一种通过微生物催化乳酸合成己酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种通过微生物催化乳酸合成己酸的方法，该方法通过利用特定的功能菌群将培养液或废水中含有的乳酸生物合成己酸，所述方法以乳酸为电子供体生产己酸较以乙醇为电子供体生产己酸效率提高效率20％以上，且本发明所述己酸功能菌对代谢产物(己酸)的毒性耐受浓度较已报道的产己酸菌提高2倍以上，具有转化效率高、抗逆性强的特点。以乳酸这种易得的非燃料物质转化为己酸，转化效率高，具有工业实用性。
【专利说明】一种通过微生物催化乳酸合成己酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境生物工程与发酵【技术领域】，具体涉及一种生产己酸的方法，特别是通过微生物催化乳酸合成己酸的方法。
技术背景
[0002]己酸匕-⑶即此仏)为含有六个碳原子的中链脂肪酸((^-00?)，疏水性强，能量密度高，是一种重要的化工原料，可直接用于动物饲料、绿色抗菌剂和缓蚀剂生产。其酯类产品广泛应用于食品香料、树脂、橡胶、制药等工业。此外，己酸是生物燃料的合成前体，可以通过有机化学的方法间接转化为生物柴油或喷气燃料。
[0003]已酸的生产方法可分为化学合成、天然产物(如椰子油等)提取和微生物催化三种。己酸的商业化生产主要是基于石油为原料的化学合成。受石油资源日益短缺和环保要求不断提高的影响，这一方法将遇到挑战；此外，随着己酸及其衍生物应用领域的扩大，石油来源的己酸产品的应用受到了越来越多的限制，特别是在食品和医药等健康领域。天然产物提取的己酸更加健康和安全，但是却受到原料、地域等诸多因素的限制，因而难以推广。相比于前两种方法，微生物催化合成己酸，采用的是安全的可再生资源作为原料，其产品也不存在应用领域的限制，生产过程也不受原料来源等地域限制，因而具有更好的价值和可持续发展的工业化潜力。
[0004]微生物催化产己酸是一个碳链延长过程，即微生物通过13氧化的逆反应途径对短链脂肪酸进行碳链延长，合成中链脂肪酸(仏一(^)。自然界中只有极少数微生物具有碳链延长功能，主要为梭菌属和真杆菌属)的一些种。研究最多和最为深入的是克氏梭菌“八^一!'丨)，该菌通过乙醇氧化和逆13氧化途径的结合，以乙醇为电子供体，乙酸为电子受体合成己酸(1116 8711^6818 0？011&II(1 08^010 ^01(18 ？1~0111311(1 ^061:10 ^01(1 67 01081^1(1111111
？1~00耐1 ^08(1 801 口 3八.1945060 ；31 (12): 373 - 381.)。其代谢过程可概括为三个偶联反应，乙醇氧化为乙酸，乙酸与乙醇结合形成丁酸，最后丁酸与乙醇结合形成己酸。虽然微生物催化生产己酸是一种清洁能源技术，但是却存在两个重要的限制因素:
[0005]1、底物单一化，选择性差。现在已报道的最为合适的底物(电子供体)是乙醇，在合成过程中需要外加乙醇，因而适用范围有限，并且增加了合成成本。氢气理论上也可以作为电子供体，但是由于氢气的安全性以及低溶解度不利于己酸合成，并且氢气本身价格较高，所以此类研究甚少；虽然也有少数的细菌，如618(161111181和(:108廿丨也皿邓.83-1，可以通过葡萄糖或者半乳糖醇的发酵合成己酸，但是由于细菌发酵产物复杂以及代谢途径未知而不具备工业化应用的前景(16111161 &10611
6.011811^1^8^1^6 811817515 0？尽!'0界七匕 3,11(1 乂〇1&七 1163,01(1 ^1*0(1110^1011 67
七 116 811861*01310 1*1111111181 1380^61*111111 16^85^) 11861*8 615(161111 丁81.八口口1 1101*013101
010^60111101.2013, 97: 4075 - 4081^00111(1111&^01111^50011
1)111&8701111^-1110？ 116X811010 3,01(1 ^1*0111 1)-^8180^1^01 67 & 116 界 1丫1801^1:6(1 01081:1-1(1111111 邓.83-1 八卯 1 1101~013101 0101:60111101.2010, 88: 1161 - 1167) 0
[0006]2、终产物的抑制效应使己酸浓度的提高存在困难。由于己酸对微生物具有较大的毒性，浓度较高时会抑制微生物的生长和活性。尤其是当环境邱接近或者低于己酸的解离常数(1)1(3 = 4.8)时，溶液中未解离己酸及其生物毒性会大幅提高。由于己酸的抑制作用，在合成过程中己酸浓度达到一定水平(已报道的最高浓度为12.6^/1)就难以继续提高。这就增加了后期的提取成本，不利于微生物催化合成己酸技术的工业化应用。
