一种高温酯酶、基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高温酯酶、基因及其应用，从海洋嗜热菌Geobacillussp.JM6中克隆得到新的酯酶基因，并在E.coli中进行表达和纯化，得到重组酯酶；酶学性质研究表明，酶的最适反应温度和pH分别为60℃和7.5；在100℃条件下处理18h，酶能保持68%活力；37℃条件下，酶在pH5.0~12.0的缓冲液中处理1h，酶仍能保留60%以上的活力；苯甲基磺酰氟（PMSF）可抑制重组酯酶的活性，表明该酶含有在催化机制中有重要作用的丝氨酸残基；重组酶对测试使用的洗涤剂、变性剂和有机溶剂都具有较好的耐受性。该重组酯酶具有优良的酶学性质，同时本发明也成功地构建了含上述新型酯酶基因的重组载体，实现了异源表达，为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。
【专利说明】-种高温酯酶、基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和酶工程的【技术领域】，尤其涉及一种高温酯酶、基因及其应 用。
【背景技术】
[0002] 酯酶广义上是指具有催化水解酯键能力的一类水解酶的统称，其主要分成两类： 羧酸酯酶（EC 3. I. I. 1)和脂肪酶（EC 3. I. 1. 3)，而通常所说的酯酶往往指羧酸酯酶，主要 用来催化水解脂肪酸族及芳香族酯类的化合物。一般来说，脂肪酶催化水不溶性、长链酰基 甘油酯（酰基链碳原子数大于10)的水解及合成，而羧酸酯酶对水溶性、短链酰基甘油酯 (酰基链碳原子数小于10)的活力较强。作为一种重要的工业酶类，酯酶可以催化酯水解、 酯合成、酯交换等具有重要应用价值的反应，并具有良好的区域选择性和立体选择性，广泛 应用于医药、化工、食品、能源及环境保护等领域。
[0003] 酯酶普遍存在于动物、植物和微生物中。由于动植物来源有限，生产成本高，使得 其来源的酯酶的应用受到了很大程度的限制。微生物酯酶进行的催化反应具有反应条件温 和、反应介质的选择性大、不需辅酶、便于生产和获得高纯度制剂等优点。
[0004] 来自嗜热微生物的酶具有高的热稳定性，而且对有机溶剂和多种变性环境有抗 性，在工业上有很大的应用潜能。由于嗜热微生物培养条件一般比较苛刻，有些甚至在实验 室中难以培养，可以通过基因工程技术，将热稳定酶基因在中温型微生物（例如E. coli)中 高效表达，生产大量的热稳定酶。嗜热微生物酯酶由于具有对高温和有机溶剂的稳定性而 备受关注，这些酶也可以用于蛋白质热稳定性的分子机制研究。
[0005] 有鉴于此，本发明人研究和设计了一种高温酯酶、基因及其应用，本案由此产生。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种高温酯酶、基因及其应用，该酯酶可用于短链酰基甘 油酯降解及其他酯类化合物的生物催化转化。
[0007] 为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
[0008] -种编码酯酶EstJM6的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。基因大小为 750bp〇
[0009] -种酯酶蛋白EstJM6,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。该蛋白编码249个 氨基酸残基，将该氨基酸序列在GenBank中利用BLAST进行相似性搜索，发现它与来自 Geobacillus sp. GHHOl (GenBank收录号为YP 007402135)的热稳定单酰甘油脂肪酶的相 似度高达98%。结构预测显不，Ser97、Aspl96和His226构成了 Geobacillus sp.JM6酯酶 的催化三联体。
[0010] 一种酯酶表达载体，含有所述的酯酶EstJM6基因的表达载体pET-28a-est。
[0011] 一种重组酯酶的制备方法，包括采用所述的酯酶表达载体转化寄主细胞，培养转 化体，从培养物中获得重组酯酶。当然，也可将酯酶EstJM6基因转染到合适的真核生物宿 主中，包括酵母及哺乳动物细胞等。
[0012] 作为实施例的优选方式，所述的寄主细胞为大肠杆菌。
[0013] 作为实施例的优选方式，包括采用所述的酯酶表达载体转化至寄主细胞大肠杆菌 BL21 (DE3)，经IPTG诱导，得到可溶性表达的重组酯酶。
[0014] 作为实施例的优选方式，所述的IPTG终浓度为0. 25mmol/L，诱导温度为37°C。
[0015] 一种重组酯酶，包括采用所述的酯酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养 物中获得重组酶。
[0016] 作为实施例的优选方式，在100°C条件下处理18h，酶能保持68%活性；37°C条件 下，酶在pH 5. 0?12. 0的缓冲液中处理lh，酶仍能保留60%以上的活性
[0017] 通过酯酶活力测定，本次发明的酯酶EstJM6或者表达酯酶基因的宿主菌可用于 水解短链脂肪酸酯，例如对硝基苯乙酸酯和对硝基苯丁酸酯，其中底物为对硝基苯乙酸酯 时，酶的催化活性最高。
