达到高峰期，培养48小时虫体即可达到最高值，仅为采用Ve1细胞所用增殖时间的1/2。另外Vero细胞是贴壁性强的细胞系，传代培养需要胰蛋白酶消化等步骤，操作繁琐复杂；而原代人胚肾细胞-293细胞贴壁性弱，传代培养时采用移液器枪头吹打即可脱壁，不需要胰蛋白酶消化等复杂步骤，因此，采用原代人胚肾细胞-293培养犬新孢子虫速殖子具有省时省力、简便、快捷、实用性强等优点。
[0019]有益效果:
[0020]本发明的犬新孢子虫的分离和体外培养方法具有简便、快捷、省时、增殖时间短、实用性强等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]为更清楚地说明本发明的【具体实施方式】，下面对【具体实施方式】部分的描述中使用到的附图作简单说明。
[0022]附图标记说明如下:
[0023]图1为本发明的第一实施例分离得到的犬新孢子虫的显微图；
[0024]图2为本发明的第二实施例分离得到的犬新孢子虫的显微图；
[0025]图3为本发明的第三实施例中采用的原代人胚肾细胞-293细胞的显微图；
[0026]图4为本发明的第三实施例中培养36h时犬新孢子虫速殖子的显微图；
[0027]图5为本发明的第三实施例中培养48h时犬新孢子虫速殖子的显微图。
【具体实施方式】
[0028]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面，结合附图对本发明的具体的实施方式进行详细描述。
[0029]第一实施例
[0030]取1.5mL离心管一支，向其中加入体积浓度为10kU/ml青霉素和10mg/ml链霉素的双抗0.5mL。应用消毒的剪刀、镊子、骨锯、手术刀等工具剪除犬新孢子虫感染的濒死期或死亡时间为6小时内的犊牛脑部皮肤，无菌条件下撬开脑壳，采用12G针头的一次性注射器无菌采集脑组织lmL，加入到该1.5mL离心管，反复吸吹10次左右，然后采用20G针头的一次性注射器和27G针头的一次性注射器分别依次反复吸吹各10次。将经过处理的犬新孢子虫感染的牛源脑组织全部接种到对数生长期的Ve1细胞中培养，培养液为含1%双抗和8%犊牛血清的DMEM(Hyclone公司产品)，每隔24小时更换一次培养液。
[0031]采用倒置显微镜观察，直到观察到犬新孢子虫。收集含犬新孢子虫分离株的Vero细胞，2000r/min离心5分钟，取沉淀物过27G针头，去掉牛源脑组织和Vero细胞，过滤液以10000r/min离心5分钟,沉淀即为分离的犬新孢子虫,如图1所示。
[0032]第二实施例
[0033]取1.5mL离心管一支，向其中加入体积浓度为10kU/ml青霉素和10mg/ml链霉素的双抗0.5mL。应用消毒的剪刀、镊子、手术刀等工具剪除犬新孢子虫感染的濒死期或死亡时间为6小时内的鼠(沙鼠、Balb/c鼠、小白鼠)脑部皮肤，无菌条件下撬开脑壳，采用12G针头的一次性注射器无菌采集脑组织lmL，加入到该1.5mL离心管，反复吸吹10次以上，然后采用20G针头的一次性注射器和27G针头的一次性注射器分别依次反复吸吹各10次。将经过处理的犬新孢子虫感染的鼠源脑组织全部接种到对数生长期的Ve1细胞中培养，培养液为含1%双抗和8%犊牛血清的DMEM(Hyclone公司产品)，每隔24小时更换一次培养液。
[0034]采用倒置显微镜观察，直到观察到犬新孢子虫。收集含犬新孢子虫分离株的Vero细胞，2000r/min离心5分钟，取沉淀物过27G针头，去掉牛源脑组织和Vero细胞，过滤液以10000r/min离心5分钟,沉淀即为分离的犬新孢子虫,如图2所示。
[0035]第三实施例
[0036]采用DMEM培养液(Hyclone公司产品，含I %双抗和8%犊牛血清)于37°C CO2培养箱中培养如图3所示的原代人胚肾细胞-293细胞。当原代人胚肾细胞-293细胞长成单层细胞后，向每瓶原代人胚肾细胞-293细胞中接种13个第一实施例得到的犬新孢子虫速殖子，每隔12h更换一次培养液。采用倒置显微镜观察犬新孢子虫速殖子增殖情况。如图4所示，培养36小时即可观察到虫体增殖达到高峰期。如图5所示，培养48h后90%以上原代人胚肾细胞-293细胞涨破崩解，培养液中几乎全部为犬新孢子虫速殖子。
[0037]本发明的犬新孢子虫的分离和体外培养方法具有简便、快捷、省时、增殖时间短、实用性强等优点。
[0038]以如上所述的实施例仅用于具体说明本发明的精神，本发明的保护范围并不局限于此，对于本【技术领域】的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过变更、置换或变型的方式轻易做出其它的实施方式，这些其它的实施方式都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，包括以下步骤: 取一定体积浓度为10kU/ml的青霉素和10mg/ml的链霉素的双抗,应用一次性注射器无菌采集犬新孢子虫感染的动物脑组织，该犬新孢子虫感染的动物脑组织体积为该双抗体积的两倍以上，将该双抗加入到采集的该犬新孢子虫感染的动物脑组织； 采用不同规格的一次性注射器按照针头直径缩小的顺序反复吸吹。
2.根据权利要求1所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述吸吹步骤中，反复吸吹至少10次以上。
3.根据权利要求1所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述一次性注射器，针头直径的大小不小于27G。
4.根据权利要求1所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述一次性注射器，选自12G针头、20G针头、27G针头中任意一种以上的针头。
5.根据权利要求1所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，还包括:将经过处理的所述犬新孢子虫感染动物脑组织接种到对数生长期的Vero细胞中培养。
6.根据权利要求5所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述培养采用DMEM完全培养液。
7.根据权利要求6所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述培养液含有I%双抗和8%犊牛血清。
8.根据权利要求6或7中所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述培养液每隔24小时更换一次。
9.一种犬新孢子虫的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤: 采用含8%犊牛血清的DMEM培养液培养原代人胚肾细胞-293细胞； 当原代人胚肾细胞-293细胞长成单层细胞后，向每瓶原代人胚肾细胞-293细胞中接种13个根据权利要求1-8中任意一项所述的分离方法得到的犬新孢子虫速殖子，每隔12小时更换培养液；以及 采用倒置显微镜观察犬新孢子虫速殖子增殖情况。
【文档编号】C12N1/10GK104312922SQ201410550101
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】贾立军, 张守发, 鲁承 申请人:延边大学