[0007]3、厌氧产甲烷会造成底物分流和降低氢分压，使产己酸效率下降。加入抑制剂可抑制甲烷产生，但价格昂贵，不适于工业化应用。
[0008]乳酸是淀粉质发酵的主要产品之一。目前利用微生物发酵生产乳酸的工业技术已比较成熟，已实现了大规模工业化乳酸生产。今后更为廉价的植物纤维水解物等有可能作为生产乳酸的新原料，有望使其生物成本进一步降低。研究显示微生物可催化乳酸合成丁酸￡, ￡11:6111811 嫩.811(1 狀!'118111137 11861'& 618(161111 1111(161- 1381x11 811(1 81:68(178^^^60011(111:10118.1101-0)3101 2012，78:8564-8570 ；1111102-丁8脑70 I？； 1&1-00116 8,￡, 61: &1.1(11161:101110(1611111? 0？ 1^01:81:6 111:111281:1011 811 (1)31^6 ￠1^0(11101:1011 1^7 垃 67 1111111^11 0010111013801:61-181 8^60168.110^013101 2011，76:615-624)，表明乳酸可为碳链延长提供电子供体。但是，还未见利用乳酸合成己酸的相关文献和专利报道。
[0009]基于化学合成法原料的日益稀缺和产品限制，以及生物来源的己酸所具有的优势，有必要发展利用可再生能源生产己酸的方法，来补充或替代现有化学合成方法。此外，本发明的微生物法还可利用发酵废水中的废弃有机酸(如乳酸、乙酸和丁酸)生产己酸，从而实现废水的资源化，具有较大的发展潜力。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种微生物催化乳酸合成己酸的方法。本发明所涉及的方法是以乳酸为电子供体，通过己酸功能菌群在厌氧条件下，乙酸或者丁酸为电子受体，通过碳链延长合成己酸。
[0011]为实现上述目的，本发明采取了如下技术方案:
[0012]一种通过微生物催化乳酸合成己酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:
[0013]步骤一、将己酸功能菌群接种到含有液体培养基的厌氧发酵瓶中，25-351厌氧培养3-5(1，得到006。。为3-5的菌悬液；
[0014]步骤二、将上述菌悬液转入含乳酸的培养液或废水的厌氧反应器中，保持反应器温度在25-351，使菌体吸附到固定化膜填料中，直至反应器中菌悬液006。。值不再下降；
[0015]步骤三、向步骤二的厌氧反应器中加入约15% -25%的含乳酸的培养液或废水，25-351厌氧培养，通过版10?和此1控制反应器邱在5.5-5.8 ；乳酸耗尽后，再以约15% -25%的新鲜培养液/废水替换，采用批次添加方式重复以上操作，直至己酸浓度?15吕凡；
[0016]步骤四、待己酸浓度?158凡稳定5-7(1后，改为连续方式泵入培养液或废水，维持乳酸浓度在3-208/1，通过连续发酵的方式，将乳酸转化为己酸，得到含己酸的发酵液；
[0017]步骤五、提取发酵液中的己酸；
[0018]上述步骤一至四中所述的培养基为:5.0-25^乳酸，18酪蛋白胨，0.25-知酵母粉，0.4砂通⑶3,0.1邑半胱氨酸，0.045^2^04,0.045^^04,0.09^01,0.009^50,7^0,
0.009^ 08012？ 0.1呢刃天青，氯化血红素，1呢生物素，1呢维生素812，3呢对氨基苯甲酸，5呢叶酸和15呢维生素86，10001111蒸懼水；
[0019]所述己酸功能菌群包括如下三个优势种群IV，其丰度为40-55% ；01081^1(1111111 其丰度为 15-40% ；以及其丰度为 8-20%。
[0020]所述己酸功能菌群包括如下二个优势种群IV，其丰度为55-65% ；01081:1-1(1111111 8611811 81:1~101:035~45%
[0021]优选地，所述己酸功能菌群包括丰度为65%的(:108廿1(1111111 IV和丰度为35%的01081:1-1(1111111 8611811 81:11(31:0。
[0022]具体地，01081:1-1(1111111IV 种群可以为 01081^1(1111111 16^1:11111 或 01081^1(11111118^)01-0 81)11861-01(16 8 8611811 81:1~101:0 |中群可以为 01081^1(1111111