[0018] 该酯酶为一种热稳定酯酶，催化水解的温度范围为20?90°C，最适温度为60°C ; 所述的水解pH范围为6. 0?9. 0,最适pH为7. 5。在60?100°C条件下处理18h，酶蛋白 仍可保持60%以上的相对活力。在pH5.0?12. 0条件下处理lh，酶蛋白仍可保持60%以 上的相对活力。苯甲基磺酰氟（PMSF)可抑制重组酶的活性，表明该酶含有在催化机制中有 重要作用的丝氨酸残基。重组酶对测试使用的洗涤剂、变性剂和有机溶剂都具有较好的耐 受性。
[0019] 本发明从海洋嗜热菌JM6中克隆获得了新的热稳定酯酶基因，发现了该基因编码 的酶蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化解酯的生产过程。同时，本次发明也克隆得到 了可以大量表达的工程菌，可实现该酯酶的规模化生产，为后续的工业化应用提供了良好 的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为酯酶EstJM6的诱导表达及其纯化检测的SDS-PAGE图。其中，M :分子量标 准蛋白；1 :含ρΕΤ-28 α⑴阴性菌，IPTG诱导；2 :含pET-28 a-est阳性菌，未诱导；3 :含 pET-28 a -est阳性菌，IPTG诱导；4 :纯化后的重组蛋白；
[0021] 图2为酯酶Est JM6的最适反应温度曲线图；
[0022] 图3为酯酶Est JM6的最适反应pH曲线图；
[0023] 图4为酯酶Est JM6的热稳定性曲线图；
[0024] 图5为酯酶Est JM6的pH稳定性曲线图。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1:酯酶基因的获取
[0026] 利用细菌基因组提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）提取嗜热菌 Geobacillus Sp.JM6的基因组，利用酯酶基因简并引物，扩增酯酶基因：
[0027] 上游引物（SEQ ID NO. 3) :5，-ATGARWGAACRATATCC-3' ；
[0028] 下游引物（SEQ ID NO. 4) :5' -TCMRGCRTGYTTGGCGA-3，；
[0029] PCR 反应条件为：95 °C 5min ;94 °C lmin，46 °C 45sec，72 °C，lmin30 个循环； 72°C lOmin。PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳检测后，割胶回收目的基因，产物与T载体进行 常规连接，采用CaCl2转化法转化至E. coli DH5a细胞中。从氨苄青霉素筛选平板挑取单 菌落进行菌落PCR鉴定含酯酶基因的重组质粒，提取PCR阳性菌落的质粒进行测序，分析插 入序列，获得长度为750bp的酯酶基因的开放阅读框序列。
[0030] 实施例2 :酯酶基因的重组表达质粒与重组菌株的构建
[0031] 将本发明获得的酯酶基因克隆到表达载体上，构建重组表达质粒。利用扩增酯酶 全基因的特异性引物，扩增基因全长序列：
[0032] 上游引物（SEQ ID NO. 5) :5，-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3，，
[0033] 下游引物（SEQ ID NO. 6) :5，-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3' ；
[0034] PCR 反应条件为：95 °C 5min ;94 °C lmin，55 °C 45sec，72 °C，lmin30 个循环； 72°C lOmin。采用酶切克隆的方法构建重组表达质粒，即用BamHI和HindIII双酶切PCR 产物，割胶回收酶切后的片段与同样经BamHI和HindIII双酶切的质粒pET-28a(+)进行连 接，采用CaC12转化法转化至E. coli DH5ci中。从卡那霉素筛选平板挑取单菌落进行菌落 PCR鉴定含酯酶基因 est的重组质粒，提取PCR阳性菌落的质粒进行测序，验证插入序列。 将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株中，构建重组酯酶表达菌株。
[0035] 实施例3 :利用重组表达菌株表达和纯化重组酯酶
[0036] 重组表达菌株过夜培养后，按体积比I :100转接到200mL LB液体培养基（含 50mg/mL卡那霉素）中，37°C、180r/min培养至OD6tltl达到0· 6,加入终浓度为0· 25mmol/ L IPTG，37°C、180r/min 培养 6h。离心收集菌体，重悬于 Buffer A(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L氯化钠，15mmol/L咪唑，pH 8. 0)中，在冰上进行超声波破碎处理。4°C下离心， 收集上清，然后进行Ni-NTA亲和层析，经过洗涤缓冲液（50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L氯化 钠，30mmol/L咪唑，pH 8. 0)洗涤后，利用洗脱缓冲液（50mmol/L NaH2P04,300mmol/L氯化 钠，250mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱，收集洗脱液。经SDS-PAGE检测，纯化后的重组酯酶蛋白 的分子量为32. 8kDa，结果如图1所示。用Bradford法测定蛋白质浓度，得到浓度约I. Omg/ mL的重组酯酶EstJM6。