1311010 81:1-1(11111111010 81:1-1(1111111 垃 1117乂61~1，010 81:1-1(1111111
81301*0861168，其中每个种群的微生物可是所述的一种微生物或几种微生物的任一比例组成。
[0023]上述步骤二中的厌氧反应器为上流式厌氧反应器。
[0024]除非另有说明，本发明中的“ ％ ”均为重量百分比。
[0025]本发明的有益效果在于:
[0026]1、本方法以乳酸电子供体生产己酸，增加了生物法发酵生产己酸的底物选择性；
[0027]2、通过生物发酵获得乳酸的方法和工艺比较成熟，以乳酸这种易得的非燃料物质转化为己酸，有望替代现有的化学合成方法。
[0028]3、通过本方法既可以乳酸为原料直接生产食品级的己酸及其衍生酯类(如己酸乙酯)，作为食品添加剂，也可以用于废水资源化处理生产己酸，作为进一步合成生物柴油前体原料。
[0029]4、以乳酸为底物的微生物菌群对己酸的耐受浓度(25.68/1)比已报道的以克氏梭菌为主的微生物菌群的耐受浓度(12.68/1)提高了 2倍以上。
[0030]5、控制邱5.5-5.8，己酸功能菌活性不受影响，而反应过程中甲烷气体浓度始终低于1 %，因此可以不添加甲烷抑制剂，可降低运行成本，同时避免甲烷菌与己酸菌竞争有机底物，提高底物利用率。
[0031]本方法适用范围广泛，除了可以直接用乳酸合成食品及医用级己酸外，还能利用含乳酸的发酵工业废水、废弃物合成己酸；此外，利用本方法还可以对其他发酵工业废水中含有的乙酸和丁酸进行碳链延长(补充乳酸)生成己酸。因此，通过本方法可实现废水、废弃物的资源化利用。
【专利附图】
【附图说明】
:
[0032]图1:本发明微生物催化乳酸合成己酸的工艺流程图。
[0033]附图标记:1、储液罐，2、上流式厌氧反应器，3、菌液分离罐，4、酸液罐取剂储罐，6、膜填料，7、活性碳填料，8、萃取装置，9、反萃取装置，10、反萃取剂接收罐。
【具体实施方式】
[0034]下面通过实施例对本发明进行阐述。
[0035]实施例1己酸功能菌群的培养
[0036]将培养基煮沸后分装在2501111的厌氧瓶中，通入氮气直至培养基颜色由蓝变淡红色直无色，12高温灭菌150111，冷却。按5%比例接种己酸菌群。25-351厌氧培养3-5(1，菌体密度00600达到3-5菌悬液，备用。
[0037]培养基成分如下:1.08乳酸，酪蛋白胨，0.酵母粉，0.5^01,0.48 髓⑶3，0.18 半胱氨酸，0.045邑旧？04，0.045^ 狃2？04，0.098 就1，0.009^1妨047！！20，0.009^ 08012? 0.1呢刃天青，1呢氯化血红素，1呢生物素，1呢维生素812，3呢对氨基苯甲酸，5呢叶酸和15呢维生素86，1001111蒸懼水。
[0038]己酸功能菌群包括丰度为65% 的 01081^1(1111111 81)01-081)11861-01(168,丰度为 35%
0105^1*1(1111111 七
[0039]实施例2微生物批次发酵乳酸生产己酸
[0040]将含508/1乳酸的培养液装入发酵罐，1211灭菌冷却后通过氮气，使培养基氧化还原电位降到-50！^以下，接入5-8%种子菌液，再次通过氮气使培养基氧化还原电位降到-50^以下，控制温度25-35。。，邱5.5-5.8.，100转/111111搅拌培养10-12(1，己酸浓度达208/1以上。该己酸发酵液经蒸馏、精馏等常规提取工艺获得高纯度食品级己酸。
[0041]实施例3微生物连续发酵乳酸或含乳酸废水生产己酸及其在线分离与提纯
[0042]1、微生物的固定化
[0043]将种子液转入含乳酸培养液的上流式厌氧反应器(附图1)中，通入氮气/ 二氧化碳(9:1)混合气体，保持反应器温度在25-351，使菌体吸附到固定化膜填料，直至反应器中菌悬液浓度不再下降；
[0044]2、利用乳酸废水连续发酵生产己酸
[0045](1)向反应器中泵入含108/1的乳酸(或含乳酸废水)，控制册1:5(1,25-351厌氧培养，邱:5.5-5.8，维持进水负荷28乳酸/1.山运行10(1 ；
[0046](2)控制册！':2.5(1，其他条件不变，进水负荷为知乳酸/1.山运行10(1 ；
[0047](3)控制勝:1.5(1，其他条件不变，进水负荷为6.78乳酸/1.山运行10(1 ；
[0048](4)正式运行，控制:1(1，维持乳酸负荷为10.0^/1.山通过连续发酵的方式，将乳酸转化为己酸，得到含己酸的发酵液。反应器连续运行15(1后，生产效率达5.(1).
[0049]3、己酸的在线分离
[0050]含己酸的发酵液经菌液分离装置进行菌液分离，菌体经管路回到发酵罐中，含己酸的液体由中空纤维膜的中空内管进入萃取装置进行萃取。萃取剂为含10% ^181111116336的油醇，萃取后液体经管路回到发酵罐。
[0051]4、己酸的提取
[0052]含己酸的萃取剂从萃取装置中经由另一中空纤维膜空管进行反萃取，以5^氢氧化钠由中空纤维膜外侧进入并按相反方向流动，使己酸从萃取剂中进入氢氧化钠溶液中。萃取剂回到上一中空纤维膜装置继续萃取，含己酸的氢氧化钠溶液进入反萃取剂接收罐，当罐中己酸浓度接收饱和时，将液体导入盐析罐，在盐析罐中加入盐酸进行盐析，上层析出的即为己酸。
[0053]实施例4利用乳酸合成己酸的转化效率
[0054]在实施例3所述反应器及微生物稳定条件下，以乳酸为唯一的碳源和电子供体，采用间歇补料进样，控制温度301，邱:5.5-5.8，乳酸负荷为3.78/1/山运行15天，计算乳酸转化效率。结果表明，己酸积累浓度为20.68/1，乳酸的转化率为93.1%，己酸是主要的产物，占90.4%。
[0055]本发明的一种通过微生物催化乳酸合成己酸的方法已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本
【发明内容】
，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。
【权利要求】
1.一种通过微生物催化乳酸合成己酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 步骤一、将己酸功能菌群接种到含有液体培养基的厌氧发酵瓶中，25-35°C厌氧培养3-5d，得到OD6tltl为3-5的菌悬液； 步骤二、将上述菌悬液转入含乳酸的培养液或废水的厌氧反应器中，保持反应器温度在25-35°C，使菌体吸附到固定化膜填料中，直至反应器中菌悬液OD6tltl值不再下降； 步骤三、向步骤二的厌氧反应器中加入15% -25%的含乳酸的培养液或废水，25-35°C厌氧培养，通过NaOH和HCl控制反应器pH在5.5-5.8 ;乳酸耗尽后，再以15% -25%的新鲜培养液/废水替换，采用批次添加方式重复以上操作，直至己酸浓度>15g/L ； 步骤四、待己酸浓度>15g/L稳定5-7d后，改为连续方式泵入培养液或废水，维持乳酸浓度在3-20g/L，通过连续发酵的方式，将乳酸转化为己酸，得到含己酸的发酵液； 步骤五、提取发酵液中的己酸； 上述步骤一至四中所述的培养基为:5.0-25g乳酸，Ig酪蛋白胨，0.25-4g酵母粉，0.4gNaHC03，0.1g 半胱氨酸，0.045gK2HP04，0.045gKH2P04，0.09gNaCl，0.009gMgS047H20，0.009g CaCl2,0.1mg刃天青，Img氯化血红素，Img生物素，Img维生素B12, 3mg对氨基苯甲酸,5mg叶酸和15mg维生素B6, 100ml蒸懼水； 所述己酸功能菌群包括如下二个优势种群=Clostridium IV，其丰度为55-65 % ；Clostridium 其丰度为 35-45%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，ClostridiumIV种群为Clostridium Ieptum 或 Clostridium sporosphaeroides ；Clostridium sensustricto 种群为 Clostridium butyricum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridiumkluyveri, Clostridium sporogenes ;其中每个种群的微生物是所述的一种微生物或几种微生物的任一比例组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述己酸功能菌群包括丰度为65%的Clostridium IV 种群，丰度为 35% 的 Clostridium sensu stricto 种群。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤二中的厌氧反应器为上流式厌氧反应器。
【文档编号】C12R1/145GK104357496SQ201410593446
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】陶勇, 朱晓宇, 何晓红, 李大平 申请人:中国科学院成都生物研究所