[0037] 实施例4 :重组酯酶的活性检测
[0038] 采用对硝基苯酚丁酸酯法测定酯酶的活力。具体操作：将对硝基苯酚丁酸酯用乙 腈稀释到l〇〇mm〇l/L，将乙腈（包含底物）/异丙醇/50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH7. 5)按 1:4:95配制底物溶液，保证对硝基苯酚丁酸酯终浓度为lmmol/L ;加入3μ L的稀释后的酶 液（1:3稀释），60°C下温育15min后，测定反应溶液在405nm的吸光值。
[0039] 实施例5 :酯酶EstJM6最适反应条件的研究
[0040] 酯酶最适反应温度在20?90°C的范围内测定。具体操作：采取前文所用的体系， 分别在20、30、40、50、60、70、80和90°C条件下反应15min，测定405nm的吸光值。测定结果 表明：酯酶EstJM6的最适反应温度为60°C，在90°C仍然具有约40%的相对活力，结果如图 2所示。
[0041] 酯酶的最适反应pH在4.0?12.0的范围内测定。测定使用的缓冲液为：50mmol/ L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4. 0?6. 0)，50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH6. 0?7. 5)，50mmol/L Tris-HCl 缓冲液（ρΗ7· 5 ?9. 0)，50mmol/L 甘氛酸-氧氧化纳（ρΗ9· 0 ?11. 0)和 50mmol/ L磷酸二氢钠-氢氧化钠（pHll. 0?12. 0)。测定结果表明：酯酶EstJM6的最适反应pH为 7. 5,在pH范围6. O?9. O范围内都具有活性，结果如图3所示。
[0042] 实施例6 :酯酶Est JM6的酶学稳定性分析
[0043] 酯酶的热稳定性在60?100°C范围内进行测定。具体操作为：将纯化后的酶液分 别保温在60、70、80、90和1001：下，每隔21 1取出部分酶液，进行酶活测定。测定结果表明： 酯酶Est JM6具有极好的热稳定性，即使经过KKTC处理18h，仍可保留68 %的相对活力，结 果如图4所示。
[0044] 酯酶的pH稳定性在4. 0?12. 0范围内进行测定。具体操作为：将酶置于不同pH 值的缓冲液中，37°C温育Ih后，进行酶活力测定。测定结果显示：酯酶EstJM6具有较好的 pH稳定性，在pH5. 0?12. 0条件下处理lh，酶蛋白仍可保持60%以上相对活力，结果如图 5所示。
[0045] 金属离子对酯酶活性的影响的测定具体操作为：将酶液加入含有lmmol/L或 lOmmol/L 金属离子（Na+、K+、Li2+、Ni2+、Ca2+、Mg2+、Ba 2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Co 2+、Hg2+、Al3+ 和Fe3+)的底物溶液中，60°C下温浴15min，测定酶的活力。测定结果，如表I所示：lmmol/L 的Li+、Ca2+和Mn2+，lmmol/L和lOmmol/L的Mg2+对酯酶EstJM6活性基本没有影响；其它的 测试均为负影响，高浓度（lOmmol/L)的Hg 2+和Al3+的抑制效应尤为明显。
[0046] 表1金属离子对酯酶活性的影响
【权利要求】
1. 一种编码酯酶EstJM6的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -种酯酶蛋白EstJM6,其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -种酯酶表达载体，其特征在于：含有权利要求1所述的酯酶EstJM6基因的表达载 体 pET_28a_est。
4. 一种重组酯酶的制备方法，其特征在于：包括采用权利要求3所述的酯酶表达载体 转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酯酶。
5. 根据权利要求4所述的一种重组酯酶的制备方法，其特征在于：所述的寄主细胞为 大肠杆菌。
6. 根据权利要求5所述的一种重组酯酶的制备方法，其特征在于：包括采用所述的酯 酶表达载体转化至寄主细胞大肠杆菌BL21 (DE3)，经IPTG诱导，得到可溶性表达的重组酯 酶。
7. 根据权利要求6所述的一种重组酯酶的制备方法，其特征在于：所述的IPTG终浓度 为0. 25 mmol/L，诱导温度为37°C。
8. -种重组酯酶，其特征在于：包括采用权利要求3所述的酯酶表达载体转化寄主细 胞，培养转化体，从培养物中获得重组酶。
9. 根据权利要求8所述的一种重组酯酶，其特征在于：在10(TC条件下处理18 h，酶能 保持68%活性；37°C条件下，酶在pH 5. (T12. 0的缓冲液中处理1 h，酶仍能保留60%以上 的活性。
【文档编号】C12N15/70GK104388403SQ201410549641
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】朱艳冰, 倪辉, 刘韩, 蔡慧农, 肖安风, 杜希萍, 李利君 申请人:集美大学